牛澤家馨 ,杜鳴飛 ,胡桂霖 ,張 璽 ,王 丹 ,王 蘭 ,羅文婧,常鳴珂,鄒 婷,張曉玉,嚴(yán) 瑜,褚 超,廖月圓,馬 瓊,王科科,賈 昊,陳 晨,孫 月,郭統(tǒng)帥,張 婕,高衛(wèi)華,滿子悅,高 可,牟建軍,汪 洋,6

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科,陜西西安 710061;2.西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院心內(nèi)科,陜西西安 710100;3.西北婦女兒童醫(yī)院心內(nèi)科,陜西西安 710003;4.西安市人民醫(yī)院心內(nèi)科,陜西西安 710004;5.西安市第一醫(yī)院心內(nèi)科,陜西西安 710002;6.西安交通大學(xué)全球健康研究院,陜西西安 710061)

高血壓是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素,可造成心肌梗死、心力衰竭、腦卒中、慢性腎臟病等嚴(yán)重并發(fā)癥,是危害全球人類健康的重要公共問(wèn)題之一[1]。目前研究認(rèn)為,高血壓的發(fā)生發(fā)展受遺傳和環(huán)境因素的相互作用[2-3]。環(huán)境因素中鈉攝入過(guò)多與鉀攝入量不足是促進(jìn)高血壓發(fā)生的重要環(huán)境因素[4-5],同時(shí),大量證據(jù)顯示不同個(gè)體的血壓對(duì)飲食中鈉鉀攝入的反應(yīng)性存在顯著差異[6-7],這表明個(gè)體因遺傳背景的不同,其血壓對(duì)于鈉敏感性及鉀敏感性不盡相同。因此,探索影響血壓的鈉鉀敏感性的遺傳變異有助于闡釋血壓調(diào)節(jié)機(jī)制并為高血壓防治提供新思路。

神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)的4 樣蛋白(NEDD4L)是一種E3泛素蛋白連接酶,參與底物識(shí)別及泛素化[8-9]。NEDD4L 在機(jī)體鈉穩(wěn)態(tài)及血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,其WW 功能域與腎小管上皮的鈉通道蛋白(ENaC)亞基的PY 功能域相互作用可致泛素化進(jìn)而被內(nèi)吞降解,從而減少腎臟對(duì)鈉的重吸收,有效防止水鈉潴留,避免血壓升高[10]。在人群中的一種特殊高血壓類型—Liddle綜合征,就是一個(gè)重要證據(jù),該種疾病是由于ENaC 突變后無(wú)法被NEDD4L泛素化而內(nèi)吞,導(dǎo)致鈉重吸收增多,血壓升高,說(shuō)明NEDD4L 在血壓及鈉的調(diào)節(jié)中起重要作用[11]。NEDD4L基因位于人類染色體18q21,該基因位點(diǎn)區(qū)域是調(diào)控原發(fā)性高血壓、家族性體位性低血壓、體位變化導(dǎo)致的收縮壓變化等的重要基因定位區(qū)[12]。另外,不少研究表明,NEDD4L rs4149601 G等位基因攜帶者比A 等位基因攜帶者的ENaC 表達(dá)更多且鈉重吸收明顯增加,并且攜帶至少1 個(gè)rs2288774的C等位基因的受試者血壓水平更高[13],上述研究提示NEDD4L基因與血壓水平調(diào)節(jié)密切相關(guān)。然而關(guān)于人群中NEDD4L的基因多態(tài)性與血壓的鈉鉀反應(yīng)性的關(guān)系尚未見報(bào)道。因此,本研究基于既往在陜西建立的“鹽敏感高血壓研究隊(duì)列”,通過(guò)對(duì)人群進(jìn)行飲食鈉鉀干預(yù),探討NEDD4L 基因多態(tài)性與血壓鈉鉀反應(yīng)性的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

于2003年10月-2004年10月在陜西寶雞市眉縣多個(gè)農(nóng)村漢族人群中招募來(lái)自124個(gè)家系的514名受試者,建立了“鹽敏感性高血壓研究隊(duì)列”。受試者年齡為18～60歲、收縮壓 在130～160 mm Hg(1 mm Hg=0.133 k Pa)和(或)舒張壓在85～100 mm Hg 范圍內(nèi),具體納入及排除方法已在本課題組以往相關(guān)文獻(xiàn)中詳細(xì)報(bào)道[14-15]。本研究已通過(guò)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批,受試者均知曉研究?jī)?nèi)容并簽署知情同意書。

1.2 基線調(diào)查及飲食干預(yù)

對(duì)入組的333名除先證者父母外的受試者進(jìn)行慢性鹽負(fù)荷及補(bǔ)鉀干預(yù)試驗(yàn)[14-15],具體流程分為四個(gè)階段:3 d基線調(diào)查期、7 d低鹽飲食期(每天3 g氯化鈉或51.3 mmol鈉)、7 d高鹽飲食期(每天18 g氯化鈉或307.8 mmol鈉)和7 d高鹽補(bǔ)鉀期(每天在高鹽飲食基礎(chǔ)上再加60 mmol鉀或4.5 g氯化鉀)。基線期調(diào)查問(wèn)卷主要包括年齡、性別、身高、體重、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、腹圍、收縮壓、舒張壓等基本資料。

1.3 血壓測(cè)量

采用隨機(jī)零點(diǎn)血壓計(jì)(Hawksley&Sons,英國(guó))分別于固定時(shí)間測(cè)量血壓,即在基線期和鈉鉀干預(yù)期的第5、6、7天按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量血壓,每次重復(fù)測(cè)量血壓3次,采用9次血壓的平均值進(jìn)行最終統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算公式為:平均動(dòng)脈壓=舒張壓+1/3(收縮壓-舒張壓),脈壓差=收縮壓-舒張壓。本研究中將血壓對(duì)鈉鉀的反應(yīng)性當(dāng)作連續(xù)性變量,計(jì)算公式為:低鹽期血壓反應(yīng)性=低鹽期血壓-基線期血壓;高鹽期血壓反應(yīng)性=高鹽期血壓-低鹽期血壓;補(bǔ)鉀期血壓反應(yīng)性=高鹽補(bǔ)鉀期血壓-高鹽期血壓。

1.4 血、尿標(biāo)本的收集與分析

分別于固定時(shí)間采集血尿標(biāo)本,在基線期及各干預(yù)階段的最后1 d采集受試者的外周靜脈血標(biāo)本和24 h尿標(biāo)本。于清晨采集4 mL空腹靜脈血為血標(biāo)本,離心機(jī)的半徑為16 cm,轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min,將分離的血清標(biāo)本存放在-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆脵z測(cè)。24 h 尿液標(biāo)本采集全天尿液并測(cè)量記錄尿量,分別吸取4 mL 尿標(biāo)本存放于2個(gè)凍存管內(nèi),存于-40℃冰箱待檢。采用Hitachi7060全自動(dòng)生化分析儀(日立,日本)檢測(cè)尿標(biāo)本中鈉、鉀濃度以及血標(biāo)本的生化指標(biāo)(包括血肌酐、甘油三脂、總膽固醇、血糖等)。計(jì)算公式為:鈉排泄量=24 h尿液總體積×尿鈉濃度;鉀排泄量=24 h尿液總體積×尿鉀濃度。

1.5 SNP位點(diǎn)選擇及基因分型

分別對(duì)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih,gov/projects/SNP)和基因組變異服務(wù)器數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gvs.gs.washington.edu/GVS147)進(jìn)行檢索,采用Haplo View 4.2 軟件(Broad Institute,Cambridge,MA,USA)在中國(guó)北京漢族(CHB)和亞洲人群數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選NEDD4L基因中的標(biāo)簽SNP 位點(diǎn)。具體篩選標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)簽SNP位點(diǎn)的頻率分布必須符合Hardy-Weinberg平衡定律(P≥0.05)、次要等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)P≥0.05,且連鎖不平衡系數(shù)r2≥0.8。最終納入了14個(gè)NEDD4L基因相關(guān)的SNP位點(diǎn),分別為:rs9956206,rs557036,rs563283,rs4940647,rs4149601,rs6566939,rs4149605,rs73450471,rs482805,rs74408486,rs292449,rs2288774,rs2288775,rs7228980。

應(yīng)用Gold Mag-Mini純化試劑盒(Gold Mag有限公司,中國(guó)),提取所采集的受試者外周靜脈血的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)。通過(guò)Mass ARRAY 檢測(cè)平臺(tái)對(duì)14 個(gè)NEDD4L 基因有關(guān)的SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型?；蚍中蛯?shí)驗(yàn)均由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,其中,連續(xù)變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,分類變量用n/%表示,運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組之間均數(shù)的比較,運(yùn)用方差分析進(jìn)行多組間均數(shù)比較,再運(yùn)用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。運(yùn)用PLINK 軟件(version 1.9)的精確檢驗(yàn)法對(duì)先證者父母的基因型進(jìn)行平衡檢驗(yàn)和孟德爾一致性檢驗(yàn),并計(jì)算各個(gè)基因型的MAF值,通過(guò)構(gòu)建不同遺傳模型(加性模型、顯性模型和隱性模型)后建立混合線性回歸模型分析NEDD4L SNPs與人群血壓鈉鉀反應(yīng)性的關(guān)系。將年齡、性別和BMI作為固定效應(yīng),家系相關(guān)性作為隨機(jī)效應(yīng)在模型中進(jìn)行校正。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者的基線特征及血壓的鈉鉀反應(yīng)性

鈉鉀飲食干預(yù)時(shí),受試者低鹽期血壓明顯較基線期下降,高鹽期血壓則較基線期顯著升高,此外,高鹽補(bǔ)鉀期血壓顯著低于高鹽期(表1)。

表1 基線特征及飲食干預(yù)期的血壓反應(yīng)性Tab.1 Baseline characteristics and BP responses to dietary intervention

續(xù)表1

2.2 受試者各時(shí)期24 h尿液鈉、鉀的反應(yīng)情況

基線期受試者的尿鈉、尿鉀排泄均呈現(xiàn)“高鈉低鉀”的現(xiàn)象,反映日常鈉攝入過(guò)多而鉀攝入不足,這一現(xiàn)象符合中國(guó)北方農(nóng)村居住者的飲食習(xí)慣。與基線期相比,低鹽期24 h尿鈉排泄量顯著降低,高鹽期則顯著升高;補(bǔ)鉀24 h尿鉀排泄量顯著升高(表2),提示受試者對(duì)膳食干預(yù)依從性良好。

表2 受試者各時(shí)期24 h尿液鈉、鉀的排泄量Tab.2 Urinary excretions of sodium and potassium in the subjects during the intervention periods

2.3 NEDD4L基因SNP位點(diǎn)的基本信息

本研究納入的SNP所在基因組位置、等位基因、MAF、Hardy-Weinberg檢驗(yàn)結(jié)果顯示,各SNP 位點(diǎn)基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(表3),表明受試者選自遺傳平衡的大眾人群,具有很強(qiáng)的代表性。

表3 NEDD4L基因各SNP位點(diǎn)的基本信息Tab.3 Characteristics of NEDD4L SNPs analyzed in this study

2.4 NEDD4L基因多態(tài)性與血壓鈉鉀反應(yīng)性的關(guān)聯(lián)性

通過(guò)對(duì)所有位點(diǎn)與血壓的鈉鉀反應(yīng)性進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),NEDD4L基因SNPs rs557036、rs563283、rs74408486、rs7228980與低鹽期收縮壓、舒張壓或平均動(dòng)脈壓反應(yīng)性顯著相關(guān)(均P＜0.05);而SNPs rs292449、rs2288775與高鹽期脈壓差反應(yīng)性顯著相關(guān);此外,rs9956206、rs563283、rs292449與高鹽補(bǔ)鉀期舒張壓、平均動(dòng)脈壓或脈壓差反應(yīng)性顯著相關(guān)(均P＜0.05,表4)。

表4 NEDD4L基因多態(tài)性與血壓鈉鉀反應(yīng)性的關(guān)聯(lián)性Tab.4 Associations of NEDD4L gene polymorphisms with blood pressure response to sodium and potassium intake

續(xù)表4

3 討 論

基于本課題組建立的陜西“鹽敏感性高血壓研究隊(duì)列”,本研究通過(guò)對(duì)受試者進(jìn)行鈉鉀膳食干預(yù),首次發(fā)現(xiàn)NEDD4L基因多個(gè)SNPs與血壓鈉鉀反應(yīng)性密切相關(guān)。其中NEDD4L基因SNPs rs74408486與低鹽期收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓反應(yīng)性顯著相關(guān);而SNPs rs292449、rs2288775 與高鹽期脈壓差反應(yīng)性顯著相關(guān)。此外rs563283、rs292449 與高鹽補(bǔ)鉀期舒張壓、平均動(dòng)脈壓及脈壓差反應(yīng)性顯著相關(guān)。以上研究提示SNPs可能作為血壓鹽敏感性和鉀敏感性的遺傳標(biāo)記點(diǎn),此研究結(jié)果能夠加深對(duì)高血壓發(fā)生發(fā)展機(jī)制的理解,并為今后高血壓的防治提供新的思路。

NEDD4家族屬于HECT 類E3泛素連接酶,可識(shí)別不同的底物蛋白,參與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[8]。其中NEDD4L 主要參與血壓的調(diào)節(jié),通過(guò)其WW 結(jié)構(gòu)域與ENaC亞基的PY 基序結(jié)合,使ENaC被泛素化及內(nèi)吞,降低腎臟ENaC 的數(shù)量及活性,從而鈉的重吸收減少、血壓降低[10]。此外,NEDD4L還通過(guò)下調(diào)Na-Cl同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(NCC)參與鹽敏感高血壓的發(fā)生[15]。NEDD4L基因由41個(gè)外顯子組成,位于染色體18q21,其基因結(jié)構(gòu)在人和小鼠體內(nèi)均非常保守,并且有研究表明NEDD4L 基因參與原發(fā)性高血壓、家族性直立性高血壓的發(fā)生[12,16]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,大鼠NEDD4L的C2結(jié)構(gòu)域與人類C2結(jié)構(gòu)域100%相同,在正?？诜}攝入量下,野生幼崽和NEDD4L C2敲除小鼠均未表現(xiàn)出任何表型差異,而在高鹽攝入量下,NEDD4L C2敲除小鼠的ENaC mRNA 表達(dá)逐步升高,尿鈉排泄減少,血壓升高,由此可見,NEDD4L C2敲除小鼠表現(xiàn)出鹽敏感性高血壓[17]。此外,基于人群的研究發(fā)現(xiàn),rs4149601(G/A)和rs2288774(T/C)是人類NEDD4L 基因中常見的功能性單核苷酸多態(tài)性,并且這兩種基因多態(tài)性與高血壓有關(guān),其主要表現(xiàn)為血壓升高,腎素水平降低,鹽敏感性隨時(shí)間推移升高,NEDD4L rs4149601 G 等位基因的攜帶者的ENaC表達(dá)和腎臟鈉重吸收較A 等位基因的攜帶者更高[18]。本研究通過(guò)對(duì)受試者進(jìn)行慢性鹽負(fù)荷干預(yù),發(fā)現(xiàn)NEDD4L基因SNPs rs292449、rs2288775 與高鹽期脈壓差反應(yīng)性顯著相關(guān),為NEDD4L 基因參與血壓鹽敏感性提供了新證據(jù),加深了對(duì)血壓鹽敏感性遺傳因素的理解。

目前研究顯示血壓與鈉攝入呈正相關(guān),與鉀攝入呈負(fù)相關(guān)[4],大量的人群隊(duì)列研究表明適量的膳食補(bǔ)鉀可降低正常健康人群及高血壓患者的血壓水平,然而仍有證據(jù)顯示補(bǔ)鉀的降壓作用存在種族差異性[19]。GENSALT[20]研究顯示,在遺傳背景相似的中國(guó)漢族人群中,補(bǔ)鉀的血壓變化受遺傳因素的影響,表明人群存在血壓的鉀敏感性。KELLY 等[21]通過(guò)對(duì)906名漢族參與者參加了7 d的高鈉飲食和7 d的高鈉加鉀飲食干預(yù),發(fā)現(xiàn)染色體區(qū)域3q24-q26.1、3q28和11q22.3-q24.3與血壓對(duì)鉀反應(yīng)的存在顯著連鎖信號(hào),表明3號(hào)和11號(hào)染色體上的遺傳區(qū)域可能具有重要的鉀敏感性位點(diǎn)。本研究首次探討了NEDD4L基因多態(tài)性與血壓對(duì)于補(bǔ)鉀后的反應(yīng)性的關(guān)系,結(jié)果表明NEDD4LSNP rs9956206、rs563283、rs292449與高鹽補(bǔ)鉀期舒張壓、平均動(dòng)脈壓或脈壓差反應(yīng)性顯著相關(guān),提示NEDD4L 基因可能參與血壓鉀敏感性的形成。目前動(dòng)物研究表明,NEDD4L 通過(guò)調(diào)節(jié)多種鉀通道蛋白參與機(jī)體的鉀穩(wěn)態(tài),ZHANG等[22]研究顯示腎小管NEDD4L缺陷小鼠中,腎臟髓外鉀通道(the renal outer medullary potassium channel,ROMK)活性減低,并且在高鉀飲食干預(yù)下仍不能刺激ROMK活性,可見NEDD4L 參與調(diào)節(jié)ROMK 活性。AL-QUSAIRI 等[23]發(fā)現(xiàn)腎小管SGK1缺失的小鼠中K+排泄減少,并且在高鉀飲食時(shí)表現(xiàn)出嚴(yán)重的高鉀血癥,同時(shí)證實(shí)NEDD4L受SGK1的調(diào)節(jié)參與機(jī)體K+排泄。以上研究均表明NEDD4L 可能通過(guò)ROMK參與血壓鉀敏感性的調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果為今后探索血壓鉀敏感性的發(fā)生機(jī)制提供新的思路,同時(shí)提示NEDD4L可能為高血壓治療的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)NEDD4L 基因多態(tài)性與血壓鈉鉀反應(yīng)性相關(guān),這有助于綜合環(huán)境及遺傳因素,進(jìn)一步明確血壓鉀敏感性的發(fā)生機(jī)制,為高血壓的靶向治療提供依據(jù)。鑒于本研究局限于中國(guó)北方人口,因此,膳食鈉鉀鹽的攝入與NEDD4L基因多態(tài)性的關(guān)系可進(jìn)一步在大型多種族人群隊(duì)列中驗(yàn)證。