王 蘭,牛澤家馨,郭艷杰,劉乃溶,姚艷妮,楊貝貝,王佳馨,李 闖,劉盼盼,楊長娥,杜鳴飛,胡桂霖,張 璽,王 丹,張曉玉,褚 超,廖月圓,馬 瓊,王科科,賈 昊,孫 月,郭統(tǒng)帥,高衛(wèi)華,牟建軍,汪 洋,5

(1.西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院心內(nèi)科,陜西西安 710100;2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科,陜西西安 710061;3.西北婦女兒童醫(yī)院心內(nèi)科,陜西西安 710003;4.西安市第一醫(yī)院心內(nèi)科,陜西西安 710002;5.西安交通大學(xué)全球健康研究院,陜西西安 710061)

高血壓可導(dǎo)致心腦血管、腎臟和周圍血管等重要靶器官的不可逆性損傷,已成為世界范圍內(nèi)最重要的單一死亡原因[1]。人體血壓受復(fù)雜生理系統(tǒng)調(diào)節(jié),同時(shí)受遺傳和環(huán)境因素的共同作用[2]。在環(huán)境因素中,飲食高鹽攝入似乎對(duì)血壓的影響是最重要的。研究表明,個(gè)體血壓變化與鈉鹽攝入量呈正相關(guān),高鹽引起血壓升高,低鹽會(huì)引起血壓下降,稱為血壓的鹽敏感性[3-4]。此外,血壓與膳食鉀攝入量呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)性,且不同個(gè)體的血壓反應(yīng)性不盡相同[5-6]。人群研究提示,血壓對(duì)鈉鉀攝入量反應(yīng)的異質(zhì)性可能取決于個(gè)體等位基因變異[7-8]。因此,遺傳變異與鹽敏感性相關(guān)的識(shí)別將增強(qiáng)我們對(duì)生物血壓調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

Corin是胰蛋白酶超家族的跨膜絲氨酸蛋白酶,它可以將心房利鈉肽前體(pro-ANP)轉(zhuǎn)化為具有生物活性的心房利鈉肽(ANP),主要在心肌細(xì)胞中表達(dá),參與高血壓、心臟肥大的病理生理過程[9]。高血壓和先兆子癇患者的家庭中也發(fā)現(xiàn)了Corin基因活性降低的突變[10]。然而,既往研究未能充分考慮該基因-環(huán)境對(duì)血壓的影響,特別是關(guān)于飲食鈉鉀攝入的影響,因此可能忽視了該基因與環(huán)境的相互作用對(duì)血壓變異的遺傳貢獻(xiàn)。有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,Corin與鹽敏感性高血壓的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[11]。WANG 等[12-13]發(fā)現(xiàn)Corin基因敲除小鼠表現(xiàn)出鈉排泄減少和ANP合成受阻,這可能是鹽敏感性高血壓的一個(gè)重要機(jī)制。因此,本研究通過對(duì)既往建立的高血壓隊(duì)列進(jìn)行慢性鹽負(fù)荷及補(bǔ)鉀干預(yù)實(shí)驗(yàn),旨在探討Corin基因的遺傳變異與血壓鈉鉀反應(yīng)性的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究通過對(duì)陜西省寶雞眉縣地區(qū)18～60歲的成年人進(jìn)行社區(qū)血壓篩查,確定潛在先證者及其家系,納入收縮壓在130～160 mm Hg之間和/或舒張壓在85～100 mm Hg之間且未使用降壓藥物的先證者及其兄弟姐妹、配偶和后代參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn):繼發(fā)性高血壓,高血壓2級(jí)及以上,心血管病史或糖尿病史,使用降壓藥物,懷孕,酗酒,正在低鈉飲食或無法簽署知情同意書者。最終納入來自124個(gè)家庭的514名受試者,建立“鹽敏感性高血壓研究隊(duì)列”并行基線調(diào)查,對(duì)其中的333名非父母者進(jìn)行鈉鉀飲食干預(yù)研究。

1.2 飲食干預(yù)

慢性鈉鹽負(fù)荷及補(bǔ)鉀干預(yù)方案參照本課題組既往研究[14-15]。首先為3 d基線調(diào)查,包括問卷調(diào)查、身高、體質(zhì)量、血壓、血尿生化參數(shù)等。此后依次為7 d低鹽飲食(3 g氯化鈉或51.3 mmol鈉/d)、7 d高鹽飲食(18 g氯化鈉或307.8 mmol鈉/d)和7 d高鹽補(bǔ)鉀飲食(高鹽飲食基礎(chǔ)上再加60 mmol/4.5 g氯化鉀/d)。所有食物均為不加鹽烹飪,此后由研究人員將預(yù)先分裝好的鈉鹽及鉀添加到每個(gè)受試者食物中。在整個(gè)研究期間,其他膳食營養(yǎng)攝入量保持不變。為了確保受試者對(duì)干預(yù)計(jì)劃的依從性,其三餐(早餐、午餐和晚餐)被要求在指定餐廳進(jìn)行,避免食用研究以外的食物。

1.3 24 h尿鈉鉀排泄量的測定

為保證受試者對(duì)飲食干預(yù)的依從性,在基線期的第3天及每個(gè)干預(yù)期的第7天收集24 h尿液標(biāo)本,使用火焰光度計(jì)測定尿液中鈉和鉀的濃度。將所測得的鈉、鉀濃度乘以個(gè)體24 h尿液總?cè)莘e,計(jì)算每個(gè)受試者的24 h尿鈉、鉀排泄量。

1.4 血壓測量

受試者進(jìn)行血壓測量之前禁止吸煙、飲酒、進(jìn)食刺激性食物及劇烈活動(dòng),靜坐休息30 min,由專業(yè)人員按照korotkoff聽音法測量右上臂坐位血壓。于基線期每天和每階段飲食干預(yù)期的第5、6、7天測量血壓,每天測量3 次,每次間隔1 min,最終將各階段9次血壓的平均值納入研究。具體血壓測量方法參照本課題組既往研究[14-15]。平均動(dòng)脈壓、脈壓計(jì)算公式為:平均動(dòng)脈壓=舒張壓+1/3(收縮壓-舒張壓);脈壓差=收縮壓-舒張壓。將血壓的鈉鉀反應(yīng)性視為連續(xù)變量,計(jì)算如下:低鹽期血壓反應(yīng)性=低鹽期血壓-基線期血壓;高鹽期血壓反應(yīng)性=高鹽期血壓-低鹽期血壓;補(bǔ)鉀期血壓反應(yīng)性=高鹽補(bǔ)鉀期血壓-高鹽期血壓。

1.5 單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)選擇和基因分型

通過對(duì)美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih,gov/projects/SNP)和基因組變異服務(wù)器數(shù)據(jù)庫(http://gvs.gs.washington.edu/GVS147)進(jìn)行檢索,采用HaploView 4.2 軟件(Broad Institute,Cambridge,MA,USA)在中國北京漢族(CHB)和亞洲人群數(shù)據(jù)庫中篩選Corin基因中的標(biāo)簽SNP位點(diǎn),具體篩選標(biāo)準(zhǔn):該標(biāo)簽位點(diǎn)SNP 頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P≥0.05),次要等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)P≥0.05,且連鎖不平衡系數(shù)r2≥0.8。最終納入15個(gè)Corin基因相關(guān)的SNP位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析,分別為rs12641823、rs2271037、rs6834933、rs2271036、rs78911825、rs2351783、rs10049713、rs10517195、rs17654278、rs3749584、rs4695253、rs36090894、rs6823184、rs12509275、rs73814824。

采集全部受試者外周靜脈血,應(yīng)用Gold Mag-Mini純化試劑盒(Gold Mag有限公司,中國)提取外周血脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)。通過Mass ARRAY 檢測平臺(tái)對(duì)15個(gè)Corin基因有關(guān)的SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型?；蚍中蛯?shí)驗(yàn)均由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行。連續(xù)變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,分類變量以n/%表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組之間的比較,采用方差分析進(jìn)行多組間比較。使用PLINK軟件(version 1.9)通過精確檢驗(yàn)法對(duì)選取父母受試者的基因型進(jìn)行平衡檢驗(yàn)和孟德爾一致性檢驗(yàn),計(jì)算各基因型的MAF。利用PLINK 軟件在不同遺傳模型(加性模型、顯性模型和隱性模型)下構(gòu)建混合線性回歸模型。將年齡、性別和體質(zhì)量指數(shù)作為固定效應(yīng),家系相關(guān)性作為隨機(jī)效應(yīng)在模型中進(jìn)行校正。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者基線特征及血壓的鈉鉀反應(yīng)性

受試者基線特征及鈉鉀飲食干預(yù)的血壓反應(yīng)如表1所示。基線期先證者組的舒張壓及平均動(dòng)脈壓在各組中最高,而收縮壓低于其父母組。在鈉鉀飲食干預(yù)過程中,各階段血壓均發(fā)生了變化,低鹽期呈下降趨勢,高鹽期呈上升趨勢,高鹽補(bǔ)鉀后的血壓則再次下降。

表1 受試者基線特征及飲食干預(yù)的血壓反應(yīng)Tab.1 Baseline characteristics and BP responses to dietary intervention

續(xù)表1

2.2 鈉鉀干預(yù)對(duì)受試者24 h尿鈉和鉀排泄的影響

各干預(yù)期受試者尿鈉、鉀排泄情況如表2所示,其與膳食鈉鉀攝入量的趨勢類似。24 h尿鈉排泄量在低鹽期明顯低于基線期,而在高鹽負(fù)荷后則顯著增加;此外,補(bǔ)鉀可顯著升高24 h尿鉀排泄量(均P＜0.05)。以上結(jié)果說明受試者對(duì)飲食干預(yù)的依從性良好。

表2 各干預(yù)期受試者尿鈉、鉀排泄情況Tab.2 Urinary excretions of sodium and potassium in subjects during the intervention periods (,mmol)

表2 各干預(yù)期受試者尿鈉、鉀排泄情況Tab.2 Urinary excretions of sodium and potassium in subjects during the intervention periods (,mmol)

與基線期比較,*P＜0.05;與低鹽期比較,#P＜0.05;與高鹽期比較,§P＜0.05。

2.3 Corin基因SNP位點(diǎn)信息

符合納入排除標(biāo)準(zhǔn)的15個(gè)Corin基因SNP 位點(diǎn)的基本信息如表3所示,包括基因型、位點(diǎn)位置、等位基因、次要等位基因頻率、Hardy-Weinberg檢驗(yàn)和功能預(yù)測。各SNP 位點(diǎn)基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡定律,說明受試人群具有群體代表性。

表3 Corin基因SNPs基本信息Tab.3 Information on SNPs of Corin gene

2.4 Corin基因SNPs與血壓鈉鉀反應(yīng)性的關(guān)聯(lián)分析

如表4所示,在低鹽期,rs12509275位點(diǎn)與舒張壓反應(yīng)性顯著相關(guān),而rs3749584與脈壓反應(yīng)性顯著相關(guān)。在高鹽期,rs3749584、rs10517195與脈壓反應(yīng)性顯著相關(guān)。在高鹽補(bǔ)鉀期,rs17654278 與收縮壓反應(yīng)性顯著相關(guān),rs2271037與舒張壓反應(yīng)性顯著相關(guān),rs4695253、rs12509275、rs2351783、rs36090894與脈壓差反應(yīng)性顯著相關(guān)。

表4 Corin基因SNP位點(diǎn)與血壓鈉鉀反應(yīng)性的關(guān)系Tab.4 Associations of Corin SNPs with blood pressure response to dietary intervention

續(xù)表4

3 討 論

Corin基因由22 個(gè)外顯子組成,在4 號(hào)染色體上,長度約為200 kb[16]。此前有研究表明Corin 基因變異與非裔美國人高血壓發(fā)生相關(guān)[17-20]。CHAN等[11]發(fā)現(xiàn),與野生型小鼠相比,Corin基因敲除小鼠的血壓升高。他們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在Corin基因敲除小鼠中,ANP前體轉(zhuǎn)化為ANP 受阻,導(dǎo)致高血壓和心肌肥大[11]。此外,在不同人群中也報(bào)道了Corin 基因變異與高血壓的相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)在中國漢族人群中,Corin SNP 位點(diǎn)rs2271037、rs3749585與高血壓風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[21]。DRIES等[18]發(fā)現(xiàn)在三個(gè)不同的隊(duì)列中(達(dá)拉斯心臟研究、動(dòng)脈粥樣硬化多民族研究、芝加哥高血壓遺傳學(xué)研究),次要Corin T555I/Q568P等位基因與高血壓風(fēng)險(xiǎn)增加獨(dú)立相關(guān)。此外,ZHANG等[10]也發(fā)現(xiàn)Corin基因的插入突變c.102_103insA更易出現(xiàn)在中國的高血壓患者中。WANG[13]等研究發(fā)現(xiàn),重組Corin變異T555I/Q568P的ANP活性受損,Corin基因的遺傳變異可能降低體內(nèi)Corin活性,導(dǎo)致黑人高血壓。以上研究提示,Corin基因變異與高血壓易感性之間的關(guān)聯(lián)是由異常的ANP活性所致。

本研究首次探索Corin多態(tài)性與血壓對(duì)鹽的反應(yīng)性的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Corin SNP 位點(diǎn)rs12509275位點(diǎn)與舒張壓反應(yīng)性顯著相關(guān),而rs3749584與脈壓反應(yīng)性顯著相關(guān)。此外,在高鹽期,rs3749584、rs10517195與脈壓反應(yīng)性顯著相關(guān)。本研究提示Corin基因變異可能參與血壓鹽敏感性的形成。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)。在表達(dá)Corin基因T555I/Q568P變異的轉(zhuǎn)基因小鼠中,心肌中的ANP前體水平顯著升高,并更易出現(xiàn)鹽敏感性高血壓和心臟肥大[18]。WANG 等[12-13]研究表明,高鹽飲食能夠顯著升高Corin基因敲除小鼠的血壓水平,而在野生型小鼠中沒有觀察到這種變化。然而,Corin如何通過調(diào)節(jié)ANP系統(tǒng)影響鹽敏感性的具體機(jī)制尚不清楚。ANP通路通過抑制水通道蛋白2(AQP2)和β-上皮鈉通道(β-ENaC)在血壓調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。POLZIN 等[22]研究顯示,在Corin 基因敲除小鼠中腎臟ENaC表達(dá)增加,提示Corin可能下調(diào)腎臟ENaC表達(dá)和活性。ZHAO 等[23]認(rèn)為,ANP 介導(dǎo)的遠(yuǎn)端腎單位鈉重吸收抑制對(duì)促進(jìn)尿鈉排泄至關(guān)重要。此外,高鹽攝入導(dǎo)致細(xì)胞外液增加。由于心輸出量增加和容量依賴性因素,血壓可能會(huì)增加[24]。隨著細(xì)胞外液的增加,Corin可能會(huì)被激活。因此,Corin可能通過這些途徑影響血壓的鈉離子穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞外液和鹽敏感性。有關(guān)Corin與血壓鹽敏感性的關(guān)系有待于更多的功能研究來闡明。

流行病學(xué)研究表明,飲食鉀干預(yù)量與血壓呈負(fù)相關(guān),且個(gè)體血壓對(duì)鉀攝入量的反應(yīng)存在差異性[25-27]。內(nèi)皮素1(EDN1)、一氧化氮合酶3(NOS3)及E 選擇素(SELE)基因多態(tài)性與補(bǔ)鉀的降壓反應(yīng)均密切相關(guān)[7]。此外,GenSalt研究發(fā)現(xiàn),APLN 和ACE2基因SNP 位點(diǎn)與飲食鉀補(bǔ)充后的血壓反應(yīng)顯著相關(guān)[28]。GU 等[29]提出,膳食鉀補(bǔ)充引起的血壓反應(yīng)在中國人群中存在中等遺傳力。本課題組既往隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn),抗衰老因子KLOTHO、脂肪素AdipoQ及蛋白激酶SGK1基因多態(tài)性與補(bǔ)鉀的血壓反應(yīng)性顯著相關(guān)[15,30-31]。這些研究表明,遺傳因素可能導(dǎo)致了血壓對(duì)鉀攝入量反應(yīng)的變化。本研究首次討論了Corin基因多態(tài)性與補(bǔ)鉀干預(yù)的血壓反應(yīng)性之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)在高鹽補(bǔ)鉀期,rs17654278與收縮壓反應(yīng)性相關(guān),rs2271037 與舒張壓反應(yīng)性顯著相關(guān),rs4695253、rs12509275、rs2351783、rs36090894 與 脈壓差反應(yīng)性相關(guān),提示Corin遺傳變異可能參與了血壓鉀敏感性的形成。

綜上,本研究首次發(fā)現(xiàn)Corin基因多態(tài)性與血壓對(duì)飲食鈉鉀干預(yù)的反應(yīng)顯著相關(guān),這有助于從遺傳學(xué)角度進(jìn)一步理解鈉鉀敏感性血壓形成機(jī)制并為高血壓的防治工作提供思路?？紤]到本研究存在樣本量相對(duì)較小且受試者局限于中國北方人口等不足之處,因此,膳食鈉鉀鹽的攝入與Corin基因多態(tài)性的關(guān)系及其在高血壓發(fā)生發(fā)展中的作用等方面的臨床意義還有待大規(guī)模前瞻性研究予以證實(shí)。