李圓圓 ，張 可 ，黃四洲 ，張利娟 △

1.成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院·核工業(yè)四一六醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科（成都 610057）；2.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室（成都 610500）；3.成都醫(yī)學(xué)院 發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（成都 610500）

疾病、創(chuàng)傷及藥物毒性等所致的耳蝸機(jī)械感覺毛細(xì)胞損傷是造成永久性耳聾及聽力缺陷的常見原因，其原因是由于哺乳動(dòng)物毛細(xì)胞不可再生[1]；相反，某些脊椎動(dòng)物如鳥類、兩棲類動(dòng)物及魚類等的毛細(xì)胞則具有極強(qiáng)的再生能力[2]；因此探明低等動(dòng)物毛細(xì)胞再生的機(jī)制并加以運(yùn)用，哺乳動(dòng)物體內(nèi)毛細(xì)胞再生則有望實(shí)現(xiàn)。斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘作為感受水壓、水溫及水流等的重要感覺器官廣泛分布于頭部及軀干表面，分為頭部前側(cè)線系統(tǒng)及軀干部位的后側(cè)線系統(tǒng)[3]。由于神經(jīng)丘中心的機(jī)械感覺性毛細(xì)胞具有較強(qiáng)的再生能力，在結(jié)構(gòu)及功能方面與哺乳動(dòng)物內(nèi)耳毛細(xì)胞具有相似性，可用于活體染色且易于觀察，并且斑馬魚具備易培育、繁殖快、產(chǎn)卵量大、胚胎透明等優(yōu)點(diǎn)，故可作為毛細(xì)胞發(fā)育與再生的理想模型。

斑馬魚側(cè)線系統(tǒng)起源于頭部神經(jīng)側(cè)線基板，在向尾部遷移途中逐漸沉積形成一系列神經(jīng)丘。每個(gè)神經(jīng)丘由中央的一組機(jī)械感覺毛細(xì)胞及其周圍非感覺性支持細(xì)胞圍繞組成，其中毛細(xì)胞對氨基糖苷類抗生素及某些重金屬如順鉑類、銅離子等十分敏感[4]。既往研究[4-6]通過線粒體熒光染料特異性標(biāo)記斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不同濃度梯度的新霉素或硫酸銅對毛細(xì)胞的損傷程度及損傷后再生過程均不相同。有研究[7]表明，在神經(jīng)丘再生過程中新生毛細(xì)胞來源于周圍支持細(xì)胞，然而調(diào)控這一分化過程的分子及細(xì)胞學(xué)機(jī)制不明；同時(shí)藥物或重金屬是否會對毛細(xì)胞周圍的支持細(xì)胞產(chǎn)生影響尚不清楚。因此本研究通過堿性磷酸酶催化底物氯化硝基四氮唑蘭（nitroblue tetrazolium chloride，NBT）及5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，BCIP）反應(yīng)顯色方法顯色神經(jīng)丘[8]，探究不同發(fā)育時(shí)期斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘的發(fā)育狀態(tài)，并用藥物處理殺傷神經(jīng)丘支持細(xì)胞，觀察不同時(shí)期神經(jīng)丘支持細(xì)胞對藥物的敏感性及其損傷后的再生情況，以期為今后進(jìn)一步探索神經(jīng)丘再生調(diào)控機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究選用的斑馬魚為野生型（AB品系），養(yǎng)殖于經(jīng)紫外線殺菌的恒溫（28.5 ℃）系統(tǒng)水中，pH值恒定在7.6左右，保持規(guī)律的晝夜交替節(jié)律，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。成年斑馬魚交配前1 d 喂食后，將雌、雄魚分別放置于中間有透明擋板分隔的交配缸中，次日8∶00拔除擋板，使其自行交配產(chǎn)卵。1 h后收集魚卵于系統(tǒng)養(yǎng)殖水中，并放置于28 ℃恒溫箱中孵育，于受精后24 h加入 0.03%苯硫脲抑制黑色素形成，分別收集受精后1～5 d不同發(fā)育時(shí)期的斑馬魚胚胎。

1.2 主要試劑及設(shè)備

NBT/BCIP顯色液購自美國Roche公司；新霉素（USP級）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司； 五水硫酸銅晶體購自成都科隆化學(xué)品有限公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘NBT/BCIP顯色 分別將受精后1～5 d時(shí)期斑馬魚胚胎各20個(gè)置于EP管中（受精后1～2 d的斑馬魚胚胎先剝?nèi)ヂ褮ぃ?，加?%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）室溫固定1 h；用含有吐溫的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline with tween，PBST）洗滌3次，5 min/次，將斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)移至36孔板中，加入配制好的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）緩沖溶液洗滌 3次，5 min/次；將0.1 mL NBT/BCIP顯色液加入4.9 mL AP緩沖液中混勻，37 ℃避光孵育20 min，每孔加入上述配制的顯色液300 μL置于37 ℃溫箱顯色10～15 min；4% PFA洗滌終止染色，再加入PBST洗滌1次，顯微鏡下觀察，分別對每個(gè)斑馬魚胚胎頭部及軀干部位神經(jīng)丘進(jìn)行計(jì)數(shù)并記錄，將胚胎置于0.7%瓊脂糖凝膠中固定，熒光顯微鏡拍照。

1.3.2 斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘藥物處理 新霉素加入系統(tǒng)水中分別配制成濃度為125、250、500 μmol/L的溶液，將受精后2～4 d的斑馬魚胚胎分別置于培養(yǎng)皿中并加入上述溶液（每盤45個(gè)），每個(gè)時(shí)期均用3種濃度梯度溶液處理，置于28 ℃恒溫箱中1 h；藍(lán)色五水硫酸銅晶體加入系統(tǒng)水中配制成濃度為 5、25、50 μmol/L的溶液，余方法同上。藥物處理后每盤取15個(gè)胚胎轉(zhuǎn)移至EP管中并立即用PBST洗滌3次，5 min/次，加入 4% PFA室溫固定 1 h 后，進(jìn)行神經(jīng)丘NBT/BCIP顯色（方法同前），觀察每個(gè)時(shí)期不同濃度藥物處理后斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘的變化并拍照。同時(shí)將每盤剩余胚胎培養(yǎng)皿中的溶液吸凈，加入系統(tǒng)水清洗2～3次，將斑馬魚胚胎繼續(xù)置于系統(tǒng)水中恒溫孵育。

1.3.3 斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘的再生過程 選取經(jīng)“1.3.2”方法獲取藥物殺傷效果較好的斑馬魚胚胎，將此時(shí)期的胚胎藥物處理24 h后，每盤分別取出15個(gè)胚胎進(jìn)行固定、顯色；剩余胚胎在藥物處理72 h后進(jìn)行固定、顯色（方法同前），觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚不同時(shí)期的側(cè)線神經(jīng)丘發(fā)育

NBT/BCIP顯色結(jié)果顯示，受精后1 d斑馬魚胚胎的頭部及軀干部位神經(jīng)丘均未見顯示；在受精后2 d斑馬魚胚胎的頭部及軀干部位神經(jīng)丘均可見，但形態(tài)較小且數(shù)量較少；受精后3 d斑馬魚胚胎的神經(jīng)丘顯示清晰，且數(shù)量較前明顯增加、形態(tài)趨于規(guī)則；受精后4 d斑馬魚胚胎的神經(jīng)丘數(shù)量較前進(jìn)一步增加且形態(tài)規(guī)則為中空的類圓形結(jié)構(gòu)；受精后5 d斑馬魚胚胎的頭部及軀干部位神經(jīng)丘數(shù)量及形態(tài)較受精后4 d未見明顯改變（圖1）。

圖1 斑馬魚不同時(shí)期的側(cè)線神經(jīng)丘發(fā)育

2.2 不同藥物處理不同時(shí)期斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘的變化

新霉素處理不同時(shí)期斑馬魚胚胎后結(jié)果顯示，受精后2～3 d斑馬魚胚胎經(jīng)500 μmol/L 新霉素處理后神經(jīng)丘顯色未見明顯改變；受精后4 d斑馬魚胚胎經(jīng)125、250、500 μmol/L 新霉素處理后其頭部及軀干部位神經(jīng)丘均可見明顯改變，表現(xiàn)為神經(jīng)丘形態(tài)極不規(guī)則且明顯變小、部分呈碎裂狀改變，但均未完全消失，且不同濃度梯度間差異不明顯（圖2）。

圖2 新霉素處理不同時(shí)期斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘的形態(tài)變化

硫酸銅處理不同時(shí)期斑馬魚胚胎后結(jié)果顯示，受精后2～3 d斑馬魚胚胎經(jīng)不同濃度硫酸銅處理后神經(jīng)丘顯色未見明顯改變；受精后4 d斑馬魚胚胎經(jīng)5 μmol/L硫酸銅處理后神經(jīng)丘形態(tài)未見明顯改變，而經(jīng)25、50 μmol/L 硫酸銅處理后其頭部及軀干部位神經(jīng)丘均表現(xiàn)為形態(tài)極不規(guī)則且明顯變小、部分呈碎裂狀改變，但均未完全消失（圖3）。

圖3 硫酸銅處理不同時(shí)期斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘的形態(tài)變化

2.3 不同藥物處理后斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘的再生情況

受精后4 d斑馬魚胚胎在新霉素殺傷后24 h，125 μmol/L 新霉素處理組斑馬魚胚胎的頭部及軀干部位神經(jīng)丘形態(tài)完全恢復(fù)至正常，與殺傷后72 h差異不明顯；而250、500 μmol/L處理組斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘部分恢復(fù)，但未恢復(fù)至正常形態(tài)；新霉素殺傷后72 h時(shí)250、500 μmol/L處理組斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘均完全恢復(fù)至正常形態(tài)（圖4）。受精后4 d的斑馬魚胚胎在硫酸銅殺傷處理后24 h時(shí)，25、50 μmol/L處理組斑馬魚胚胎的頭部及軀干部位神經(jīng)丘形態(tài)均較前未見恢復(fù)；殺傷后72 h時(shí)，25、50 μmol/L處理組斑馬魚胚胎的頭部及軀干部位神經(jīng)丘均完全恢復(fù)至正常形態(tài)（圖5） 。

圖4 新霉素處理后斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘的再生情況

圖5 硫酸銅處理后斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘的再生情況

3 討論

斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘隨著胚胎發(fā)育逐漸成熟，在受精后48 h形成初級側(cè)線系統(tǒng)[9-10]?；诖?，本研究通過對斑馬魚胚胎行NBT/BCIP顯色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受精后2 d斑馬魚前、后側(cè)線神經(jīng)丘開始顯示，但數(shù)量較少且形態(tài)極不規(guī)則；從受精后3 d開始神經(jīng)丘數(shù)量呈現(xiàn)快速增長；受精后4～5 d數(shù)量不再增加且呈現(xiàn)出較為規(guī)則的中空類圓形結(jié)構(gòu)，符合神經(jīng)丘的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即中央的毛細(xì)胞未著色，而分布于外圍的支持細(xì)胞明顯著色。該結(jié)果提示，受精后4 d斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘形態(tài)結(jié)構(gòu)才基本發(fā)育成熟。

有研究[5]發(fā)現(xiàn)，新霉素對斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞的損傷呈劑量依賴性，藥物濃度為125 μmol/L時(shí)損傷較為明顯，達(dá)500 μmol/L 時(shí)毛細(xì)胞被徹底清除。本研究中不同濃度梯度（125、250、500 μmol/L）的新霉素對受精后2～3 d斑馬魚胚胎的神經(jīng)丘形態(tài)及數(shù)目均未產(chǎn)生影響；而受精后4 d神經(jīng)丘則變小且呈現(xiàn)出明顯的形態(tài)異常，各濃度間差異不明顯，經(jīng)較高濃度（25、50 μmol/L）硫酸銅處理后的神經(jīng)丘也呈現(xiàn)出同樣的改變。其原因可能是未成熟的神經(jīng)丘支持細(xì)胞尚未形成規(guī)則的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其損傷后與損傷前顯色差異不明顯，或是發(fā)育成熟的神經(jīng)丘支持細(xì)胞對有害物質(zhì)更為敏感所致。該結(jié)果提示，選擇受精后4 d及以后時(shí)期的斑馬魚胚胎進(jìn)行神經(jīng)丘損傷及再生研究更為可靠。本研究還發(fā)現(xiàn)，受精后4 d的斑馬魚胚胎經(jīng)5 μmol/L 硫酸銅處理后神經(jīng)丘形態(tài)并未出現(xiàn)明顯破壞；而既往研究[6]發(fā)現(xiàn)，同樣濃度的硫酸銅處理1 h，可致神經(jīng)丘毛細(xì)胞全部清除，提示與毛細(xì)胞相比，外圍的支持細(xì)胞更不容易受到重金屬物質(zhì)的影響。由此得出，不同濃度梯度的新霉素對斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘均有較好的殺傷效果，而較低濃度硫酸銅則無明顯殺傷效果，相比之下，新霉素可作為斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘殺傷的最佳藥物。

側(cè)線毛細(xì)胞暴露于有毒物質(zhì)后再生迅速，通常于損傷后24 h達(dá)增殖高峰，72 h幾乎完全更新[11]，此過程受性別決定基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2、音猬因子等多種基因及Wnt/β-連環(huán)蛋白通路、纖維母細(xì)胞生長因子等信號通路調(diào)控[12-13]。有研究[14]表明，支持細(xì)胞作為毛細(xì)胞的前體細(xì)胞，通過增殖、分化促使毛細(xì)胞更新，并不會破壞其自身的數(shù)目及穩(wěn)定性；如果抑制支持細(xì)胞增殖，將導(dǎo)致毛細(xì)胞無法再生。本研究發(fā)現(xiàn)，125 μmol/L新霉素處理組斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘形態(tài)于損傷后24 h基本恢復(fù)，而250、500 μmol/L新霉素處理后24 h有部分恢復(fù)，72 h時(shí)才完全恢復(fù)至正常形態(tài)。既往研究[5]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)新霉素處理后毛細(xì)胞的再生呈劑量依賴。本研究中硫酸銅處理組在損傷后24 h與新霉素處理組相比，其神經(jīng)丘恢復(fù)不明顯，于72 h時(shí)完全恢復(fù)。由此得出，新霉素處理組斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘再生速度較快，125 μmol/L 新霉素在殺傷后24 h斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘形態(tài)已完全恢復(fù)，故125 μmol/L 新霉素可作為建立神經(jīng)丘損傷及再生模型的最佳藥物濃度。既往研究[15]發(fā)現(xiàn)，順鉑誘導(dǎo)的毛細(xì)胞損傷后再生速率與新霉素相比有所減慢，提示重金屬物質(zhì)在一定程度上可延緩再生過程。有研究[11]表明，硫酸銅濃度達(dá)到50 μmol/L時(shí)毛細(xì)胞將不能再生，但本研究結(jié)果顯示，50 μmol/L硫酸銅處理1 h，神經(jīng)丘形態(tài)仍完全恢復(fù)，提示較高濃度的硫酸銅才可導(dǎo)致支持細(xì)胞耗竭。

綜上所述，受精后4 d的斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育基本成熟，這一時(shí)期的胚胎藥物處理后進(jìn)行損傷及再生方面研究其結(jié)論更為可靠。本研究全面呈現(xiàn)了不同濃度梯度的新霉素及硫酸銅致斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘的損傷及再生過程，但缺乏毛細(xì)胞特異性標(biāo)記，后續(xù)的研究將結(jié)合毛細(xì)胞的再生過程探索再生相關(guān)調(diào)控機(jī)制。