丁大連，李鵬，亓衛(wèi)東，張建輝

(1.紐約州立大學(xué)布法羅大學(xué)，紐約 布法羅 14214； 2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 廣州 510230； 3.成都市第三人民醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，四川 成都 610014； 4.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，上海 200040)

內(nèi)耳功能主要分為聽覺功能和平衡功能，其中耳蝸是內(nèi)耳的聽覺器官，而前庭則是內(nèi)耳的平衡器官。在每個(gè)內(nèi)耳中的前庭感覺區(qū)包含2個(gè)感知線性加速度改變的耳石器(球囊斑和橢圓囊斑)和3個(gè)感知角加速度改變的壺腹嵴[1-3]。位于這些前庭感覺區(qū)的毛細(xì)胞是前庭系統(tǒng)中感受自身運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和頭位空間位置的平衡感受器，前庭毛細(xì)胞因運(yùn)動(dòng)或體位改變釋放出的神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)通過毛細(xì)胞底部的傳入神經(jīng)末梢經(jīng)前庭神經(jīng)節(jié)傳送到腦干中的前庭核，然后再與其他參與平衡感知和調(diào)控的中樞神經(jīng)核團(tuán)建立間接的神經(jīng)聯(lián)系[4-5]。由此可見，前庭毛細(xì)胞是內(nèi)耳中接受平衡感覺刺激的唯一感受器，前庭毛細(xì)胞的破壞將直接造成內(nèi)耳的平衡功能障礙甚至導(dǎo)致內(nèi)耳的平衡功能喪失，這意味著前庭毛細(xì)胞的定量病理學(xué)評(píng)估對(duì)研究前庭性平衡障礙至關(guān)重要。

在內(nèi)耳前庭感覺毛細(xì)胞的定量組織病理學(xué)研究中，對(duì)前庭感覺區(qū)連續(xù)切片進(jìn)行毛細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法因工作量過大和準(zhǔn)確性欠佳而早已不再被采用[6]。自前庭膜迷路鋪片技術(shù)問世以來，由于該技術(shù)為實(shí)現(xiàn)各個(gè)前庭感覺區(qū)的毛細(xì)胞定量分析提供了非常理想的觀察角度而日益得到更多的應(yīng)用[7-16]。

了解受試動(dòng)物前庭感覺區(qū)的測(cè)量參數(shù)和確定各個(gè)前庭感覺區(qū)的前庭毛細(xì)胞數(shù)量或毛細(xì)胞密度，是定量觀察前庭毛細(xì)胞病理學(xué)改變的基本要素。本實(shí)驗(yàn)旨在通過測(cè)量多種常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物前庭各個(gè)感覺區(qū)及其毛細(xì)胞數(shù)量的重要數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步開展前庭組織病理學(xué)的定量觀察和分析提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試動(dòng)物種類

本實(shí)驗(yàn)測(cè)量了正常CBA/CaJ小鼠、裸鼠、SD大鼠、豚鼠、南美栗鼠、新西蘭白兔和非洲黑長尾猴等七種常用的成年實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(每種動(dòng)物6只)的前庭感覺區(qū)的面積和毛細(xì)胞的數(shù)據(jù)。受試動(dòng)物的一側(cè)耳被用于本實(shí)驗(yàn)的球囊斑和橢圓囊斑面積測(cè)量及前庭各個(gè)感覺區(qū)毛細(xì)胞的定量觀察，另一側(cè)耳被用于其他實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中除南美栗鼠和新西蘭白兔的實(shí)驗(yàn)程序得到復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)之外，其余所有動(dòng)物的樣本制備程序均根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院發(fā)布指南并得到布法羅大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 各個(gè)前庭感覺區(qū)的取材鋪片技術(shù)

將取出的受試動(dòng)物的顳骨浸入到10%福爾馬林固定液浸泡數(shù)小時(shí)，然后在解剖顯微鏡下摘除鐙骨并打開前庭池外側(cè)骨壁，充分暴露位于前庭池內(nèi)的每一個(gè)前庭感覺區(qū)(圖1)。用分離針緊貼前庭池內(nèi)側(cè)骨壁截?cái)嗲蚰野弑硞?cè)穿入到中篩斑的神經(jīng)纖維和血管，分離取下球囊斑，然后摘除覆蓋在球囊斑表面的耳石膜。用分離針在上篩斑緊貼骨壁截?cái)鄼E圓囊斑背側(cè)的神經(jīng)纖維和血管，分離取下橢圓囊斑，然后摘除覆蓋在橢圓囊斑表面的耳石膜。用分離針分別在上篩斑和下篩斑處的前庭池骨壁截?cái)嗤獍胍?guī)管壺腹嵴和上半規(guī)管壺腹嵴及后半規(guī)管壺腹嵴的神經(jīng)纖維和血管，再分別截?cái)?個(gè)膜半規(guī)管取下3個(gè)膜壺腹，最后打開膜壺腹暴露壺腹腔內(nèi)的壺腹嵴。將取下并完成暴露的各個(gè)前庭感覺區(qū)常規(guī)染色后鋪放在載玻片上的甘油滴中，蓋上蓋玻片[7,9,17-19]。

1.3 球囊斑和橢圓囊斑的面積測(cè)量

首先對(duì)每種受試動(dòng)物的球囊斑鋪片和橢圓囊斑鋪片在放大100倍的光學(xué)顯微鏡下拍攝兩個(gè)囊斑鋪片的整體照片，應(yīng)用Image J軟件的圖像測(cè)量程序，分別測(cè)量CBA/CaJ小鼠、裸鼠、SD大鼠、豚鼠、南美栗鼠、新西蘭白兔和非洲黑長尾猴的球囊斑和橢圓囊斑的實(shí)際面積。見圖2。

1.4 球囊斑和橢圓囊斑毛細(xì)胞總數(shù)的計(jì)數(shù)方法

在光學(xué)顯微鏡下，將平整鋪片的球囊斑和橢圓囊斑照片上的囊斑區(qū)域劃分為面積相同的若干網(wǎng)格區(qū)域(圖3)。 在放大圖像下準(zhǔn)確計(jì)數(shù)每個(gè)方格中的毛細(xì)胞數(shù)量，然后將每個(gè)方格的毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果相加，從而獲得每種受試動(dòng)物的球囊斑和橢圓囊斑上的毛細(xì)胞總數(shù)。

1.5 前庭各個(gè)感覺區(qū)局部毛細(xì)胞密度的測(cè)量

由于球囊斑和橢圓囊斑比較平整，因而容易制作成球囊斑鋪片和橢圓囊斑鋪片。從球囊斑和橢圓囊斑鋪片進(jìn)行毛細(xì)胞全計(jì)數(shù)的方法雖然可行，但是耗時(shí)過長而且需要確保制作出完整無損的整個(gè)囊斑鋪片，加上文獻(xiàn)中報(bào)道的有關(guān)前庭各個(gè)感覺區(qū)毛細(xì)胞總數(shù)的參考數(shù)據(jù)由于各自存在的技術(shù)原因而具有相當(dāng)大的差異，這些都給定量評(píng)估前庭兩個(gè)囊斑上的毛細(xì)胞總數(shù)帶來一定的困難。在光學(xué)顯微鏡高倍鏡的放大條件下，對(duì)前庭感覺區(qū)鋪片上的小視野范圍內(nèi)進(jìn)行毛細(xì)胞計(jì)數(shù)，從而獲取局部的毛細(xì)胞密度，不失為一種簡便有效的前庭毛細(xì)胞定量觀察方法(圖4)。壺腹嵴具有一個(gè)立體的隆起的外形，在制作鋪片時(shí)很難鋪放平整而難免總有被遮擋的部位使之難以實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)壺腹嵴上所有毛細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。但是，應(yīng)用前庭小視野定量觀察技術(shù)計(jì)算出前庭各個(gè)感覺區(qū)小視野范圍內(nèi)毛細(xì)胞密度的方法卻既簡單又可靠，還可以在同一個(gè)樣品上對(duì)幾個(gè)不同的區(qū)域進(jìn)行毛細(xì)胞計(jì)數(shù)，再以平均值來代表該前庭感覺區(qū)的毛細(xì)胞密度[8,20-21]。我們?cè)陬A(yù)先設(shè)定的放大倍數(shù)下，首先拍攝取景框視野內(nèi)顯微測(cè)微尺的照片，從而計(jì)算出該放大倍數(shù)下攝影取景框的實(shí)際面積，然后對(duì)該放大倍數(shù)下攝影取景框內(nèi)的毛細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，這樣就可獲得該受試動(dòng)物前庭各個(gè)感覺區(qū)的毛細(xì)胞密度(圖4)。

1.6 前庭感覺區(qū)毛細(xì)胞損害模型的定量觀察

為了驗(yàn)證上述前庭感覺區(qū)毛細(xì)胞定量觀察技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，我們將測(cè)量前庭毛細(xì)胞密度的定量觀察方法應(yīng)用于以下幾種前庭毛細(xì)胞損害的不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀＂購膶?duì)準(zhǔn)大鼠外耳道口的沖擊波發(fā)生器釋放出的加壓空氣沖擊波的峰值壓力達(dá)到20帕斯卡(Pascals)，爆震聲強(qiáng)達(dá)到196.8 dB SPL。受試大鼠在爆震暴露2周后終止實(shí)驗(yàn)，常規(guī)制備前庭感覺區(qū)鋪片后用蘇木素染色并在光學(xué)顯微鏡下對(duì)毛細(xì)胞進(jìn)行病理學(xué)觀察；②將裝載進(jìn)微滲透泵(Osmotic pump)的每mL Hank’s溶液含有400 μL慶大霉素的溶液通過插入到南美栗鼠上半規(guī)管開出的小孔以每小時(shí)0.5 μL的速率向前庭池內(nèi)持續(xù)緩慢灌注7 d。在停止灌流后的第14天終止實(shí)驗(yàn)，常規(guī)在光學(xué)顯微鏡下對(duì)琥珀酸脫氫酶染色后制備的前庭感覺區(qū)鋪片進(jìn)行毛細(xì)胞的定量觀察;③按照每公斤體重100毫克的劑量向南美栗鼠腹腔內(nèi)一次性注射卡鉑，在注射卡鉑30 d后終止實(shí)驗(yàn)，常規(guī)制備前庭感覺區(qū)鋪片后用蘇木素染色，然后在光學(xué)顯微鏡下對(duì)毛細(xì)胞進(jìn)行定量觀察。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物球囊斑和橢圓囊斑的實(shí)際面積和毛細(xì)胞總數(shù)

按照材料與方法中對(duì)“球囊斑和橢圓囊斑的面積測(cè)量”方法的描述和“球囊斑和橢圓囊斑毛細(xì)胞總數(shù)的計(jì)數(shù)方法”，我們對(duì)CBA/CaJ小鼠、裸鼠、SD大鼠、豚鼠、南美栗鼠、新西蘭白兔和非洲黑長尾猴的球囊斑鋪片和橢圓囊斑鋪片實(shí)施了面積測(cè)量。并獲得了每種受試動(dòng)物球囊斑毛細(xì)胞的總數(shù)和橢圓囊斑毛細(xì)胞的總數(shù)。具體數(shù)據(jù)見表1、圖5。

表1 7種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物球囊斑和橢圓囊斑的實(shí)際面積與球囊斑和橢圓囊斑上的毛細(xì)胞總數(shù)

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各個(gè)前庭感覺區(qū)局部的毛細(xì)胞密度

每個(gè)前庭感覺區(qū)上不同部位的毛細(xì)胞密度見表2。每個(gè)前庭感覺區(qū)的毛細(xì)胞都包含著兩種類型的毛細(xì)胞，它們分別是Ⅰ型毛細(xì)胞和Ⅱ型毛細(xì)胞。外形呈燒瓶狀的Ⅰ型毛細(xì)胞體型較胖，主要集中在球囊斑和橢圓囊斑的微紋區(qū)以及壺腹嵴的頂部；而外形呈柱狀的Ⅱ型毛細(xì)胞體型較瘦，主要分布在球囊斑和橢圓囊斑的周邊區(qū)和壺腹嵴的兩側(cè)。由于Ⅰ型毛細(xì)胞比Ⅱ毛細(xì)胞占據(jù)著更大的空間，因此，Ⅰ型毛細(xì)胞聚集的球囊斑微紋區(qū)和橢圓囊斑微紋區(qū)的毛細(xì)胞密度要顯著低于這兩個(gè)囊斑周邊區(qū)的毛細(xì)胞密度。人們?cè)缇桶l(fā)現(xiàn)松鼠猴囊斑周邊區(qū)的毛細(xì)胞密度平均要比微紋區(qū)的毛細(xì)胞密度高 1.62 倍[22]。有鑒于此，球囊斑微紋區(qū)和橢圓囊斑微紋區(qū)的毛細(xì)胞密度應(yīng)該與這兩個(gè)囊斑周邊區(qū)的毛細(xì)胞密度區(qū)分開來分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(圖4、6)[12,21,23]。

圖6 毛細(xì)胞觀察 6A：大鼠橢圓囊斑微紋區(qū)的正常毛細(xì)胞密度； 6B：沖擊波暴露造成了橢圓囊斑微紋區(qū)毛細(xì)胞的嚴(yán)重破壞，但并未破壞橢圓囊斑周邊區(qū)的毛細(xì)胞； 6C：南美栗鼠球囊斑微紋區(qū)和周邊區(qū)的正常毛細(xì)胞密度。紅色方框顯示球囊斑微紋區(qū)內(nèi)的小視野，黃色方框顯示球囊斑周邊區(qū)的小視野； 6D：慶大霉素造成南美栗鼠球囊斑微紋區(qū)毛細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p害； 6E：毛細(xì)胞密度直方圖顯示慶大霉素造成的南美栗鼠球囊斑微紋區(qū)毛細(xì)胞的損壞程度顯著高于周邊區(qū) (6A、B：蘇木素 ×400； 6C、D：琥珀酸脫氫酶 ×200) 圖7 南美栗鼠橢圓囊斑鋪片對(duì)毛細(xì)胞定量觀察 7A：正常對(duì)照南美栗鼠的Ⅰ型毛細(xì)胞在細(xì)胞核平面的周圍就有一個(gè)圓環(huán)樣的Ⅰ型傳入神經(jīng)末梢，Ⅱ型毛細(xì)胞細(xì)胞核平面的周圍則不具備圓環(huán)狀的神經(jīng)末梢結(jié)構(gòu)； 7B：一次性注射卡鉑(100 mg/kg體重)后30 d，橢圓囊斑鋪片上殘存的毛細(xì)胞只剩下不具備圓環(huán)狀神經(jīng)末梢的Ⅱ型毛細(xì)胞，說明卡鉑選擇性破壞南美栗鼠的Ⅰ型毛細(xì)胞，但是并不損害南美栗鼠的Ⅱ型毛細(xì)胞； 7C：毛細(xì)胞密度直方圖中的星號(hào)顯示南美栗鼠的前庭Ⅰ型毛細(xì)胞確可被卡鉑選擇性破壞 (7A、B：蘇木素 ×1 000) 圖8 大鼠橢圓囊斑鋪片相同視野下的毛細(xì)胞細(xì)胞核平面和支持細(xì)胞細(xì)胞核平面的照片 (ToPro-3 ×630) 8A:當(dāng)顯微鏡的焦距對(duì)準(zhǔn)在毛細(xì)胞的細(xì)胞核平面時(shí)，可見毛細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞之間的間隙都比較大; 8B:當(dāng)顯微鏡的焦距對(duì)準(zhǔn)在毛細(xì)胞下方支持細(xì)胞的細(xì)胞核平面時(shí)，可見支持細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞之間的間隙都很小。說明毛細(xì)胞的細(xì)胞密度顯著低于支持細(xì)胞的細(xì)胞密度 圖9 6種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的壺腹嵴鋪片 (蘇木素 ×100) 9A：小鼠；9B：大鼠；9C：豚鼠；9D：南美栗鼠；9E：羊；9F：猴

測(cè)量球囊斑和橢圓囊斑局部小視野中的毛細(xì)胞密度，除了應(yīng)該對(duì)微紋區(qū)和周邊區(qū)的毛細(xì)胞密度區(qū)分計(jì)數(shù)之外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察的需要，有時(shí)還需要對(duì)Ⅰ型毛細(xì)胞和Ⅱ型毛細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分計(jì)數(shù)。例如卡鉑選擇性破壞南美栗鼠的Ⅰ型毛細(xì)胞，我們通過對(duì)橢圓囊斑鋪片的小視野范圍內(nèi)的Ⅰ型毛細(xì)胞和Ⅱ型毛細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分計(jì)數(shù)，就可以從兩種毛細(xì)胞存活密度的改變來證明這個(gè)特殊現(xiàn)象。具體數(shù)據(jù)見表2、圖7～9。

表2 6種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物球囊斑和橢圓囊斑及壺腹嵴在光學(xué)顯微鏡下前庭小視野毛細(xì)胞平均密度的參考數(shù)據(jù) (毛細(xì)胞/0.03 mm2，1 000倍，

3 討論

3.1 球囊斑和橢圓囊斑面積測(cè)量及毛細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)方法的可靠性問題

Crile于1940年提出了一個(gè)計(jì)算前庭感覺上皮面積和前庭感覺區(qū)毛細(xì)胞數(shù)量與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重之間的A=aBWb 的冪函數(shù)計(jì)算公式[24]，這個(gè)計(jì)算公式被沿用至今[25-26]。這個(gè)計(jì)算公式的意思是每個(gè)前庭感覺區(qū)的表面積和毛細(xì)胞總數(shù)等于系數(shù)a乘以受試動(dòng)物的體重再乘以系數(shù)b。對(duì)于體重小于4 kg的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，計(jì)算球囊斑和橢圓囊斑的面積及毛細(xì)胞總數(shù)的系數(shù)a和系數(shù)b分別是0.045±0.01和0.45±0.03；計(jì)算壺腹嵴毛細(xì)胞的系數(shù)a和系數(shù)b則分別是0.025±0.013和0.44±0.07。對(duì)于體重大于4 kg的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，體重與球囊斑面積之間冪律關(guān)系的斜率為0.45，體重與橢圓囊斑面積之間冪律關(guān)系的斜率為 0.44。雖然這個(gè)計(jì)算公式看上去似乎可以通過簡單測(cè)量動(dòng)物體重得知每個(gè)測(cè)試動(dòng)物各個(gè)前庭感覺區(qū)的表面積和毛細(xì)胞總數(shù)，但是，這種既不測(cè)量實(shí)際前庭感覺區(qū)面積也不對(duì)前庭毛細(xì)胞進(jìn)行實(shí)際計(jì)數(shù)的體重?fù)Q算法，其可靠性和合理性及實(shí)用性都值得被懷疑。試想一只豚鼠在出生后1個(gè)月的體重大約為100 g，到出生后12個(gè)月其體重可以增加到800 g左右。那么，在系數(shù)a和b不變但體重增加了8倍的情況下，難道這只豚鼠的前庭感覺區(qū)的表面積和毛細(xì)胞總數(shù)也會(huì)增加8倍嗎？這顯然是完全不可能的?？梢源_定的是，成年哺乳類動(dòng)物內(nèi)耳的感覺毛細(xì)胞不會(huì)再有增殖，因此，內(nèi)耳毛細(xì)胞的數(shù)量絕不可能隨著動(dòng)物體重的增加而變得更多。假設(shè)這個(gè)體重?fù)Q算公式真能換算出前庭各個(gè)感覺區(qū)的表面積和毛細(xì)胞的總數(shù)，那么如果毛細(xì)胞被耳毒性藥物永久破壞之后，難道體重也會(huì)發(fā)生改變嗎？我們認(rèn)為前庭毛細(xì)胞的數(shù)量和動(dòng)物體重之間沒有任何必然的聯(lián)系。僅憑稱量動(dòng)物體重來推算前庭各個(gè)感覺區(qū)表面積和毛細(xì)胞總數(shù)的算法，對(duì)前庭毛細(xì)胞的定量病理學(xué)評(píng)估毫無價(jià)值。

3.2 毛細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)方法的可靠性問題

我們把從每個(gè)囊斑上記錄到的實(shí)際毛細(xì)胞總數(shù)與早先的論文報(bào)導(dǎo)做了相互比較，除了那些通過體重?fù)Q算得到的囊斑毛細(xì)胞總數(shù)結(jié)果不具備可比性之外，一些發(fā)表文章報(bào)道的毛細(xì)胞總數(shù)與我們的毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果有一定的出入。例如，Lindeman在20世紀(jì)60年代應(yīng)用相差顯微鏡對(duì)戊二醛四氧化鋨雙重固定的豚鼠球囊斑和橢圓囊斑毛細(xì)胞的實(shí)際計(jì)數(shù)結(jié)果與我們所得結(jié)果就存在著顯著差異[27]。雖然四氧化鋨可以染色脂肪小滴和髓鞘，但是由于前庭毛細(xì)胞既不含有脂肪小滴也不含有髓鞘，因此，Lindeman實(shí)際上觀察的是未經(jīng)染色的前庭囊斑鋪片。我們的計(jì)數(shù)結(jié)果顯示豚鼠球囊斑和橢圓囊斑的毛細(xì)胞總數(shù)分別為(4 882.2±208.7)個(gè)和(4 925.3±271.1)個(gè)，可是Lindeman記錄到的豚鼠球囊斑和橢圓囊斑的毛細(xì)胞總數(shù)卻分別為7 500(6 018～7 983)個(gè)和9 000(7 118～10 760)個(gè)。 為什么同樣是在顯微鏡下對(duì)毛細(xì)胞進(jìn)行實(shí)際計(jì)數(shù)卻會(huì)出現(xiàn)如此大的總數(shù)差異？ 我們?cè)诠簿劢癸@微鏡下對(duì)同一區(qū)域的毛細(xì)胞層和支持細(xì)胞層中的細(xì)胞數(shù)量分別進(jìn)行了計(jì)數(shù)，我們發(fā)現(xiàn)由于毛細(xì)胞細(xì)胞核的大小顯著大于支持細(xì)胞的細(xì)胞核，因而同一區(qū)域的毛細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于同一區(qū)域支持細(xì)胞的數(shù)量。我們?cè)谝粋€(gè)放大630倍的顯微鏡下的毛細(xì)胞細(xì)胞核的聚焦平面，在視野中可以識(shí)別約有130個(gè)毛細(xì)胞的細(xì)胞核，但是在這個(gè)相同視野毛細(xì)胞層下方的支持細(xì)胞的細(xì)胞核的聚焦平面，支持細(xì)胞的數(shù)量卻幾乎超過毛細(xì)胞一倍(圖8)。由此我們推測(cè)，Lindeman是否在對(duì)未經(jīng)染色的囊斑鋪片進(jìn)行觀察時(shí)，不得不通過辨別細(xì)胞間相互連接的折光明暗來勉強(qiáng)識(shí)別每一個(gè)細(xì)胞間的輪廓。在這種情況下，隨著顯微鏡焦距的上下移動(dòng)，支持細(xì)胞或許有可能與毛細(xì)胞相互混淆而都被當(dāng)作毛細(xì)胞被計(jì)數(shù)。我們得到的熒光染色的毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果則完全是來自染色清晰的完整的囊斑鋪片樣品，所有的圖像資料都是在共聚焦顯微鏡區(qū)清晰區(qū)分出囊斑鋪片的毛細(xì)胞層面，因此我們不可能將支持細(xì)胞誤認(rèn)作是毛細(xì)胞。為了確保我們的毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果不與支持細(xì)胞相混淆，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中還專門用硝酸銀對(duì)豚鼠球囊斑和橢圓囊斑的表面實(shí)施了金屬沉淀法的鍍銀染色[8,28]，經(jīng)鍍銀染色后，在光學(xué)顯微鏡下可以清晰分辨囊斑表面呈圓形的毛細(xì)胞表皮板輪廓，而不可能將支持細(xì)胞的不規(guī)則形表皮板誤認(rèn)為是毛細(xì)胞的表皮板(圖4C)。囊斑表面鍍上的這一層金屬膜使細(xì)胞不再透明，因而不僅不能看到毛細(xì)胞的細(xì)胞核而且也不能看到毛細(xì)胞層下方的支持細(xì)胞層面。由此可見，前庭感覺區(qū)上皮的表面鍍銀染色也為我們提供了一種可靠的鑒別毛細(xì)胞的方法。誠然，如果應(yīng)用Myosin VI等抗體對(duì)毛細(xì)胞施行特異性染色標(biāo)記后再對(duì)標(biāo)記的毛細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，相信結(jié)果一定會(huì)更有說服力。但是，根據(jù)毛細(xì)胞與支持細(xì)胞大小形態(tài)的顯著差異和毛細(xì)胞圓形表皮板的典型特征，無論是對(duì)共聚焦顯微鏡下獲得的單層毛細(xì)胞圖像實(shí)施對(duì)毛細(xì)胞的計(jì)數(shù)，還是在光學(xué)顯微鏡下對(duì)表面鍍銀的毛細(xì)胞表皮板進(jìn)行計(jì)數(shù)，我們都可以做到準(zhǔn)確無誤。因此，我們相信我們獲得的前庭毛細(xì)胞定量觀察結(jié)果是可靠的。

3.3 在壺腹嵴鋪片上展現(xiàn)壺腹嵴上所有毛細(xì)胞的可能性問題

由于壺腹嵴在壺腹腔內(nèi)呈一個(gè)橫位小峰樣隆起而高低不平[18,29-31]，因而從壺腹嵴鋪片的觀察平面只能看到壺腹嵴面對(duì)物鏡的感覺上皮，如果壺腹嵴鋪片呈側(cè)位，則不可能看到壺腹嵴背側(cè)區(qū)域的毛細(xì)胞；如果壺腹嵴鋪片的嵴頂部朝上，則不可能看到壺腹嵴雙側(cè)與觀察視線平行區(qū)域的毛細(xì)胞(圖9)。由此可見，要想從壺腹嵴鋪片的一個(gè)平面上獲取整個(gè)壺腹嵴多個(gè)不同平米上所有毛細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果，從技術(shù)上來說存在著難以克服的困難。盡管有人主張應(yīng)用酶分離方法嘗試將壺腹嵴的上皮層從壺腹嵴上剝離下來再制作成平整的鋪片[25]，但是由于剝離壺腹嵴上皮細(xì)胞層的制作難度較大而并未得到多數(shù)人的認(rèn)可和贊同。然而，從前庭小視野局部區(qū)域的毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果得到前庭毛細(xì)胞在壺腹嵴上的平均密度，或許比嘗試從凹凸不平相互遮擋的壺腹嵴鋪片上找到每一個(gè)毛細(xì)胞更能有效解決壺腹嵴毛細(xì)胞的定量觀察問題[6,8,12,20,23,28,32]。