潘 江，喬 坤，程 琳

成都醫(yī)學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（成都 610500）

結(jié)腸癌是全世界較常見的惡性腫瘤之一，在所有癌癥中，其發(fā)病率排名第3，病死率排名第2[1]。目前，化療仍是臨床治療結(jié)腸癌的主要方法，但依然存在化療效果不佳的問題，其主要原因在于化療藥物不良反應(yīng)大且容易產(chǎn)生耐藥性[2]，因此迫切需要尋找新的治療結(jié)腸癌的藥物。新的靶向藥物的開發(fā)是一個漫長的過程，其成本高、成功率低[3]。開發(fā)已上市藥物新的適應(yīng)癥，已成為加快抗腫瘤藥物發(fā)展的新方向，對優(yōu)化腫瘤治療方案具有重要意義。

研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，阿奇霉素、阿維菌素、克拉霉素、伊維菌素等對腫瘤有良好的抗癌活性。伊維菌素通過促進(jìn)活性氧（reactive oxygen species，ROS）介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑和誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的S期停滯來抑制細(xì)胞增殖，且在體外和體內(nèi)抑制乳腺癌細(xì)胞生長和誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞死亡[6]。塞拉菌素（Selamectin，Sela）是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的家族成員之一，結(jié)構(gòu)與伊維菌素類似，目前被廣泛用于治療河盲癥和其他寄生蟲感染[7]。有研究[8]顯示，Sela通過抑制乳腺癌的克隆性自我更新來抑制生長和轉(zhuǎn)移，通過上調(diào)鈣粘蛋白1（CDH1）和雌激素受體1（ESR1）的表達(dá)來抑制乳腺癌的侵襲。也有研究[9-10]表明，Sela能抑制鼻咽癌細(xì)胞生長，調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞Wnt信號通路，提示Sela有望成為一種新的抗腫瘤藥物。

自噬是一種以形成雙膜自噬體為特征的自降解過程，它隔離多余或有缺陷的細(xì)胞器，并與溶酶體融合后降解封閉的物質(zhì)，以實現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新[11]。過度的自噬或其水平的降低都會影響細(xì)胞的增殖、生存、分化等[12]。在結(jié)腸癌中，可以清楚地觀察到自噬的雙重作用，所以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬也是一種有希望的結(jié)腸癌治療策略[13]。本研究初步探討Sela對SW480細(xì)胞自噬的影響，研究其潛在的作用機(jī)制，以期為Sela治療結(jié)腸癌提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及質(zhì)粒

人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460購自成都飛歐爾生物科技有限公司；pEGFP-LC3及pmCherry-EGFP-LC3質(zhì)粒購自上海艾博思生物科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

RPMI1640培養(yǎng)基（貨號：01-100-1A）、胎牛血清（貨號：04-010-1A）購自以色列Biological Industries公司；Sela（批號：210404，純度＞97%）購自濟(jì)南凱恩醫(yī)藥科技有限公司；凋亡抑制劑Z-VAD-FMK（貨號：HY-16658B）、鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（貨號：HY-100579）、壞死性凋亡抑制劑Necrostatin-1（貨號：HY-15760）購自美國MedChemExpress公司；渥曼青霉素（Wortmannin，貨號：S2758）、羥氯喹 （HCQ，貨號：S4430）購自美國Selleckchem公司；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑（貨號：L3000015）購自美國Invitrogen公司；LC3（貨號：14600-1-AP）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）（貨號：66888-1-Ig）、PhosphomTOR（貨號：67778-1-Ig）、p70S6K（貨號：66638-1-Ig）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；p62（貨號：380612）、GAPDH抗體（貨號：200306-7E4）購自成都正能生物有限責(zé)任公司；蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）（4685）、Phospho-Akt（Ser473）（貨號：4060）、Phospho-p70S6K（Thr389）（貨號：9205）抗體購自美國CST公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（貨號：180-5001）購自上海天能科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250染液（貨號：1610786）購自上海Bio-Rad公司；質(zhì)粒小提試劑盒（貨號：DP104）購自北京天根生物科技有限公司。

1.3 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱、生物安全柜、高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；酶標(biāo)儀測定儀（Molecular Devices公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；電子分析天平（梅特勒-特利多儀器有限公司，美國）；超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）；垂直電泳系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 所有細(xì)胞都使用RPMI1640培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清），于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d進(jìn)行傳代。

1.4.2 細(xì)胞活力測定 將處于對數(shù)期的細(xì)胞按5 000個/孔接種于96孔板中并培養(yǎng)過夜，加入100 μL指定濃度的藥物培養(yǎng)24 h進(jìn)行MTT實驗。培養(yǎng)完成后，在每個孔中加入10 μL 5 g/L MTT并孵化4 h。移除培養(yǎng)基，并向每個孔中加入150 μL DMSO，置于搖床上震蕩10 min。采用酶標(biāo)儀在490 nm處測量吸光度A值，計算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力（%）=（加藥組A值-陰性對照A值）/（空白組A值-陰性對照A值）×100%。

1.4.3 克隆形成實驗 接種于6孔板（300 個/孔）的各組細(xì)胞培養(yǎng)過夜，用指定濃度的Sela連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞7～10 d。菌落用4%的多聚甲醛固定并結(jié)晶紫染色，用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.4.4 蛋白質(zhì)印跡技術(shù) 細(xì)胞給藥24 h后，PBS洗兩次，加入RIPA緩沖液裂解1 h后離心提取總蛋白，采用Bradford對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。每個樣品取約40 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，在4 ℃冰箱過夜孵育一抗。TBST洗膜30 min，37 ℃孵育二抗1 h，TBST洗膜5次后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色。

1.4.5 pEGFP-LC3、pmCherry-EGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗檢測自噬體、自噬溶酶體 pEGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的綠色熒光蛋白（GFP）可用于標(biāo)記及追蹤LC3，當(dāng)自噬發(fā)生時，LC3定位到自噬小體中，因此熒光顯微鏡下的綠色熒光斑點指示自噬體。pmCherry-EGFP-LC3 串聯(lián)熒光蛋白轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的mCherry和GFP可用于標(biāo)記及追蹤 LC3。GFP綠色熒光蛋白對酸性比較敏感，當(dāng)自噬小體與溶酶體發(fā)生融合，形成自噬溶酶體，GFP 熒光將發(fā)生淬滅，只能檢測到紅色熒光。因此，在顯微鏡下紅色的斑點指示自噬溶酶體，而紅綠熒光融合后出現(xiàn)的黃色斑點即指示自噬體。將細(xì)胞以10 000個/孔細(xì)胞的密度均勻接種于24孔板中，待細(xì)胞完全貼壁且密度達(dá)到50%～60%時，分別使用pEGFP-LC3及串聯(lián)pmCherry-EGFP-LC3質(zhì)粒，加入LipofectamineTM3000對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染72 h。在指定濃度的Sela處理24 h后，添加4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，用PBS沖洗兩次，并用防淬滅的固定劑封片，放到共聚焦熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量資料采用（）表示，兩組數(shù)據(jù)間采用獨立樣本t檢驗，多組數(shù)據(jù)間采用單因素方差分析。檢驗水準(zhǔn)α除特別說明外均設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 Sela對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖作用的影響

MTT結(jié)果分析顯示，Sela處理 24 h后，SW480細(xì)胞活力以濃度依賴的方式下降，IC50為18.3 μmol/L，而正常的結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞NCM460則對Sela更具耐受性，其IC50為 41.7 μmol/L（圖 1A）。為了進(jìn)一步證明Sela對SW480細(xì)胞增殖的長期抑制作用，克隆形成結(jié)果表明，Sela明顯減少了SW480細(xì)胞的克隆生成存活率（圖1B），與對照組（0 μmol/L）相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（圖 1C）。

圖1 Sela對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的生長抑制作用

2.2 不同死亡抑制劑處理后對Sela作用下的SW480細(xì)胞活力的影響

采用Sela聯(lián)合一系列死亡抑制劑處理SW480細(xì)胞，結(jié)果所示，只有HCQ（自噬體-溶酶體融合的抑制劑）和Sela的共同處理比Sela單獨處理能引發(fā)更多的細(xì)胞死亡 ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而其他抑制劑，包括Ferrostatin-1（鐵死亡抑制劑）、Necrostatin-1（細(xì)胞壞死抑制劑）和Z-VAD-FMK（Caspase抑制劑）不能恢復(fù)Sela誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，與Sela單獨處理組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示細(xì)胞自噬可能參與了Sela誘導(dǎo)的SW480細(xì)胞死亡（圖2）。

圖2 Sela聯(lián)合不同死亡抑制劑對SW480細(xì)胞活力的影響

2.3 Sela對SW480細(xì)胞自噬的影響

為了探索Sela與自噬之間的關(guān)系，用Sela處理SW480細(xì)胞，測量LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果顯示，Sela以濃度依賴方式明顯誘導(dǎo)LC3-Ⅱ的積累（圖3A）。此外，在Sela處理的細(xì)胞中，外源性GFP-LC3斑點代表的自噬體數(shù)量也明顯增加（圖3B），提示Sela誘導(dǎo)SW480細(xì)胞發(fā)生自噬。

圖3 Sela對SW480細(xì)胞自噬的影響

2.4 Sela對SW480細(xì)胞自噬流的影響

除啟動自噬外，Sela誘導(dǎo)了SW480細(xì)胞中p62的增加，p62是自噬的底物，在溶酶體中進(jìn)行降解，p62表達(dá)上調(diào)可能與自噬體周轉(zhuǎn)不連續(xù)有關(guān)，表明Sela可能抑制自噬流的發(fā)生。串聯(lián)的pmCherry-EGFP-LC3熒光報告實驗也顯示，Sela處理后導(dǎo)致黃色熒光自噬體明顯增加，紅色熒光的自噬溶酶體形成變化不明顯（圖4），表明Sela可能阻斷了SW480細(xì)胞的自噬流。

圖4 Sela對SW480細(xì)胞自噬流的影響

2.5 Sela通過促進(jìn)自噬體積累對SW480細(xì)胞增殖的影響

為確定自噬在介導(dǎo)Sela抑制SW480細(xì)胞增殖的作用，用Sela分別與Wortmannin、HCQ聯(lián)合處理SW480細(xì)胞。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)結(jié)果顯示，抑制自噬啟動和隨后的自噬體形成的Wortmannin減少了LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)換，明顯恢復(fù)了Sela處理的SW480細(xì)胞的增殖抑制。相比之下，破壞自噬體-溶酶體融合并導(dǎo)致自噬體積累的HCQ，增加了LC3-Ⅱ的累積，同時MTT結(jié)果表明，HCQ明顯加劇了Sela誘導(dǎo)的SW480細(xì)胞的增殖抑制（圖5）。

圖5 Sela通過自噬體積累對SW480細(xì)胞增殖的影響

2.6 Sela對SW480細(xì)胞中Akt/mTOR信號通路的影響

Akt/mTOR作為關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控因子，在Akt/mTOR信號通路調(diào)控細(xì)胞自噬方面發(fā)揮著重要作用[14]。為了研究Akt/mTOR信號通路在Sela誘導(dǎo)SW480細(xì)胞自噬中的作用，蛋白免疫印跡檢測Akt和mTOR的激活情況。與對照組0 μmol/L相比，Sela處理導(dǎo)致SW480細(xì)胞中p-Akt、p-mTOR以及下游p-p70S6k的表達(dá)量下調(diào)，提示在一定濃度范圍內(nèi)，Sela可能通過抑制SW480細(xì)胞的Akt/mTOR途徑來誘導(dǎo)自噬（圖6）。

圖6 Sela對SW480細(xì)胞中Akt/mTOR信號通路的影響

3 討論

Sela是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的家族成員之一，主要用于抗寄生蟲感染。越來越多的研究[8-10]表明，Sela在多種腫瘤中具有抗癌活性，但是其在結(jié)腸癌的具體機(jī)制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，Sela能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖，且具有濃度依賴性。當(dāng)用不同死亡抑制劑聯(lián)合處理時，鐵死亡、細(xì)胞壞死及細(xì)胞凋亡抑制劑均不會影響Sela誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，提示Sela誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞生長抑制可能涉及其他機(jī)制。

自噬是一個基本的分解代謝過程，它捕捉不必要的或功能失調(diào)的細(xì)胞成分，并與溶酶體融合進(jìn)行降解[15]。自噬在癌癥治療中的作用是有爭議的[16-17]。一方面，自噬可能促進(jìn)細(xì)胞死亡[18-19]；另一方面，自噬可能在耐藥性方面發(fā)揮支持作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，Sela使SW480細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)換增加，外源性GFP-LC3熒光斑點代表的自噬體形成也明顯增加，以上結(jié)果證實Sela能促進(jìn)SW480細(xì)胞發(fā)生自噬，提示Sela對SW480細(xì)胞的生長抑制可能依賴于細(xì)胞自噬的發(fā)生。在多數(shù)情況下，自噬在癌癥治療的雙重作用，基本上是隨著自噬流的加速而發(fā)生。然而，對于自噬流受損導(dǎo)致的自噬停滯是否在癌癥治療中起作用，知之甚少。本研究中，Sela通過同時啟動自噬和阻斷自噬體-溶酶體融合來誘導(dǎo)自噬停滯，導(dǎo)致自噬體的大量積累。用Wortmannin抑制自噬體的形成可以抵消Sela對SW480細(xì)胞的生長抑制作用，而用HCQ阻斷自噬體-溶酶體融合會增加SW480細(xì)胞對Sela的敏感性，表明自噬體積累可能在Sela抗結(jié)腸癌中發(fā)揮重要作用，Sela可以通過誘導(dǎo)自噬停滯而成為一種有希望的抗腫瘤藥物。研究[20-21]表明，通過Temsirolimus（一種針對mTOR的雷帕霉素衍生物）啟動自噬，結(jié)合HCQ對自噬體-溶酶體融合的阻斷，在黑色素瘤中表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性。誘導(dǎo)自噬啟動加抑制自噬溶酶體形成是否可以成為一種可選的治療策略，還需要進(jìn)一步通過臨床試驗加以證明。

研究[22]表明，Akt/mTOR信號通路對調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、血管生成、遷移和侵襲有重要作用，對Akt/mTOR途徑的抑制可能會通過自噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本研究中發(fā)現(xiàn)，Sela下調(diào)了p-Akt、p-mTOR及p-p70S6k的蛋白表達(dá)水平，提示Sela誘導(dǎo)SW480細(xì)胞自噬，可能與Sela抑制Akt/mTOR信號通路有關(guān)。雖然本研究已經(jīng)初步證明AKT/mTOR信號通路可能參與Sela誘導(dǎo)SW480細(xì)胞自噬的啟動，但Sela導(dǎo)致自噬流受損的具體原因仍然未知，未來可進(jìn)一步探索Sela導(dǎo)致自噬停滯的相關(guān)機(jī)制，并在體內(nèi)動物實驗中進(jìn)一步驗證。

綜上所述，Sela對SW480具有增殖抑制作用，其潛在機(jī)制可能與Sela誘導(dǎo)自噬的發(fā)生以及自噬體的積累有關(guān)，Akt/mTOR信號通路也在其中發(fā)揮重要作用。因此，探討Sela在結(jié)腸癌中的潛在作用，或許可以為結(jié)腸癌的治療提供新的思路。