郭英杰，許錦榮*，林俊顏，劉左玲，左 玲

（1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，廣東湛江 524000；2.廣州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510120；3.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科，廣東湛江 524000）

動脈粥樣硬化是指動脈內(nèi)膜層的斑塊增厚形成，也可累及中膜層的平滑肌，從而引起狹窄，削弱血流，是一種復(fù)雜的全身性、慢性炎癥性、進行性和年齡相關(guān)的動脈內(nèi)膜疾病，是誘發(fā)心血管疾病的影響因素之一。2015 年，超過1 700 萬人死于心血管疾病，占全球死亡總數(shù)的31%[1]。脂肪化合物積聚在斑塊的核心，被纖維帽覆蓋。成纖維細(xì)胞穿透結(jié)締組織和鈣沉積到斑塊導(dǎo)致動脈硬化，最終動脈粗糙的內(nèi)表面可能會導(dǎo)致血栓形成或栓塞[2-3]。大量研究表明，動脈粥樣硬化會影響人類和動物模型中非中風(fēng)患者的大腦認(rèn)知功能。心血管疾病的數(shù)量與老年男女認(rèn)知障礙之間存在直接關(guān)系[4]。在小鼠模型中，主動脈粥樣硬化會引起腦β-淀粉樣變性，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)缺陷[5]。動脈粥樣硬化的等級與記憶的加速衰減有關(guān)[6]。雖然現(xiàn)有治療可適度改善患者的臨床癥狀，并在一定程度上提高生存率，但仍無法根治性治療。淫羊藿是小檗科淫羊藿屬植物，主要成分是生物堿、木脂素、多糖及黃酮4 大類，常用于治療高血壓、冠心病、骨質(zhì)疏松、更年期綜合征、陽痿、半身不遂、四肢麻木等。黃酮類淫羊藿苷（Icaritin，C33H40O15）是淫羊藿中的重要成分之一，對心血管疾病的治療具有一定的作用[7-8]。本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接手段為基礎(chǔ)，分析了Icaritin 治療動脈粥樣硬化的作用，在基于計算機軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)后，確定了該藥用植物的作用機制，以期為新藥的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 資料和方法

1.1 有效活性成分的靶點預(yù)測

以Icaritin 為關(guān)鍵詞，通過PubChem 進行檢索，確定Icaritin 結(jié)構(gòu)信息，然后在Swiss Target Prediction 平臺中檢索有關(guān)結(jié)構(gòu)信息，確定研究所需的靶點信息。

1.2 糖尿病心肌病相關(guān)靶點預(yù)測

選擇GeneCards、OMIM、PharmGkb、DisGeNET、Drugbank 和TTD 數(shù)據(jù)庫以“atherosclerosis”為檢索詞查找動脈粥樣硬化相關(guān)靶點信息。將Icaritin 和動脈粥樣硬化的有關(guān)靶點信息進行對比分析，確定兩者的交集，也就是在Icaritin 治療動脈粥樣硬化方面的作用靶點。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在String 平臺中導(dǎo)入上一步驟獲得的靶點信息，使用Multiple Proteins，將Organism 設(shè)置成Homo Sapiens，接著向Cytoscape version 3.8.2 工具中導(dǎo)入獲得的信息，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)并進行分析，最后獲得研究所需的PPI 關(guān)系圖，再通過其插件CytoHubba 計算獲得Maximal Clique Centrality（MCC）得分前10 的核心靶點。

1.4 靶點Gene oncology（GO）富集及 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路注釋分析

用R 語言軟件對Icaritin 與動脈粥樣硬化的共同作用靶點進行分析，獲得GO 和KEGG 富集分析所需的氣泡圖及條形圖，最后通過轉(zhuǎn)換獲得相應(yīng)的原始基因靶點。

1.5 分子對接

在UniProt 數(shù)據(jù)庫中搜索所選基因編碼的受體蛋白，并將該蛋白的3D 結(jié)構(gòu)下載到RCSBPDB 數(shù)據(jù)庫，從PubChem 數(shù)據(jù)庫下載的Icaritin 2D 結(jié)構(gòu)使用ChemBio3D 軟件最小化能量計算并輸出3D 結(jié)構(gòu)；受體蛋白使用PyMOL 進行脫水；利用AutoDock 軟件對蛋白質(zhì)進行氫化和電荷計算，采用AutoDockVina 進行對接，尋找最佳構(gòu)象。

2 結(jié)果

2.1 Icaritin-動脈粥樣硬化相關(guān)靶點的篩選

Icaritin 的2D 和3D 化學(xué)結(jié)構(gòu)分別見圖1、2。將Icaritin 的化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫預(yù)測并構(gòu)建靶點集，得到Icaritin 的潛在活性成分靶點102 個?；? 個數(shù)據(jù)庫檢索去除重復(fù)靶點后，共獲得動脈粥樣硬化相關(guān)靶點5 300 個（4 793 個來自GeneCards、3 個來自O(shè)MIM、26 個PharmGkb、2 044個來自DisGeNET、39 個來自Drugbank、31 個來自TTD，其中共有1 636 個重復(fù)靶點），見圖3。將上述Icaritin 靶點信息與動脈粥樣硬化靶點信息進行比對并取交集，獲得兩者的共同靶點79 個，見圖4。

圖1 Icaritin 2D 化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖2 Icaritin 3D 化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖3 基于6 個數(shù)據(jù)庫獲得動脈粥樣硬化靶點

圖4 淫羊藿與糖尿病心肌病共同靶點韋恩圖

2.2 Icaritin-動脈粥樣硬化相關(guān)靶點GO 富集分析

經(jīng)R 語言運行后共得到72 個功能，以前20 作為分界，得到GO 富集條形圖和氣泡圖。如富集較少，圖形顏色趨近藍色；如富集較顯著，則圖形顏色趨近紅色，圖像的橫坐標(biāo)代表的是富集數(shù)量。GO 功能富集后富集數(shù)目較多的有protein kinase C activity、protein serine/threonine kinase activity、protein phosphatase binding 和phosphatase binding 等，見圖5、6。

圖5 GO 富集條形圖

2.3 Icaritin-動脈粥樣硬化相關(guān)靶點KEGG 富集分析

經(jīng)R 語言運行后共得到138 個功能，以前20 作為分界，得到KEGG 富集條形圖與氣泡圖。如富集較少，圖形顏色趨近藍色；如富集較顯著，則圖形顏色趨近紅色，圖像的橫坐標(biāo)代表的是富集數(shù)量。KEGG富集通路分析顯示Icaritin 治療動脈粥樣硬化主要通路有Sphingolipid signaling pathway、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Chemical carcinogenesis-receptor activation 和HIF-1 signaling pathway 等，見圖7、8，其中鞘脂信號通路的詳細(xì)通路見圖9、10。

圖6 GO 富集氣泡圖

圖7 KEGG 富集條形圖

圖8 KEGG 富集氣泡圖

圖9 鞘脂信號通路（1）

圖10 鞘脂信號通路（2）

2.4 篩選核心靶點

為確定Icaritin 治療動脈粥樣硬化的潛在樞紐靶點及其之間的相互作用，將上述得到的79 個靶點信息輸入到STRING 網(wǎng)絡(luò)平臺（https://string-db.org/）中，并選擇人類作為物種，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（見圖11）。使用CytoHubba 插件通過MCC 方法進行排序輸出前10的核心靶點，包括腫瘤蛋白P53（TP53）、腫瘤壞死因子（TNF）、絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt1（AKT1）、核因子Kappa-B P65（RELA）、表皮生長因子受體（EGFR）、B 細(xì)胞淋巴瘤-2 樣蛋白1（BCL2L1）、雌激素受體1（ESR1）、熱休克蛋白90αA1（HSP90αA1）、前列腺內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）和核因子Kappa-B1（NFKB1），見圖12。

圖11 PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖12 核心靶點

2.5 分子對接

當(dāng)藥物分子配體與靶點結(jié)合形成構(gòu)象穩(wěn)定性時，能量越低，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。結(jié)合上述篩選出的10 個核心靶點，計算出Icaritin 與核心靶點蛋白之間分子對接的結(jié)合自由能，見表1。Icaritin 與10 個核心靶點蛋白之間的結(jié)合自由能均＜-5 kcal/mol，表明其結(jié)合穩(wěn)定，所有活性化合物均可進入并結(jié)合目標(biāo)蛋白的活性口袋，見圖13。

圖13 分子對接可視化

表1 分子對接的結(jié)合自由能

3 討論

動脈粥樣硬化是常見心血管疾病如冠心病和中風(fēng)的主要原因，而冠心病和中風(fēng)是造成全世界疾病死亡負(fù)擔(dān)的主要原因之一[9]。血管平滑肌細(xì)胞的活力、遷移和積累是動脈粥樣硬化進展過程中形成穩(wěn)定斑塊的重要因素，因此，動脈粥樣硬化的早期診斷及其潛在的分子機制對于動脈粥樣硬化的治療策略至關(guān)重要[10]。Icaritin 是淫羊藿中的主要活性成分，具有廣泛的藥理活性[11]，如神經(jīng)保護[12]、心血管保護[13]，臨床上常用于治療骨質(zhì)疏松癥、動脈粥樣硬化等疾病[14-15]。研究表明，Icaritin 及其代謝物可通過改善炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和細(xì)胞衰老，對心血管疾病具有廣泛的保護作用[13，16]。

我們通過靶點預(yù)測得到Icaritin 作用于動脈粥樣硬化的靶點共79 個，經(jīng)PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選后排在前5 的核心靶標(biāo)主要有TP53、TNF、AKT1、RELA（p65）和EGFR，推測這5 個靶標(biāo)是Icaritin 治療動脈粥樣硬化的關(guān)鍵靶點。蛋白激酶（AKT）是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，可以調(diào)控細(xì)胞遷移、增殖及誘導(dǎo)分化等[17]。文獻報道金雀異黃素可能通過影響磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）/Akt-內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）通路改善血管重塑[18]；TNF 可調(diào)控白介素6（IL6）表達，加重血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害，影響細(xì)胞的增殖和凋亡，介導(dǎo)血管重塑的進程[19]。有研究顯示TP53 在血管重塑的發(fā)展中起重要作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）-p53 介導(dǎo)的血管再生程序能夠逆轉(zhuǎn)血管增殖[21]。RELA（p65）是NF-κB 家族的一個主要成員，有研究發(fā)現(xiàn)抑制NF-κB 等可以改善動脈粥樣硬化[22]。國外研究提示，抑制EGFR 可減少T 細(xì)胞的激活而抑制增殖，是動脈粥樣硬化潛在的治療靶點[23]。EGFR 主要影響低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）信號通路從而改變動脈粥樣硬化進展。Icaritin 治療動脈粥樣硬化主要通過多靶點、多通路發(fā)揮生物學(xué)作用，從而阻斷動脈粥樣硬化患者血管重塑的進程，改善血管功能。分子對接結(jié)果顯示Icaritin 與10 個核心靶點蛋白之間的結(jié)合自由能均小于-5 kcal/mol，表明其結(jié)合形成的結(jié)果穩(wěn)定。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接結(jié)合相互驗證，Icaritin 具有較好的治療動脈粥樣硬化的作用。分子對接結(jié)果也進一步為Icaritin 治療動脈粥樣硬化提供了新的證據(jù)及思路。

GO 分析顯示Icaritin 治療動脈粥樣硬化的預(yù)測靶點參與蛋白激酶C 活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白磷酸酶結(jié)合和磷酸酶結(jié)合等；KEGG 富集分析描述了Icaritin 治療動脈粥樣硬化的預(yù)測靶點參與鞘脂信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、化學(xué)致癌作用-受體激活和HIF-1 信號通路等，這可能是Icaritin 治療動脈粥樣硬化的關(guān)鍵信號通路。KEGG 通路富集結(jié)果也與PPI 網(wǎng)絡(luò)分析及GO富集分析結(jié)果相似，主要富集通路有鞘脂信號通路、AGE-RAGE 信號通路和HIF-1 信號通路。HIF-1 與血管功能密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)HIF-1 抑制劑能有效降低丙酮酸脫氫酶激酶同工酶1（PDK1）活性，從而抑制血管平滑肌增殖，改善血管重塑[24-25]。AGE 及其受體（RAGE）和可溶性RAGE（sRAGE）似與血管重塑的發(fā)病機制有關(guān)。AGE 與RAGE 相互作用后通過促進VSMC 增殖及ECM 積累，抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)血管肥大。AGE 和RAGE 相互作用還可產(chǎn)生活性氧（ROS）以調(diào)節(jié)肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡，收縮肺動脈，從而誘導(dǎo)血管重塑，最終導(dǎo)致動脈僵硬。AGE 的消耗和形成的減少、RAGE 表達的抑制、AGE 與RAGE 配體結(jié)合的阻斷、sRAGE 水平的升高等可能是預(yù)防和減緩血管重塑進展的新靶點[26-27]。故Icaritin-交集靶標(biāo)-動脈粥樣硬化中存在著極為復(fù)雜的關(guān)系，在對動脈粥樣硬化進行治療時，Icaritin 似可通過多種不同的途徑和靶點發(fā)揮治療作用。

綜上，本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)Icaritin可能利用多靶點、多通路抑制氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖以改善動脈血管重塑?，F(xiàn)階段Icaritin 治療動脈粥樣硬化機制的研究較為少見，雖然我們以數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)推導(dǎo)得出結(jié)論，但依舊能夠為相關(guān)科研工作提供參考。