何曉楓，趙祖國(guó)，羅仁幸，彭婉晴，吳坤汝，韋燕蘭，廖顯平，程煒然，王萬黨，金 花

結(jié)核病由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）感染引起，已成為全世界發(fā)病率和致死率最高的傳染性疾病。95% 結(jié)核病死亡者來自包括我國(guó)在內(nèi)的一系列發(fā)展中國(guó)家[1]。目前臨床仍使用一些經(jīng)典的抗癆藥物（如異煙肼、利福平Rif 等）對(duì)其進(jìn)行治療，但這些藥物往往具有不良反應(yīng)大、用藥周期長(zhǎng)、治療方案復(fù)雜、極易引起耐藥等問題[2-3]。因此，設(shè)計(jì)、開發(fā)高效精準(zhǔn)的結(jié)核治療藥物和治療方法對(duì)縮短結(jié)核化療周期、減少毒副作用、提高結(jié)核患者的生活質(zhì)量、防治結(jié)核?。ㄌ貏e是耐藥結(jié)核?。┚哂兄陵P(guān)重要的意義。宿主導(dǎo)向治療（host-directed therapy，HDT）是一種新的、有效的結(jié)核病輔助治療方法，主要通過調(diào)節(jié)宿主對(duì)結(jié)核分枝桿菌各種免疫通路達(dá)到最大限度殺死細(xì)菌和減少炎癥所致組織損傷的目的，是遏制結(jié)核菌及耐藥結(jié)核菌的有效途徑。巨噬細(xì)胞（Mφ）是M.tb在體內(nèi)主要的宿主細(xì)胞及免疫細(xì)胞，但是M.tb在與宿主長(zhǎng)期相互作用過程中，逐漸形成多種逃避殺滅的有效策略，得以在宿主體內(nèi)存活并增殖。其中，結(jié)核菌抑制Mφ 自噬，從而逃逸機(jī)體的免疫殺傷，是結(jié)核菌生存的主要方式。因此，促進(jìn)Mφ 自噬可作為清除Mφ 內(nèi)部的M.tb的有效措施[4-5]。而其他正常細(xì)胞也可以攝取一定量的自噬藥物，從而引起廣泛的機(jī)體毒性。本研究擬通過構(gòu)建具有高M(jìn)φ 靶向性的自噬增強(qiáng)納米藥物，降低機(jī)體毒性，并通過提高藥物的生物相容性，以期實(shí)現(xiàn)高效殺滅胞內(nèi)M.tb的目的。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系

THP-1 人單核細(xì)胞購(gòu)自ATCC 公司（上海），用含有10%胎牛血清（FBS）和1%青/鏈霉素（P/S）的無血清細(xì)胞凍存基礎(chǔ)培養(yǎng)基（RPMI 培養(yǎng)基）于37 ℃，5%CO2中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 主要材料和試劑

RPMI 培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone 公司；FBS 及P/S 購(gòu)自Gibco 公司；聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA-PEG）和PMA（P1585）購(gòu)自sigma 公司；二氯甲烷（CAS：75-09-2）購(gòu)自大茂化學(xué)試劑廠；聚乙烯醇（CAS：9002-89-5）、Rif（CAS：13292-46-1）及D-甘露糖（CAS：3458-28-4）購(gòu)自Macklin 公司；香豆素6（C6，CAS：38215-36-0）購(gòu)自源葉生物；雷帕霉素（Rapa，CAS：NO.R8140）購(gòu)自Solarbio 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG、LC3I、LC3II、P62 及GAPDH 抗體購(gòu)自Beyotime 公司。

1.3 甘露糖修飾的雷帕霉素和利福平納米籠（Man@Rapa/Rif-NCs）構(gòu)建及其表征分析

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA-PEG）與Rapa、Rif 共同溶解在二氯甲烷中作為油相，1% PVA 水溶液（w/v）作為水相，利用油包水的乳化作用原理在高強(qiáng)度機(jī)械力（100 W，3 min）作用下形成乳劑，超純水洗滌，冷凍干燥得到納米顆粒（Rapa/Rif-NCs）。將一定量的甘露糖（Man）溶解在醋酸鈉溶液（0.1 mol/L，pH=4）中使其終濃度為8 μmol/L，再加入PLGA-PEG納米顆粒水溶液（0.1 μmol/L），在室溫下震蕩8 h，濃縮獲得Man@Rapa/Rif-NCs。所得到的產(chǎn)品利用原子力顯微鏡觀察其形貌，并利用納米激光粒度儀測(cè)量產(chǎn)品的粒徑和表面zeta 電位。

1.4 Man@ Rapa/Rif-NCs 納米籠生物安全性分析

取1 mL 小鼠全血，采用EDTA 抗凝，3 000 r/min離心10 min，取紅細(xì)胞沉淀，用PBS 重懸后，加入純水（陽性溶血組）、PBS（陰性對(duì)照組）、不同濃度的納米載藥體（Rapa/Rif、Rapa/Rif-NCs、Man@Rapa/Rif-NCs）。模擬體內(nèi)環(huán)境，37 ℃水浴18 h 后觀察其溶血情況，并檢測(cè)OD540。

1.5 Man@ Rapa/Rif-NCs 對(duì)Mφ 靶向作用分析

將THP-1 細(xì)胞接種到六孔板中，培養(yǎng)至10 萬細(xì)胞/孔，加入100 mmol/L PMA 刺激細(xì)胞[6]，24 h 后，加入羅丹明（Rh）標(biāo)記的自噬納米籠Man@Rh-nanocage（Man@Rh-NCs）孵育一定時(shí)間，用PBS 洗滌細(xì)胞3 次，去除細(xì)胞表面的Man@Rh-NCs 后，換為磷酸緩沖溶液（PBS），用倒置熒光顯微鏡觀察Man@Rh-NCs 被Mφ吸收的情況。

1.6 體內(nèi)靶向活體成像

在納米籠構(gòu)建步驟中，以C6 代替Rapa 和Rif，得到含有熒光標(biāo)記的納米籠顆粒（C6-NCs）。取正常健康C57 小鼠，用磷酸緩沖液（Basal 組）、甘露糖修飾的納米載體（Man@C6-NCs）滴鼻給藥，采用IVIS 小動(dòng)物活體成像儀分析不同修飾的納米籠在小鼠各個(gè)組織器官中的分布。

1.7 構(gòu)建的自噬納米籠Rapa/Rif-NCs 對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用

將THP-1 細(xì)胞接種到六孔板中，加入100 mmol/L PMA 刺激細(xì)胞，24 h 后加入不同藥物作用72 h 后用PBS 洗滌細(xì)胞3 次，采用吖啶橙追蹤藥物處理后細(xì)胞內(nèi)酸性自噬泡（AVOs）的生成；提取細(xì)胞總蛋白，采用免疫印跡法檢測(cè)自噬蛋白LC3II/I 及P62 表達(dá)水平的變化。

1.8 Man@ Rapa/Rif-NCs 對(duì)M.tb 殺傷效果檢測(cè)

藥物對(duì)胞外BCG 菌株的殺傷療效檢測(cè)：細(xì)菌經(jīng)純培養(yǎng)基（Medium 組）、Rapa/Rif、Rapa/Rif-NCs、Man@Rapa/Rif-NCs、Man@Rapa/Rif-NCs+3-MA 分別作用72 h 后，涂板，37 ℃孵育3～4 周后計(jì)菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)中原藥或納米籠中負(fù)載的Rif 質(zhì)量濃度為10 μg/L，Rapa 質(zhì)量濃度為10 mg/L。自噬抑制劑3-MA 質(zhì)量濃度為10 mg/L。

藥物對(duì)Mφ 內(nèi)BCG 菌株的殺傷療效檢測(cè)：將THP-1細(xì)胞接種到共聚焦培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至40 萬細(xì)胞/孔，加入100 mmol/L PMA 刺激細(xì)胞，24 h 后用M.tb菌株BCG感染Mφ（感染復(fù)數(shù)MOI=1），4 h 后用PBS 洗滌細(xì)胞，去除細(xì)胞表面的細(xì)菌后分別加入純培養(yǎng)基（Medium組）、Rapa/Rif、Rapa/Rif-NCs、Man@Rapa/Rif-NCs、Man@Rapa/Rif-NCs+3-MA 作用72 h，清洗細(xì)胞，用蒸餾水裂解細(xì)胞并涂板，37 ℃孵育3～4 周后計(jì)菌落數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 Man@ Rapa/Rif-NCs 納米籠的表征特點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖1A），所制備的具有Mφ 靶向功能的無修飾、無載藥的納米籠Blank NCs 粒徑為（70±18）nm，雙載藥納米籠Rapa/Rif-NCs 粒徑約為（132±29）nm，而甘露糖分子修飾的雙載藥納米籠Man@Rapa/Rif-NCs 粒徑為（222±41）nm。經(jīng)甘露糖分子修飾的雙載藥納米籠的表面zeta 電位為+77.4 mV（圖1B），說明甘露糖分子成功融合在納米籠的表面，且相對(duì)穩(wěn)定，不容易發(fā)生聚集。未經(jīng)修飾的雙載藥納米籠的表面zeta 電位約為0 mV，呈規(guī)則球形（圖1C）。

圖1 構(gòu)建的納米籠的粒徑、表面電位及形貌表征

2.2 Rapa/Rif@Man-NCs 納米籠的生物安全性及Mφ靶向性分析

在藥物質(zhì)量濃度為10 μg/L 的條件下，所制備的藥物肉眼所見無明顯溶血現(xiàn)象（圖2A）。以（實(shí)驗(yàn)組OD540 -陰性對(duì)照OD540）/陰性對(duì)照OD540 的值作為縱坐標(biāo)繪制溶血程度直方圖，以代表藥物溶血性的定量表征，結(jié)果顯示，所制備的Rapa/Rif-NCs 及Man@Rapa/Rif-NCs 納米籠不會(huì)造成溶血（圖2B），說明該納米藥物生物安全性良好。構(gòu)建的抗結(jié)核化療藥物納米籠可被Mφ 攝取（圖2C、D）。進(jìn)一步對(duì)其表面修飾甘露糖分子后，發(fā)現(xiàn)納米載體被Mφ 的攝取量增加了3倍（圖2E）。

圖2 Man@ Rapa/Rif-NCs 生物安全性、生物相容性及巨噬細(xì)胞靶向性

2.3 Man@ Rapa/Rif-NCs 納米籠在體內(nèi)靶向性分析

活體成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，構(gòu)建的納米載體主要聚集在肝臟和肺臟。其中，未經(jīng)C6-NCs 很快被機(jī)體清除，而經(jīng)甘露糖修飾后可以在體內(nèi)滯留時(shí)間大于24 h，同時(shí)納米載體在肺臟的滯留量也大大增加。

圖3 構(gòu)建的自噬納米籠的體內(nèi)器官靶向性的表征

2.4 Man@Rapa/Rif-NCs 納米籠對(duì)Mφ 自噬誘導(dǎo)及胞內(nèi)M.tb 抑制作用分析

自噬誘導(dǎo)劑Rapa 能明顯誘導(dǎo)Mφ 自噬，而自噬抑制劑3-MA 明顯抑制了Mφ 的自噬，“納米籠”的負(fù)載能顯著加強(qiáng)Rapa 的自噬效果，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 構(gòu)建的自噬納米籠對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的影響

2.5 Man@Rapa/Rif-NCs 對(duì)M.tb 殺傷效果檢測(cè)結(jié)果

通過計(jì)算（菌落涂板計(jì)數(shù)結(jié)果/涂板所用液量）得到菌液中M.tb的含量（CFU/mL）并以此作為縱坐標(biāo)繪制直方圖（圖5）。Rapa/Rif-NCs 組對(duì)胞外BCG 抑制率可達(dá)80%以上（P＜0.01），見圖5A。Man@Rapa/Rif-NCs 組在胞外及胞內(nèi)殺傷均有較好的效果（P＜0.01），且在胞內(nèi)殺傷實(shí)驗(yàn)中，Man@Rapa/Rif-NCs 組未檢出可疑菌落，說明自噬納米藥物對(duì)胞內(nèi)結(jié)核菌的殺傷效果良好。而聯(lián)合使用自噬抑制劑3-MA 與誘導(dǎo)自噬雙載藥物納米籠Man@Rapa/Rif-NCs 對(duì)胞內(nèi)菌的殺傷效率有所下降，見圖5B。

圖5 構(gòu)建的納米籠對(duì)胞內(nèi)和胞外結(jié)核桿菌抑制率的影響

3 討論

甘露糖受體是先天免疫系統(tǒng)中重要的模式識(shí)別受體和內(nèi)吞受體，主要表達(dá)于Mφ 表面，可高效靶向Mφ并被其攝取[7-8]。鑒于小分子化療藥物如利福平、雷帕霉素等，具有良好的生物活性，二者聯(lián)用可以在臨床抗結(jié)核治療中具有很好的前景。但小分子藥物本身又具有毒副作用大、脫靶性、生物相容性和利用度低等一系列問題，使其療效和臨床應(yīng)用都受到很大限制。納米載藥系統(tǒng)可以通過功能化修飾實(shí)現(xiàn)靶向遞送，將藥物、基因或抗體等直接運(yùn)送到疾病部位的組織或細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)藥物的靶向輸送以及到達(dá)靶點(diǎn)后的定向釋放[4]。

臨床化療藥物利福平進(jìn)入體內(nèi)后，對(duì)Mφ 內(nèi)M.tb的殺傷效果差，結(jié)核患者病情緩解較慢，需大劑量長(zhǎng)期用藥（6～12 個(gè)月以上）。而高劑量的藥進(jìn)入體內(nèi)后，殺傷Mφ 內(nèi)M.tb的同時(shí)，由于脫靶性，藥物也會(huì)大量進(jìn)入其他正常細(xì)胞，從而引起對(duì)機(jī)體的嚴(yán)重不良反應(yīng)[9]。前期研究表明，細(xì)胞自噬是破壞胞內(nèi)感染菌的重要方法[10]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)M.tb已經(jīng)進(jìn)化出多種機(jī)制以干擾自噬介導(dǎo)的M.tb清除路徑，從而使其逃避細(xì)胞的免疫攻擊，使其在胞內(nèi)存活和復(fù)制[11]。

本研究中，制備了負(fù)載抗結(jié)核藥物和自噬誘導(dǎo)劑的納米籠，并通過對(duì)其進(jìn)行甘露糖的表面修飾，增加了其對(duì)巨噬細(xì)胞的靶向性，表明所制備的納米籠具有很好的生物安全性，不會(huì)引起紅細(xì)胞溶血；同時(shí)，“納米籠”具有很好的生物相容性，能快速被Mφ 吞噬，從而將負(fù)載的藥物成功輸送到宿主細(xì)胞內(nèi)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，小鼠滴鼻給藥后，靶向納米籠可以富集在肺部。

機(jī)體內(nèi)Mφ 與結(jié)核菌的相互作用影響結(jié)核菌的發(fā)展和生存，增強(qiáng)Mφ 對(duì)胞內(nèi)M.tb的殺滅能力，成為抑制結(jié)核病發(fā)展的重要策略。而通過誘導(dǎo)Mφ 自噬以及自噬溶酶體的成熟在殺滅M.tb中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。圖4 中，我們利用裝載自噬誘導(dǎo)劑Rapa 的納米籠及自噬抑制劑3-MA，對(duì)比了自噬對(duì)Mφ 內(nèi)結(jié)核菌清除的影響，結(jié)果顯示，自噬可以促進(jìn)胞內(nèi)M.tb的清除，而抑制自噬則有利于M.tb的生長(zhǎng)。

綜上所述，本研究中我們成功構(gòu)建了具有高M(jìn)φ靶向性、高生物相容性及高安全性的自噬“納米籠”，并基于該納米載體構(gòu)建了具有自噬增強(qiáng)作用的納米載體系統(tǒng)，用于抗結(jié)核藥物的裝載和Mφ 靶向輸送，通過結(jié)合增強(qiáng)Mφ 自噬引發(fā)的免疫反應(yīng)和Mφ 內(nèi)的抗結(jié)核藥物對(duì)M.tb直接殺傷，可更高效地殺滅胞內(nèi)M.tb。