楚蕾蕾，高國偉，楊楨楨，楊留勤，武莉萍

1 新鄉(xiāng)醫(yī)學院第四臨床學院，河南新鄉(xiāng) 453000；2 新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院放療科

原發(fā)性肝癌是全球第六大常見的癌癥，同時也是全球第三大癌癥死亡的原因。原發(fā)性肝癌是導致全球男性死亡的因素第二位［1］。多數(shù)原發(fā)性肝癌患者確診時病情已進展至晚期，預后不良［2］。原發(fā)性肝癌的易轉移、易復發(fā)是導致患者生存率不高的主要原因［3］。分子靶向藥物和免疫制劑的研究成為肝癌治療的熱點［4］，進一步研究［5］發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞的代謝重編程可能與其耐藥性密切相關。在一項動物模型研究［6］中發(fā)現(xiàn)，抑制已糖激酶Ⅱ（HK2）表達可減少肝癌細胞的增殖，且對小鼠沒有明顯不良反應。與人正常肝細胞相比，肝癌細胞過表達HK2，而沉默HK2 表達可不僅癌細胞的凋亡，抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展［7］。楝酰胺（Rocaglamide，Roc-A）是一類從米仔蘭植物屬中提取的一種抗腫瘤物質(zhì)［8］，其抗腫瘤活性的報道最早可追溯到1973 年［9］。Roc-A 不僅具有抗炎、保護正常組織免受損傷等作用，還具有特異性抑制腫瘤生長和選擇性保護正常細胞的雙重作用。Roc-A 可通過抑制熱休克因子（HSF1）表達，使硫氧還蛋白互作蛋白（TXNIP）表達增加引起葡萄糖攝取減少來抑制糖酵解；還通過激活MAPK p38 和JNK信號通路及抑制Ras-CRaf-MEK-ERK 信號通路誘導細胞凋亡［10］。近年來已有多項研究深入探討Roc-A抗腫瘤活性的具體作用機制，但Roc-A 是否通過抑制HK2 表達，促進肝癌細胞的凋亡相關研究較少。2020 年6 月-2021 年8 月，我們觀察了加入不同濃度Roc-A 培養(yǎng)的肝癌細胞的凋亡情況，并對其可能作用機制進行探討，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人肝癌細胞株HepG2 購自賽百慷生物技術股份有限公司；Roc-A 購自Med-ChemExpress 公司（64166）；二甲基亞砜購自北京索萊寶公司（1129E035）；MEM 培養(yǎng)基、PBS 購自美國HyClone 公司；胎牛血清購自澳洲Invigentech 公司；YF488-Annexin V/PI 細胞凋亡試劑盒購自US Everbright Inc；HK2（DF6176）、抑凋亡因子類似物（BCL2L1，AF6139）、β-actin（AF7018）購自Affinity 公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自江蘇碧云天公司；cDNA合成試劑盒（00983513）購自Takara 公司（00983513）；HK2、BCL2L1 引物序列購自金唯智公司；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱、酶標儀、分光光度計、臺式高速常溫離心機、熒光顯微鏡購自美國Thermo 公司；Q Exactive 質(zhì)譜儀、Orbitrap Fusion 質(zhì)譜儀、Q Exactive HF 質(zhì)譜儀購自ThermoFisher 公司；化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；電泳儀、電泳槽購自美國BIO-RAD 公司；PCR 儀購自France公司。

1.2 加入不同濃度Roc-A 培養(yǎng)的HepG2 細胞凋亡情況觀察 采用YF488-Annexin V/PI 熒光雙染法。取適量HepG2 細胞，置于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的MEM 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液1 次。當細胞生長至90%左右，胰蛋白酶進行消化傳代，按1：3 比例傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期HepG2細胞，貼壁培養(yǎng)于6孔板，分為5組，分別加入0（空白對照）、25、50、100、200 nmol/L的Roc-A溶液，培養(yǎng)24 h時取各組細胞，加Annexin V的結合緩沖液、YF488-Annexin V 和PI 的混合液共50 μL，避光孵育30 min，沖洗，加Hochest 20 μL，避光孵育15 min，在合適的熒光下用熒光顯微鏡觀察各組細胞凋亡情況胞。對細胞進行計數(shù)，測算各組細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/全部細胞數(shù)×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.3 加入不同濃度Roc-A培養(yǎng)的HepG2細胞HK2、BCL2L1 mRNA 檢測 取對數(shù)生長期HepG2 細胞，分為2 組，分別加入0（空白對照）、100 nmol/L 的Roc-A 溶液，培養(yǎng)24 h 時取2 組細胞，RT-qPCR 法檢測HK2、BCL2L1 mRNA。RNA試劑盒提RNA，cDNA試劑盒反轉錄，根據(jù)試劑盒說明書進行，熒光染料SYBR 進行定量實時PCR，PCR 反應條件：95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 個循環(huán)。熒光強度與循環(huán)數(shù)作圖，生成擴增曲線。HK2 引物序列：上游引物5′-GAGCCACCACTCACCCTACT-3′，下游引物5′ -CCAGGCATTCGGCAATGTG-3′。BCL2L1 引物序列：上游引物5′-GTCTTCGCTGCGGAGATCAT-3′，下游引物5′-CATTCCGATATACGCTGGGAC-3′。β-actin 引物序列：上游引物5′-TCTGGCACCACACCTTCTAC-3′，下游引物5′-TCTGGCACCACACCTTCTAC-3′。以2-ΔΔCt（Ct 代表循環(huán)閾值）值表示代表HK2、BCL2L1 mRNA的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.4 加入不同濃度Roc-A培養(yǎng)的HepG2細胞HK2、BCL2L1 蛋白檢測 ①取適量HepG2 細胞，分為3組，分別加入0（空白對照）、100、200 nmol/L的Roc-A，培養(yǎng)24 h 提取樣品，進行超聲裂解、丙酮沉淀、酚抽提，測定蛋白濃度，進行蛋白酶解與TMT 標記，質(zhì)譜上機與數(shù)據(jù)處理，采用蛋白組學質(zhì)譜分析（TMT）法對樣品進行LC-MS/MS 分析。用Foldchange 來評估蛋白在樣品間的表達水平變化倍數(shù)，經(jīng)t檢驗計算的P值表現(xiàn)蛋白間差異的顯著程度（差異篩選條件：Foldchange≥1.5 倍且P＜0.05），將數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。②采用Western Blotting 法檢測HK2、BCL2L1蛋白。取對數(shù)生長期HepG2 細胞分為5 組，分別加入0、25、50、100、200 nmol/L 的Roc-A 溶液，培養(yǎng)24 h 時取各組細胞，冰上裂解離心，提取上清蛋白，BCA 法測濃度，取樣品50 μg，上樣電泳，轉PVDF膜，加一抗，4 ℃過夜，TBST 洗膜，加二抗（1∶10 000），顯影，用Image J 軟件測蛋白的灰度值，以目的條帶與β-actin 條帶灰度值比值為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次，取平均值

1.5 癌組織HK2 表達與肝癌患者的生存時間關系分析 采用Kaplan Meier Plotter 癌癥數(shù)據(jù)庫分析癌組織HK2 表達與肝癌患者生存時間的關系。Kaplan Meier Plotter癌癥數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/analysis），它是對21 種腫瘤（包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌及胃癌）超過54 000 個基因（數(shù)據(jù)類型包括芯片數(shù)據(jù)、高通量測序數(shù)據(jù)，涉及mRNA、miRNA、蛋白和DNA）進行生存分析。其數(shù)據(jù)主要來源于GEO、EGA 和TCGA 數(shù)據(jù)庫，通過Kaplan-Meier 算法分析癌組織HK2 表達水平與肝癌患者預后之間的關系［11］。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 軟件、Graphpad prism 9.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用P-P 圖檢驗資料的正態(tài)性，成正態(tài)分布的計量資料以表示，兩組均數(shù)間比較采用Dunnett-t檢驗，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的計量資料用［M（P25，P75）］表示，組間比較采用秩和檢驗；生存曲線用Kaplan-Meier 法繪制，采用Log-ranktest進行統(tǒng)計檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 加入不同濃度Roc-A 培養(yǎng)的HepG2 細胞凋亡率比較 加入0、25、50、100、200 nmol/L 的Roc-A 溶液HepG2 的細胞凋亡率分別為0.83% ± 0.21%、9.46% ± 2.34%、24.68% ± 4.22%、39.60% ±2.16%及58.63%±1.62%，組間兩兩比較，F(xiàn)=8 807，P＜0.05。

2.2 加入不同濃度Roc-A培養(yǎng)的HepG2細胞HK2、BCL2L1 mRNA相對表達量比較 培養(yǎng)24 h時，加入0、100 nmol/L Roc-A 溶液的HepG2 細胞HK2 mRNA相對表達量分別為1.02 ± 0.02、0.16 ± 0.05（t=63.39，P＜0.05）；BCL2L1 mRNA 相對表達量分別為0.98±0.05、0.17±0.08（t=52.32，P＜0.05）。

2.3 加入不同濃度Roc-A培養(yǎng)的HepG2細胞HK2、BCL2L1 蛋白相對表達量比較 TMT 法檢測加入0、100、200 nmol/L Roc-A 的HepG2細胞HK2蛋白相對表 達量 分 別為1.29 ± 0.02、0.79 ± 0.02、0.85 ±0.03，組間兩兩比較，F(xiàn)=10 932，P＜0.05；BCL2L1 蛋白相對表達量分別為1.49 ± 0.07、0.77 ± 0.06、0.84±0.03，組間兩兩比較，F(xiàn)=155.3，P＜0.05。

WESTERN Blotting 法檢測培養(yǎng)24 h 時加入0、25、50、100、200 nmol/L Roc-A 溶液培養(yǎng)的HepG2 細胞HK2 蛋白相對表達量分別為0.54±0.01、0.51±0.04、0.22 ± 0.01、0.13 ± 0.02、0.15 ± 0.03，組間兩兩比較，F(xiàn)=3158，P＜0.05。加入0、25、50、100、200 nmol/L Roc-A 溶液培養(yǎng)的HepG2 細胞BCL2L1蛋白相對表達量分別為0.86 ± 0.08、0.75 ± 0.04、0.45±0.03、0.35±0.04、0.30±0.02，組間兩兩比較，F(xiàn)=266.2，P＜0.05。

2.4 癌組織不同HK2 表達的肝癌患者生存時間比較 在Kaplan Meier Plotter 癌癥數(shù)據(jù)庫共篩選3 099個數(shù)據(jù)。與癌組織HK2 高表達的肝癌患者比較，HK2 低表達的肝癌患者的生存時間更長（P=0.0009）。

3 討論

1982年第一個生物活性物質(zhì)Roc-A被學者［12］從Aglaia elliptifolia 中分離出來，并在小鼠白血病模型中被證明能延長生存時間。迄今為止，從30 多種Aglaia 物種中分離出了100 多種天然的環(huán)戊烷并苯并呋喃類化合物，其中一類Roc-A 被證明有抗腫瘤活性［13］，可通過將真核翻譯起始因子4A（eIF4A）作用于特定的RNA 序列之間的雙分子腔來發(fā)揮作用［8］。Roc-A不僅可以抑制癌細胞的增殖，也能促進癌細胞的凋亡［14-15］。除抗癌活性外，Roc-A 還能保護原代細胞免受化療誘導的細胞死亡，減輕神經(jīng)元組織的炎癥和藥物誘導的損傷［10］。除此之外研究［16］還發(fā)現(xiàn)，Roc-A可選擇性調(diào)節(jié)癌細胞的能量代謝。

目前癌癥能量代謝成為抗腫瘤機制研究的熱點，腫瘤細胞的能量代謝重編程還與化療耐藥密切相關［17］，并且能量代謝過程中關鍵酶的變化影響糖酵解過程和乳酸的產(chǎn)生，導致腫瘤耐藥性產(chǎn)生，進而促進腫瘤細胞生長轉移［18］。而肝癌細胞可能是能量代謝重編程最全面的細胞［19］。最早發(fā)現(xiàn)的有氧糖酵解，主要參與肝癌的增殖、免疫逃逸、侵襲、轉移、血管生成和耐藥性的調(diào)控［20］。已糖激酶作為糖酵解的第一個限速酶，有四種亞型（HK1、HK2、HK3 和HK4），HK2 在肝癌組織中高表達，與病理分期和預后直接相關［21］。HK2 的過表達在許多類型的癌癥中一直被報道，如促進乳腺癌［22］、胰腺癌［23］等腫瘤細胞的生長、增殖和轉移。我們通過分析KM-Plotter的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)肝癌患者中HK2 的表達與總生存時間有關，且HK2 表達水平越高的患者生存時間越短，因此HK2 的表達水平可能與其預后不良相關。抑制HK2的表達，使HK2和電壓依賴型陰離子通道蛋白1（VDAC-1）之間的相互作用被破壞，促凋亡蛋白Bax可以更有效地與細胞膜上的VDAC-1結合，細胞膜通透性增加，細胞色素C釋放增加，從而誘導細胞凋亡［24］。張宇等［25］發(fā)現(xiàn)，沉默HK2 表達可顯著降低HepG2 細胞增殖活性，顯著升高HepG2 細胞凋亡率。分化差的肝癌細胞HLE 中HK2低表達，HLE 細胞依賴谷氨酰胺進行三羧酸循環(huán)，而分化良好的肝癌細胞HUH7 中HK2 高表達，這種細胞依賴葡萄糖和谷氨酰胺進行三羧酸循環(huán)進行能量代謝［26］。這說明不同分化程度的肝癌細胞代謝方式有所不同。

最新研究［27］發(fā)現(xiàn)，手術切除的肝癌組織標本中HK2 的表達明顯高于鄰近組織、正常組織，HK2 高表達與肝癌患者的預后不良具有顯著相關性。過表達HK2 促進乳糖代謝，細胞遷移侵犯，而敲除HK2基因完全相反，說明HK2 促進肝癌細胞的糖酵解，促進肝癌細胞的侵犯、轉移等。HK2 siRNA 轉染HepG2和Hep3B能顯著下調(diào)肝癌細胞葡萄糖和乳酸的消耗量，用雷帕霉素（mTOR 抑制劑）處理HepG2和Hep3B 能顯著下調(diào)HK2 mRNA 和HK2 蛋白以及葡萄糖和乳酸的消耗。這些結果提示mTORSTAT3-HK2 通路參與調(diào)節(jié)肝癌細胞的糖酵解，這使得我們有可能通過干預肝癌細胞的糖酵解來治療肝癌患者［28］。核糖體RNA 加工蛋白15（RRP15）在肝癌細胞中明顯高表達，與預后不良顯著相關，基因敲除RRP15能抑制HCC 增殖，體內(nèi)實驗和體外實驗均能證明這一點。

研究［29］發(fā)現(xiàn)RRP15 敲除使得肝癌細胞Hep3B細胞通過HK2 途徑改變能量攝取方式：未敲除基因的戊糖磷酸化變?yōu)榍贸蟮恼５木€粒體氧化磷酸化，這一變化導致凋亡的發(fā)生。其他研究結果進一步驗證相比正常細胞和組織，肝癌腫瘤組織和細胞HK2 高表達，用黃岑純化物藥物處理下調(diào)HK2 表達，能下降葡萄糖攝取能力，使得Bax 從細胞胞漿釋放入線粒體中，從而導致肝癌細胞凋亡。肝癌組織小鼠體內(nèi)移植實驗也證明這一點［30］。金雀異黃酮處理肝癌細胞研究［31］結果同上，金雀異黃酮抑制糖酵解誘導肝癌細胞線粒體凋亡。有氧糖酵解促進肝癌細胞轉移并和預后不良密切相關，HK2 是有氧糖酵解的關鍵組成。組成型光形態(tài)建成信號傳導復合體9（COP9）信號體復合體的第五組分（COPS5/CSN5）。沉默表達CSN5導致HK2蛋白明顯減少，抑制HK2 表達能抵消CSN5 的糖酵解作用。通過實驗發(fā)現(xiàn)HK2是糖酵解的關鍵，控制HK2的表達就能控制肝癌細胞的侵襲、轉移和凋亡［32］。穗花杉雙黃酮具有抗腫瘤活性，而對正常細胞的活性沒有明顯影響。體內(nèi)體外實驗［33］發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮能誘導肝癌細胞凋亡，同時研究發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮能通過下調(diào)HK2 來抑制肝癌細胞糖酵解。這兩者具有相關性。進一步研究發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮通過ROS，抑制JAK2/STAT3通路來下調(diào)HK2的表達。

HK2 是糖酵解的關鍵，多種藥物和生物技術手段能通過下調(diào)HK2 的表達來發(fā)揮抗腫瘤活性，抑制肝癌細胞的轉移侵襲，促進肝癌細胞的凋亡。而我們的實驗發(fā)現(xiàn)Roc-A 通過抑制糖酵解的過程并促進肝癌細胞的凋亡，并呈濃度依賴性，且證實HK2 的表達下降、BCL2L1 的表達下降。因此，我們推測，HK2 在線粒體上的減少，Bax 更容易獲得VDAC-1，VDAC-Bax 復合物的形成能通過細胞色素C 等促凋亡蛋白，從而誘導細胞凋亡。抑制HK2 表達時，促進Bax 與VDAC 的結合，細胞凋亡明顯增加。而腫瘤細胞中HK2 表達的調(diào)控是多樣的，與糖酵解途徑中的其他酶一樣，HK2 的表達主要受c-myc、HIF-1α和p53 的調(diào)控［34］。此外，miR-143、miR-155、miR-218和lincRNA-RoR 等microRNAs 被證明能夠調(diào)節(jié)HK2的表達［35-38］。SANTAGA 等［39］發(fā)現(xiàn)Roc-A 是HSF1 激活的最強抑制劑。本研究結果發(fā)現(xiàn)，HK2 的減少伴隨著癌細胞凋亡的增加，而HK2 的減少對楝酰胺在肝癌中發(fā)揮抗腫瘤活性起著關鍵作用，但楝酰胺影響HK2表達的確切機制仍需進一步研究。

綜上所述，加入Roc-A 培養(yǎng)可促進肝癌細胞的凋亡，并且細胞凋亡與Roc-A 溶液濃度呈正相關，細胞HK2、BCL2L1 mRNA 及蛋白表達均降低。Roc-A可能通過抑制BCL2L1 mRNA 及蛋白表達，增加肝癌細胞的膜通透性，抑制抗凋亡蛋白表達，促進肝癌細胞的凋亡。但本研究僅Roc-A 促進肝癌細胞凋亡的相關機制進行了初步探討，詳細的分子機制尚有待進一步研究。