楊嵐，張佳明，方梅飛，黃玉曉，蔣蘭嵐，陶人川

1 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周粘膜科，南寧 530000；2 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會(huì)口腔感染性疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 廣西口腔頜面修復(fù)與重建研究自治區(qū)級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4 頜面外科疾病診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；5 廣西顱頜面畸形臨床醫(yī)學(xué)研究中心

2 型糖尿病是一種環(huán)境和/或遺傳因素引起的，以糖代謝異常為主要特征的慢性疾?。?］。我國(guó)是目前全球患糖尿病人數(shù)最多的國(guó)家，其中90%以上的患者為2 型糖尿病［2］。臨床研究［3］表明，2 型糖尿病可升高牙周炎的患病風(fēng)險(xiǎn)及病情嚴(yán)重程度，牙周炎也可影響患者的血糖控制［4-5］。口腔微生物是糖尿病與牙周炎相互作用的聯(lián)系機(jī)制之一，微生物可通過各種酶、毒素及代謝物等發(fā)揮炎癥作用，促進(jìn)2型進(jìn)糖尿病發(fā)展，同時(shí)糖尿病引起的人體IL-17上調(diào)可導(dǎo)致口腔微生物群的致病性更強(qiáng)［6］。近年來逐漸有學(xué)者［7］采用16S rDNA 擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)分析健康牙周狀態(tài)與牙周炎癥狀態(tài)下的齦下微生物顯著差異，但16S rDNA 測(cè)序技術(shù)往往只能檢測(cè)到菌屬或部分菌種，精確度有限。隨高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，鳥槍法宏基因組測(cè)序技術(shù)能鑒定更多的物種并進(jìn)一步分析微生物基因編碼的各項(xiàng)功能［8］。目前，關(guān)于2型糖尿病伴牙周炎患者齦下菌斑微生物群落結(jié)構(gòu)組成及其功能相關(guān)報(bào)道較少。為此，我們運(yùn)用鳥槍法宏基因組測(cè)序技術(shù)，對(duì)2 型糖尿病伴牙周炎患者齦下菌斑中的菌群結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019 年7 月—10 月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科就診的單純牙周炎患者3 例、廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科門診就診的2 型糖尿病患者包括伴牙周炎患者2 例不伴牙周炎患者2 例，及性別及年齡相匹配的健康志愿者3 例。2 型糖尿病患者包括伴牙周炎患者年齡（65.50±9.89）歲，空腹血糖（6.90±0.14）mmol/L，糖化血紅蛋白C（HbAlc）6.66%±0.51%，牙周探診深度PD（4.32 ± 1.52）mm，附著喪失AL（4.53 ±1.40）mm；2 型糖尿病不伴牙周炎患者年齡（66.50±2.12）歲，空腹血糖（5.48±0.18）mmol/L，HbAlc6.11%±0.27%，PD（2.46±0.07）mm；單純牙周炎患者年齡（47.67 ± 3.79）歲，空腹血糖（5.30 ±0.26）mmol/L，HbAlc ＜6.50%，PD（4.55 ±0.57）mm，AL（4.55 ± 0.57）mm；健康志愿者年齡（46.00±8.72）歲，空腹血糖（5.00±0.26）mmol/L，HbAlc ＜6.50%，PD（2.19 ± 0.09）mm。糖尿病患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①2 型糖尿病病情穩(wěn)定1 年以上，無其他嚴(yán)重并發(fā)癥；②3 個(gè)月內(nèi)用藥、飲食和運(yùn)動(dòng)習(xí)慣均無明顯改變。牙周炎患者納入標(biāo)準(zhǔn)：至少兩顆不相鄰患牙的鄰間附著喪失或至少兩顆牙的頰唇/舌腭側(cè)臨床附著喪失≥3 mm 伴牙周袋＞3 mm。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有長(zhǎng)期吸煙病史、飲酒史；②口腔或者其他部位有明顯急性感染；③3 個(gè)月內(nèi)有使用抗生素、激素；④3 個(gè)月內(nèi)接受過潔治、刮治等牙周治療；⑤全口天然牙＜20 顆。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：2020010），與受試者簽署知情同意書。

1.2 受試者齦下菌斑菌群結(jié)構(gòu)及功能分析

1.2.1 齦下菌斑采集及細(xì)菌DNA 提取 受試者禁食2 h，選取2 型糖尿病伴牙周炎患者與單純牙周炎患者每個(gè)象限牙周袋最深位點(diǎn)為采樣位點(diǎn)，隨機(jī)抽取2 型糖尿病不伴牙周炎患者及健康者4 個(gè)位點(diǎn)作為采樣位點(diǎn)。清除擬采樣牙的齦上菌斑，使用無菌Gracy 刮治器，刮取齦下菌斑，并置入含0.25 mL ddH2O的凍存管中，置入液氮凍存。采用E.Z.N.A.Stool.?DNAKit 試劑盒提取各齦下菌斑樣本中的DNA，50 μL Elution buffer 洗脫，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 齦下菌斑菌群結(jié)構(gòu)及功能分析 用聯(lián)川自主研發(fā)的試劑盒進(jìn)行paired end文庫(kù)構(gòu)建，文庫(kù)質(zhì)檢合格后用HiSeq4000 進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序模式為PE150。文庫(kù)構(gòu)建主要步驟如下圖所示，包括：基因組DNA 用超聲打斷、DNA 片段末端修復(fù)、加′A′ 堿基至DNA 片段的3’末端、加測(cè)序接頭、片段選擇、PCR擴(kuò)增、文庫(kù)質(zhì)檢、上機(jī)測(cè)序。本部分由聯(lián)川生物有限公司協(xié)助完成。使用cutadapt v1.9軟件獲取測(cè)序數(shù)據(jù)，利用fqtrim v0.94 軟件對(duì)低質(zhì)量的reads 進(jìn)行裁剪，bowtie2 v2.2.0 軟件將reads 與宿主基因組進(jìn)行比對(duì)，去除宿主污染。通過IDBA-UD 軟件重新組裝經(jīng)過質(zhì)量過濾的reads，以構(gòu)建每個(gè)樣本的宏基因組。利用MetaGeneMark v3.26軟件預(yù)測(cè)宏基因組contigs 的所有編碼區(qū)域（CDS，Coding Region），根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行過濾和去冗余，隨后通過CD-HIT v4.6.1 軟件聚類得到unigenes，并計(jì)算各基因在每個(gè)樣品中的豐度信息以估算樣本的Unigene 豐度。利用過DIAMOND v 0.7.12 軟件對(duì)unigenes 與NCBI NR 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，選取evalue≤最小evalue*10 的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行物種分類。結(jié)合NCBI 的物種分類系統(tǒng)，通過與MEGAN 軟件相似的LCA（Lowest Common Ancestor）算法，分析菌群的結(jié)構(gòu)。同時(shí)將得到unigenes 與KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行功能注釋。基于unigenes的分類和功能注釋，以及unigenes的豐度譜，在分類或功能水平上進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。正態(tài)分布檢驗(yàn)采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者齦下菌斑的菌群結(jié)構(gòu) 4 組樣本檢測(cè)結(jié)果共分類菌種界5 個(gè)、門64 個(gè)、綱127 個(gè)、目246個(gè)、科448 個(gè)、屬1 389 個(gè)、種4 697 個(gè)。在種水平上分析，2 型糖尿病伴牙周炎患者齦下菌斑中豐度排名前5 的菌種依次為齒垢密螺旋體、牙齦卟啉單胞菌（、中間密螺旋體、福賽坦氏菌、文氏密螺旋體，相對(duì)豐富分別為28.47%、23.52%、14.22%、10.74%、10.73%；單純牙周炎患者齦下菌斑中豐度排名前5的菌種依次為牙齦卟啉單胞菌、齒垢密螺旋體、福賽坦氏菌、索氏密螺旋體、中間密螺旋體，相對(duì)豐度為30.84%、27.06%、13.88%、7.62%、7.27%；2 型糖尿病不伴牙周炎患者齦下菌斑齦下菌斑中豐度排名前5 的菌種依次為Actinobaculum sp.oral taxon183、馬氏棒狀桿菌、戈氏放線菌、齒垢密螺旋體、具核梭桿菌，相對(duì)豐度分別為16.91%、15.83%、13.00%、12.21%、12.04%；健康志愿者齦下菌斑齦下菌斑中豐度排名前5 的菌種依次為齒垢密螺旋體、馬氏棒狀桿菌、Lautropia mirabilis、具核梭桿菌、Actinobaculum sp.oral taxon183，相對(duì)豐度分別為18.44%、16.17%、16.10%、12.67%、7.33%。根據(jù)齦下細(xì)菌的聚集特性，進(jìn)一步分析齦下菌斑的微生物復(fù)合體分布情況，2 型糖尿病伴牙周炎患者及單純牙周炎患者齦下菌斑中的紅色復(fù)合體（牙齦卟啉單胞菌、福賽坦氏菌、齒垢密螺旋體）豐度均＞60%，高于2 型糖尿病不伴牙周炎患者和健康志愿者（P均＜0.05）。

2.2 受試者齦下菌斑基因組功能分析 2 型糖尿病伴牙周炎患者、2 型糖尿病不伴牙周炎患者、單純牙周炎患者及健康志愿者的齦下菌斑基因組注釋得到的基因數(shù)目分別為3 489、3 116、3 415、3 269 個(gè)，差異明顯的基因有41 個(gè)。將差異表達(dá)的基因注釋到KEGG pathway，發(fā)現(xiàn)四組的陽(yáng)離子抗菌肽抵抗［Cationic antimicrobial peptide（CAMP）resistance］、甘油脂代謝（Glycerolipid metabolism）、丙酮酸代謝（Pyruvate metabolism）、雙組分系統(tǒng)（Two-component system）、碳代謝（Carbon metabolism）、One carbon pool by folate、Terpenoid backbone biosynthesis、DNA修復(fù)（DNA replication）、生物素代謝（Biotin metabolism）及ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（ABC transporters）等通路富集有差異，其中雙組分系統(tǒng)、碳代謝及ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)通路在2型糖尿病伴牙周炎患者的齦下菌斑中富集明顯。

3 討論

2 型糖尿病是最常見的與牙周炎發(fā)生發(fā)展相關(guān)的系統(tǒng)性疾病之一，兩者之間的聯(lián)系主要集中在代謝改變和免疫紊亂，包括氧化應(yīng)激、免疫系統(tǒng)細(xì)胞因子分布的改變和細(xì)胞受體的調(diào)節(jié)等［9］，口腔微生物變化的相關(guān)研究比較缺乏。本研究使用高分辨率鳥槍法測(cè)序技術(shù)，初步探討齦下菌斑中的菌群結(jié)構(gòu)及功能，從微生物的角度研究2 型糖尿病和牙周炎之間的聯(lián)系。我們發(fā)現(xiàn)2型糖尿病伴牙周炎患者與單純牙周炎患者的齦下菌群相比較，菌種分布相近。早期研究［10］認(rèn)為，糖尿病的存在對(duì)牙周微生物群的組成無顯著影響，而且糖尿病患者的血糖控制水平對(duì)齦下生物膜的組成也無顯著影響，這可能是由于傳統(tǒng)技術(shù)如體外培養(yǎng)和DNA-DNA 雜交的局限性，許多低豐富度的物種無法被檢測(cè)到，存在顯著的偏見，不能充分研究微生物多樣性。但隨著高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，有研究［11］通過16S rDNA 測(cè)序探索了糖尿病患者牙周微生物組成之間可能的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)了糖尿病患者齦下微生物組成不同的證據(jù)。

我們前期通過16S rDNA 測(cè)序也發(fā)現(xiàn)各組微生物組成在門、屬等層面存在差異。此次采用宏基因組鳥槍法測(cè)序技術(shù)進(jìn)行菌種分析，發(fā)現(xiàn)在菌種層面2 型糖尿病對(duì)齦下菌群分布無顯著影響。牙齦卟啉單胞菌是牙周炎病變區(qū)最主要的致病菌，單純牙周炎患者齦下菌斑中的牙齦卟啉單胞菌相對(duì)豐度高于2型糖尿病伴牙周炎患者，這可能是2型糖尿病患者對(duì)牙周病原體耐受性，能較早地表現(xiàn)出牙周炎狀態(tài)［12］。按齦下細(xì)菌的聚集特性及與牙周狀況的關(guān)系，通常將齦下細(xì)菌分為6個(gè)主要復(fù)合體［13］，分別以紅、橙、黃、綠、紫、藍(lán)表示，與牙周炎的緊密相關(guān)關(guān)系度由高到低排列［14］。進(jìn)一步比較有無牙周炎患者的齦下微生物發(fā)現(xiàn)，與牙周炎發(fā)生密切相關(guān)的紅色復(fù)合體在2型糖尿病伴牙周炎和單純牙周炎患者中呈高豐度的趨勢(shì)。健康志愿者和2型糖尿病不伴牙周炎患者的紅色復(fù)合體呈低豐度分布，且無明顯差異。上述結(jié)果表明2型糖尿病對(duì)牙周病復(fù)合體的分布可能無顯著影響。

本研究進(jìn)一步分析2 型糖尿病伴牙周炎患者齦下菌斑中的菌群在不同疾病狀態(tài)下富集明顯的功能通路，這些通路主要涉及能量代謝、脂代謝、氨基酸代謝，是微生物的重要代謝途徑。其中信號(hào)傳導(dǎo)途徑雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)、碳代謝及ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)通路在2 型糖尿病伴牙周炎患者的齦下菌斑中富集明顯。雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)常見于革蘭陰性菌，可靈敏地感知生存環(huán)境地變化，幫助微生物適應(yīng)不同的宿主環(huán)境。有研究［15］發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者唾液中葡萄糖水平升高可導(dǎo)致口腔環(huán)境酸化，齦下微生物可能通過上調(diào)雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的基因表達(dá)，從而適應(yīng)糖尿病對(duì)口腔微環(huán)境的影響。雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)還可通過調(diào)節(jié)IX 型分泌系統(tǒng)的基因表達(dá)來調(diào)節(jié)牙齦卟啉單胞菌中毒力因子的成熟和運(yùn)輸，如牙齦素和肽?；彼崦搧啺访傅龋?6］。同時(shí)微生物碳代謝過程產(chǎn)生的戊糖、葡萄糖醛酸、抗壞血酸、丁酸鹽等代謝物與牙周炎的發(fā)展密切相關(guān)，其中微生物產(chǎn)生的丁酸鹽被認(rèn)為是牙周炎癥的代謝標(biāo)志［17］，同時(shí)丁酸鹽也可以影響胰島素敏感性。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是病原體獲取營(yíng)養(yǎng)的主要運(yùn)輸?shù)鞍?，可吸收其生態(tài)系統(tǒng)中獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如病原體可通過轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)吸收形成生物膜的關(guān)鍵成分鐵［18］。另外ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)還編碼多種大分子出口，以抵御宿主環(huán)境中的抗菌素［19］，說明這些途徑可能提供了2型糖尿病和牙周炎之間的聯(lián)系機(jī)制。

綜上所述，2 型糖尿病伴牙周炎患者和單純牙周炎患者齦下菌斑中的菌群結(jié)構(gòu)相似，以紅色復(fù)合為主，進(jìn)一步進(jìn)行齦下菌斑基因組功能發(fā)現(xiàn)存在差異，其中與致病相關(guān)的功能基因在2 型糖尿病伴牙周炎患者齦下菌斑中富集明顯，主要集中在代謝方面。因此，研究齦下菌群代謝的變化情況可能是進(jìn)一步探討2型糖尿病與牙周炎之間聯(lián)系的新方向。