陳智偉 陳敏紅 謝迺?shū)?張彩云 盧園 姚栩

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)主要是由急性呼吸綜合征冠狀病毒-2(acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2)所引起的肺炎,2019 年12 月底以來(lái),該病在全球范圍內(nèi)迅速蔓延,確診病例約2.1 億,累計(jì)死亡病例約450 萬(wàn),已成為影響世界各國(guó)的嚴(yán)重公共衛(wèi)生事件［1,2］。關(guān)于該癥,目前臨床尚無(wú)特效藥,主要采用抗病毒及支持療法,可在一定程度上控制病情發(fā)展,挽救患者生命安全［3］。臨床有報(bào)道顯示,機(jī)體感染SARS-CoV-2 后,會(huì)使其人體免疫系統(tǒng)被激活,從而會(huì)產(chǎn)生針對(duì)性抗體,而抗體檢測(cè)為病毒感染的重要診斷方法,其標(biāo)本主要來(lái)源于血清、血漿、外周血等標(biāo)本,采集和保存均較簡(jiǎn)單,可明顯減少醫(yī)護(hù)人員采集咽拭子時(shí)發(fā)生感染的風(fēng)險(xiǎn),具有明顯的價(jià)值。此外,外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)主要是指外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞,機(jī)體感染SARS-CoV-2 后則會(huì)產(chǎn)生PBMC,因此,了解恢復(fù)期患者PBMC 中SARS-CoV-2 中和抗體水平具有必要性,可評(píng)價(jià)PBMC 中是否具有特異的抗SARS-CoV-2 作用,以期為臨床治療該癥提供新的方向［4］。本文收集SARS-CoV-2 感染中恢復(fù)的40 例福州地區(qū)COVID-19患者的血漿,通過(guò)假病毒中和實(shí)驗(yàn)篩選具有中和效果患者的PBMC,進(jìn)行記憶B 細(xì)胞篩選及檢測(cè),為臨床早期診斷及治療該病提供指導(dǎo)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集SARS-CoV-2 感染中恢復(fù)期的40 例福州地區(qū)COVID-19 患者的血漿進(jìn)行回顧性分析,其中男22 例、女18 例；年齡25～53 歲,平均年齡(39.00±6.11)歲；體質(zhì)量指數(shù)19～25 kg/m2,平均體質(zhì)量指數(shù)(22.00±1.12)kg/m2。本文研究符合《赫爾辛基宣言》。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：SARS-CoV-2 感染者；具有發(fā)熱癥狀、肺部影像學(xué)檢查結(jié)果異常,亞段或節(jié)段性磨玻璃影或病灶實(shí)質(zhì)、磨玻璃影與實(shí)變影并存,累及多個(gè)肺葉；痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等樣本SARS-CoV-2 核酸檢測(cè)陽(yáng)性；知情且簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)疾病者；合并嚴(yán)重心腦血管疾??；肝腎功能不全者；伴或不伴甲型/乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等陽(yáng)性；合并其他嚴(yán)重惡性腫瘤疾病者；具有精神類(lèi)疾病病史,無(wú)法正常溝通交流者；臨床資料不完整；依從性不佳者。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集及假病毒驗(yàn)證 構(gòu)建含有SARSCoV-2-S 基因的重組質(zhì)粒pcDNA3-1-SARS-CoV-2-S,與缺失Env 基因、含熒光素酶報(bào)告基因的2019-NCOV骨架質(zhì)粒pNL4-3-Luc-RE 共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞,取含假病毒的上清,以Western 印跡法、細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)、血清中和試驗(yàn),確定是否包裝出新冠狀病毒假病毒,及是否能有效用于細(xì)胞感染、中和試驗(yàn)。

1.3.2 記憶B 細(xì)胞篩選、RNA 和VDJ 測(cè)序 將生物素化的S 蛋白、RBD 蛋白偶聯(lián)至磁珠上,應(yīng)用偶聯(lián)抗原蛋白的磁珠富集血清中記憶B 細(xì)胞,分離出免疫球蛋白(Ig)G1克隆亞型,從中篩選出候選抗體,以待研究。以高通量單細(xì)胞測(cè)序法,對(duì)患者血清中記憶B 細(xì)胞進(jìn)行RNA、VDJ 測(cè)序,以數(shù)據(jù)分析找出大量抗體表達(dá)的IgG1 克隆亞型,將其中單克隆抗體進(jìn)行表達(dá)純化,進(jìn)行IgG1 抗體與RBD 結(jié)合實(shí)驗(yàn),若其中僅有一種IgG1有較弱的中和活性,則表明這一輪中和抗體篩選是否成功。

1.3.3 獲得的中和抗體進(jìn)行假病毒中和實(shí)驗(yàn) 所獲得的中和抗體中,發(fā)現(xiàn)僅有與RBD 結(jié)合的抗體呈中和活性,且與RBD 的親和力接近或大于ACE2/RBD 抗體,中和活性較強(qiáng)。選擇半抑制濃度(IC50)值＜0.05 μg/ml的單克隆抗體,用于假病毒實(shí)驗(yàn),其中命名為BD-368-2 的單克隆抗體的中和活性最強(qiáng)。

1.3.4 SARS-CoV-2 中和抗體效價(jià)檢測(cè) 取待測(cè)血清,置于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中稀釋至一定濃度,進(jìn)行3 倍系列稀釋,加入一定滴度的假病毒液,混合后將其放置于37℃環(huán)境中,持續(xù)孵育1 h,將Huh-7 細(xì)胞,應(yīng)用胰蛋白酶消化成單個(gè)細(xì)胞懸液,接種上述96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔中加入2×104個(gè)/100 μl 細(xì)胞,于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),24 h 后行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。初篩：以1∶30 倍進(jìn)行稀釋,對(duì)SARS-CoV-2 中和抗體進(jìn)行檢測(cè),若抑制率在50%及以上,行復(fù)試,采用1∶30、1∶90、1∶270 的梯度,檢測(cè)復(fù)試為陽(yáng)性的標(biāo)本,針對(duì)VSV、SARS、MERS 病毒中和活性,分析中和特異性。

1.4 觀察指標(biāo) 分析SARS-CoV-2 中和抗體檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

此次篩選的中和抗體中獲得5 個(gè)中和效果較好以及親和力高的抗體,為進(jìn)一步檢測(cè)陽(yáng)性樣本的中和作用是否為SARS-CoV-2 特異性中和,對(duì)VSV、SARSCoV、MERS-CoV 進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示：編號(hào)為415、726、1151 的樣本陽(yáng)性,于1∶30 稀釋度下,對(duì)于3 種病毒具有微弱的抑制性,表明此中和為非特異性中和作用；編號(hào)130、642、1143 的樣品,對(duì)于2 種病毒具有較弱的中和作用；采用1∶90、1∶270 的梯度進(jìn)行稀釋時(shí),所有樣本檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

3 討論

COVID-19 在全球的蔓延,已嚴(yán)重威脅到人們的生活、生命健康,降低國(guó)民生活質(zhì)量［5-7］。核酸檢測(cè)為診斷COVID-19 的有效方法,但由于技術(shù)及操作復(fù)雜等因素,檢測(cè)時(shí)間一般為5～6 h,不適用于快速診斷,也無(wú)法滿(mǎn)足當(dāng)前排查診斷的檢測(cè)需求［8-10］。此外,由于大體積反應(yīng)系統(tǒng)、非特異性擴(kuò)增,極易導(dǎo)致假陽(yáng)性,而由于標(biāo)本采集時(shí)間、部位、標(biāo)本運(yùn)輸、保存等外界因素的影響,極易導(dǎo)致假陰性,影響診斷結(jié)果［11］。因此,及時(shí)尋求一種更快、更便捷、更有效的檢測(cè)方法具有必要性。人體感染SARS-CoV-2 后,會(huì)激活人體免疫系統(tǒng),產(chǎn)生針對(duì)性抗體,而抗體檢測(cè)為病毒感染的重要診斷方法,標(biāo)本主要來(lái)源于外周血、血清、血漿標(biāo)本,采集、保存簡(jiǎn)單易行,可顯著降低醫(yī)護(hù)人員因采集咽拭子感染的風(fēng)險(xiǎn),SARS-CoV-2 感染后,患者核酸轉(zhuǎn)陰后,抗體仍可存在［12］。因此,抗體檢測(cè)對(duì)于SASRCoV-2 疫情的回顧性診斷、流行病學(xué)的調(diào)查具有十分重要的意義。

根據(jù)目前研究及流行病學(xué)報(bào)道,現(xiàn)有確診依據(jù)主要為呼吸道樣本中檢出病毒核酸,但SARS-CoV-2 主要存在于下呼吸道,而鼻咽拭子由于其易采集、患者接受度高等優(yōu)勢(shì),為目前臨床最常用的標(biāo)本［13,14］。但核酸試劑盒質(zhì)量參差不齊,操作人員水平各有差異,極易導(dǎo)致誤診、漏診等不良事件的發(fā)生［15］。此外,SARS-CoV-2 在引物設(shè)計(jì)上可以參考的序列有限,且會(huì)出現(xiàn)變異的情況,若采樣人員培訓(xùn)不到位,極易導(dǎo)致采樣不合格,采樣部位不同也會(huì)導(dǎo)致敏感性出現(xiàn)差異,從而導(dǎo)致SARS-CoV-2 核酸檢測(cè)的假陰性結(jié)果明顯增多,使部分疑似患者無(wú)法及時(shí)確診、及時(shí)治療,導(dǎo)致不良的預(yù)后結(jié)果。為進(jìn)一步分析恢復(fù)期患者SARS-CoV-2中和抗體檢測(cè)結(jié)果及價(jià)值,本文收集SARS-CoV-2 感染中恢復(fù)期的40 例福州地區(qū)患者的血漿進(jìn)行回顧性分析,研究結(jié)果顯示,編號(hào)為415、726、1151 的樣本陽(yáng)性,于1∶30 稀釋度下,對(duì)于3 種病毒具有微弱的抑制性,表明此中和為非特異性中和作用；編號(hào)130、642、1143 的樣品,對(duì)于2 種病毒具有較弱的中和作用；采用1∶90、1∶270 的梯度進(jìn)行稀釋時(shí),所有樣本檢測(cè)結(jié)果均為陰性。提示,本文所選取的樣本中,于較低的稀釋濃度下(1∶30),具有中和新型冠狀病毒的能力,之后,對(duì)假病毒載體相關(guān)的VSV、類(lèi)似的冠狀病毒進(jìn)行非特異性的分析,證實(shí)所有樣品的中和活性,均為非特異性中和,由此可見(jiàn),恢復(fù)期患者PBMC 中新型冠狀病毒SARA-CoV 中和抗體具有顯著的檢測(cè)價(jià)值,可為臨床治療COVID-19 患者提供參考。SARS-CoV-2 特異性抗體可作為核酸檢測(cè)的重要補(bǔ)充,若疑似患者的核酸檢測(cè)為陰性,則可對(duì)其抗體進(jìn)行連續(xù)性的檢測(cè),若抗體檢測(cè)出現(xiàn)陽(yáng)性,則應(yīng)引起臨床的高度懷疑。但假病毒中和抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn),主要是基于細(xì)胞學(xué)的試驗(yàn),存在一定的誤差,應(yīng)進(jìn)一步增加實(shí)驗(yàn)次數(shù),設(shè)定不同系列稀釋度的方法,確定最終陽(yáng)性樣本。

綜上所述,COVID-19 恢復(fù)期患者PBMC 中新型冠狀病毒SARS-CoV-2 中和抗體檢測(cè)結(jié)果顯示,PBMC中具有特異的抗SARS-CoV-2 作用,為臨床治療該病提供參考,臨床價(jià)值顯著,可繼續(xù)推廣。本文研究對(duì)于臨床治療COVID-19 提供新的研究方向,具有較高的臨床價(jià)值,但本文研究仍存在一些不足之處,例如所選取的樣本數(shù)量相對(duì)較少,樣本研究時(shí)間相對(duì)較短,關(guān)于恢復(fù)期患者PBMC 中新型冠狀病毒SARS-CoV-2 中和抗體檢測(cè)價(jià)值,有待臨床進(jìn)一步研究及探討。