杜麗根，余奕，藍(lán)群盛，陳恩平，劉圣林

(1.深圳市龍崗區(qū) 第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 510000；2.南昌大學(xué) 撫州醫(yī)學(xué)院，江西 撫州 344099；3.深圳市龍華區(qū) 中心醫(yī)院，廣東 深圳 518110)

尿酸(Uric acid, UA)是嘌呤代謝的最終產(chǎn)物。尿酸生成過多和(或)尿酸排泄不足會(huì)引起血清尿酸水平異常升高，導(dǎo)致高尿酸血癥(hyperuricaemia, HUA)[1]。大量研究表明高血尿酸會(huì)導(dǎo)致腎臟、心血管、腦血管、外周血管等靶器官產(chǎn)生一系列病理改變，HUA作為心血管疾病相關(guān)危險(xiǎn)因素也日益受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注[2]。尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體1(Urate transporter 1，URAT1)是負(fù)責(zé)腎臟中尿酸重吸收的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)體內(nèi)90%以上尿酸重吸收回血液，抑制其功能則有助于機(jī)體尿酸排泄，降低血尿酸水平，是目前降尿酸藥物研發(fā)的熱門靶點(diǎn)[3]。

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一種慢性炎癥性疾病，涉及多種復(fù)雜的病理過程，包括DNA損傷、線粒體功能障礙、自噬、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells ,VSMCs)的惡性增殖等[4-5]。Purnima等[6]研究認(rèn)為，HUA可作為AS的重要和獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子。因此，降尿酸療法可能在防治動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮積極作用。

自噬是細(xì)胞內(nèi)主要的降解行為之一，其控制細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)降解，是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的管家機(jī)制，也是細(xì)胞適應(yīng)外源性刺激的應(yīng)激和防御機(jī)制[7]。越來越多的證據(jù)表明，自噬可以調(diào)節(jié)AS的發(fā)生，對(duì)AS病變有積極或消極的影響[8-9]。研究表明，UA可以通過多種途徑介導(dǎo)自噬，引起腎損傷、關(guān)節(jié)炎和心肌細(xì)胞的損害。如，UA通過磷酸肌醇 3-激酶(PI3K)/蛋白激酶(AKT)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)即PI3K/AKT/mTOR通路誘發(fā)腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，促進(jìn)自噬，可被AKT抑制劑Perifosine所抑制[10]；UA可通過AMP 依賴蛋白激酶(AMP-dependentprotein kinase)AMPK/mTOR通路誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞凋亡和自噬[11]；UA可通過促進(jìn)AKT的表達(dá)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬[12]。然而，尿酸作為有機(jī)陰離子，進(jìn)入細(xì)胞必須依賴轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用[13]，而URAT1是一種特異性的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，是否能通過抑制URAT1誘導(dǎo)自噬從而改善高尿酸誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞損傷尚未可知。目前臨床上使用的降尿酸藥物L(fēng)esinurad就是特異性URAT1抑制劑，已在FDA獲批與黃嘌呤氧化酶抑制劑聯(lián)合用于痛風(fēng)合并高尿酸血癥的治療[14-15]。因此，本文選擇URAT1特異性抑制劑Lesinuard為工具藥，擬探索Lesinurad對(duì)高尿酸誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞損傷的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大鼠血管平滑肌細(xì)胞A10細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；尿酸購(gòu)自上海阿拉丁生物科技有限公司；Lesinurad購(gòu)自上海阿拉丁有限公司，高糖培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自天根生化科技公司；URAT1抗體購(gòu)自上海愛必信公司；LC3、Beclin1、p62、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR抗體購(gòu)自上海Abmart公司；GAPDH抗、羊抗兔二抗體購(gòu)自SAB公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma 公司)，-80℃冰箱(美國(guó)Thermo公司)，倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)，微量電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)，多功能成像分析系統(tǒng)(美國(guó)protein Simple公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A10細(xì)胞(第五代細(xì)胞)培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。空白對(duì)照組(control組, con group)采用等量培養(yǎng)基處理細(xì)胞48 h；尿酸單獨(dú)處理組(UA組, UA group)采用不同濃度尿酸處理細(xì)胞48 h；Lesinurad處理組則在UA組基礎(chǔ)上加入不同濃度藥物共同處理48 h。

1.3.2CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力 將細(xì)胞以3×104個(gè)/ml的密度接種于96孔板，每孔100 μL，按1.2.1.中方法藥物處理48 h后，每孔加入10 μL的 CCK-8，于培養(yǎng)箱中孵育2 h后，通過酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)每孔的OD值，再按公式計(jì)算出每孔的細(xì)胞活性。

1.3.3Western blot檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平 將細(xì)胞以5×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板，每孔2 mL，按1.2.1.中方法藥物處理48 h后，收集各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液，提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，加入一抗(1∶1000)于4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，加入二抗(1∶10000)，室溫孵育2 h，加入ECL顯影。成像掃描后利用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 URAT1抑制劑Lesinurad改善高尿酸誘導(dǎo)的A10細(xì)胞異常增殖

如圖1A所示，與con組相比，不同濃度UA(300、600、900 μmol/L)刺激可引起A10細(xì)胞異常增殖，細(xì)胞活力顯著增加。因900 μmol/L效果更為顯著(P<0.01)，因此選擇該濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。加入U(xiǎn)RAT1抑制劑Lesinurad(25 μmol/L)后，高尿酸誘導(dǎo)的A10細(xì)胞異常增殖明顯改善(P<0.01)(圖1B)。

圖1 Lesinurad對(duì)高尿酸刺激A10細(xì)胞增殖活力的影響(n=6)

2.2 Lesinurad對(duì)高尿酸刺激A10細(xì)胞中URAT1蛋白表達(dá)的影響

通過提取大鼠血管平滑肌A10細(xì)胞的蛋白，并進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，如圖2所示，我們發(fā)現(xiàn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞中存在URAT1蛋白表達(dá)，且900 μmol/L 尿酸刺激顯著促進(jìn)了其蛋白表達(dá)(P<0.001)，而加入Lesinurad可呈濃度依賴地減少URAT1的蛋白表達(dá)水平(P<0.01,P<0.01)，提示尿酸可能通過URAT1進(jìn)入血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)，Lesinurad可通過抑制URAT1的蛋白表達(dá)，從而減少尿酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖2 Lesinurad對(duì)高尿酸刺激A10細(xì)胞中URAT1蛋白表達(dá)的影響(n=3)

2.3 Lesinurad對(duì)高尿酸刺激A10細(xì)胞中LC3、Beclin-1和p62蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，與空白組細(xì)胞比較，900 μmol/L UA顯著誘導(dǎo)A10細(xì)胞發(fā)生自噬，使LC3-II/LC3-I(P<0.001)與Beclin-1(P<0.001)蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，p62(P<0.001)表達(dá)水平顯著下調(diào)，而加入低、高劑量Lesinurad呈濃度依賴性地促進(jìn)LC3-II/LC3-I(P<0.05,P<0.001)與Beclin-1(P<0.001,P<0.001)蛋白表達(dá)水平，以及促進(jìn)p62蛋白表達(dá)增加(P<0.01,P<0.001)，即Lesinurad可明顯抑制UA所引起的自噬，使上述蛋白表達(dá)恢復(fù)至正常水平。

圖3 Lesinurad對(duì)高尿酸刺激A10細(xì)胞中LC3、Beclin-1和p62蛋白表達(dá)的影響(n=3)

2.4 Lesinurad對(duì)高尿酸刺激A10細(xì)胞中p-AMPK、p-mTOR蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果如圖4所示，與空白組細(xì)胞比較，900 μmol/L UA處理組中AMPK的磷酸化水平顯著升高(P<0.05)，而mTOR的磷酸化水平則被顯著抑制(P<0.05)。與UA處理組比較，Lesinurad低、高劑量顯著地逆轉(zhuǎn)了UA引起的p-AMPK(P<0.01,P<0.001)、p-mTOR(P<0.05,P<0.01)的蛋白表達(dá)水平，使其恢復(fù)到正常水平，說明高UA引起的自噬可能通過AMPK/m-TOR信號(hào)通路介導(dǎo)。

圖4 Lesinurad對(duì)高尿酸刺激A10細(xì)胞中AMPK/mTOR信號(hào)通路的影響(n=3)

3 討 論

AS是一種發(fā)生在動(dòng)脈血管上的慢性進(jìn)展性疾病。血管平滑肌細(xì)胞作為血管壁主要組成成份，負(fù)責(zé)維持血管壁張力及血管的完整性。血管平滑肌細(xì)胞的增殖是 AS 發(fā)展的重要生物學(xué)過程[16]。盡管當(dāng)前他汀類藥物和其他預(yù)防措施如減重、控糖、降壓等在阻止動(dòng)脈粥樣硬化心血管疾病的流行上取得明顯成效，但 AS仍是一種具有高發(fā)病率和高死亡率的血管疾病，新的補(bǔ)充與替代療法亟待探索[17-18]。

大量研究表明，高尿酸血癥與心血管疾病患者的活動(dòng)能力和死亡率密切相關(guān)，降低血尿酸水平可以減緩心血管疾病的進(jìn)展[19]。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，高水平尿酸通過靶向NRF2介導(dǎo)自噬功能障礙和鐵死亡來促進(jìn)AS的發(fā)生[20]。而URAT1作為體內(nèi)特異性的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在維持體內(nèi)尿酸穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[21]，在心血管疾病研究中，有研究發(fā)現(xiàn)URAT1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，介導(dǎo)了高尿酸導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷[22]，但抑制URAT1是否能抑制血管平滑肌細(xì)胞異常增殖而改善AS的作用尚未可知。本研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸可引起A10細(xì)胞增殖能力增加，而URAT1抑制劑Lesinurad可抑制A10細(xì)胞的增殖。

自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一種分解代謝過程，它復(fù)雜地參與了饑餓期間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝、細(xì)胞內(nèi)貨物的流動(dòng)，并介導(dǎo)細(xì)胞的生命和死亡[7]。越來越多的證據(jù)表明，自噬可以調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化的過程，特別是血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖導(dǎo)致血管重塑在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸可引起自噬相關(guān)標(biāo)志物L(fēng)C3、Beclin-1的蛋白表達(dá)增加，以及抑制了p62蛋白的表達(dá)，說明高尿酸促進(jìn)自噬發(fā)生。同時(shí)，當(dāng)給予URAT1抑制劑Lesinurad可以減輕自噬的發(fā)生，更加說明UA高尿酸引起的A10細(xì)胞增殖可能與細(xì)胞自噬發(fā)生有關(guān)。

自噬的調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的過程，這其中涉及多種信號(hào)通路和蛋白質(zhì)分子的變化，主要包括：PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路、AMPK/mTOR 等信號(hào)通路，同時(shí)也是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的重要信號(hào)通路[24]。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是協(xié)調(diào)生理和壓力條件下細(xì)胞代謝生長(zhǎng)與自噬平衡的關(guān)鍵組成部分，其上游AMPK作為能量感受信號(hào)的中繼站，可將細(xì)胞內(nèi)的能量信號(hào)匯聚至mTOR，p-AMPK可以通過抑制mTOR磷酸化，繼而增強(qiáng)自噬[25]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UA會(huì)增加AMPK的磷酸化，同時(shí)也抑制了mTOR的磷酸化，URAT1抑制劑Lesinrurad可逆轉(zhuǎn)AMPK/mTOR的磷酸化程度。有研究發(fā)現(xiàn)，尿酸還會(huì)通過AMPK/mTOR/ROS途徑介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)影響AS的發(fā)生[26, 27]。所以，尿酸可能調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)了血管平滑肌細(xì)胞自噬的發(fā)生，從而引起血管平滑肌的異常增殖，最終導(dǎo)致AS的發(fā)生，但AMPK/mTOR信號(hào)通路在UA引起血管平滑肌細(xì)胞自噬的具體作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)URAT1抑制劑Lesinrurad可降低尿酸誘導(dǎo)的A10細(xì)胞的異常增殖，其機(jī)制與介導(dǎo)AMPK/mTOR通路從而下調(diào)自噬水平有關(guān)。同時(shí)，本研究也為防治AS提供了新的靶點(diǎn)和思路，但URAT1在AS的具體作用機(jī)制還需更進(jìn)一步的研究。