汪翔，夏啟東，尋陽(yáng)

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院泌尿外科，湖北 武漢 430030)

腎結(jié)石是由于晶體物質(zhì)(如鈣、草酸、尿酸、胱氨酸)在腎臟的異常聚積所致，是泌尿外科最常見的疾病，具高發(fā)病率和高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)。我國(guó)腎結(jié)石患病率約5.8%，5年復(fù)發(fā)率高達(dá)50%，并呈逐年升高的趨勢(shì)[1]。疼痛和血尿是腎結(jié)石患者最常見的臨床癥狀，疼痛通常表現(xiàn)為腰部酸脹不適或在身體活動(dòng)增加時(shí)有隱痛、鈍痛，也可表現(xiàn)為驟然發(fā)生的腰腹部刀割樣劇烈疼痛，呈陣發(fā)性；血尿多發(fā)生在疼痛后，有時(shí)是唯一的癥狀。腎結(jié)石除誘發(fā)腎絞痛外，常引起泌尿系感染和腎功能損害，反復(fù)治療也會(huì)給個(gè)人和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。近年來(lái)，腎結(jié)石手術(shù)發(fā)展迅速，但一直缺乏有效的治療藥物和預(yù)防手段[3]。有研究結(jié)果顯示，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用五苓散可增強(qiáng)腎結(jié)石的排石效果，同時(shí)有效預(yù)防腎結(jié)石復(fù)發(fā)[4]。但關(guān)于五苓散治療腎結(jié)石的具體機(jī)制目前尚不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是計(jì)算機(jī)科學(xué)與醫(yī)學(xué)相結(jié)合，構(gòu)建和可視化多基因、多靶點(diǎn)、多途徑相互作用網(wǎng)絡(luò)來(lái)評(píng)價(jià)藥物分子機(jī)制的一種新方法[5]，已被廣泛應(yīng)用于中藥研究[6]。運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)技術(shù)手段，便于理解中藥治療疾病的作用機(jī)制。本研究旨在通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，探討五苓散治療腎結(jié)石的潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 獲取五苓散活性成分靶點(diǎn)

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(Traditional Chinese medicines systems pharmacology，TCMSP)(https:∥tcmspw.com/)中搜索五苓散的主要成分，獲得其活性化合物及其靶基因。具體根據(jù)五苓散的各成分分別選擇藥名。檢索結(jié)果顯示了五苓散的相關(guān)組成化合物及其相應(yīng)的藥動(dòng)學(xué)指標(biāo)。通過(guò)設(shè)定口服生物利用度(OB)>30%、類藥指數(shù)(DL)>0.18的藥代動(dòng)力學(xué)指數(shù)篩選活性化合物。對(duì)于每個(gè)活性化合物，通過(guò)在TCMSP中尋找相關(guān)的靶基因。在Uniprot(https:∥www.uniprot.org/)的幫助下注釋基因符號(hào)并獲得五苓散靶基因集。

1.2 獲取腎結(jié)石相關(guān)基因集

通過(guò)Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.genecards.org/),OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥omim.org/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.drugbank.ca/)和DisGeNet數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.disgenet.org/home/)檢索腎結(jié)石相關(guān)基因。將五苓散靶基因集與腎結(jié)石相關(guān)基因集進(jìn)行交叉，得到五苓散-腎結(jié)石共同靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建五苓散活性化合物靶標(biāo)藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)

基于五苓散靶基因集和腎結(jié)石相關(guān)基因集，利用Cytoscape version 3.8.0構(gòu)建復(fù)合靶網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape中的CytoNca plugin鑒定出最有價(jià)值的化合物節(jié)點(diǎn)，然后構(gòu)建出排名第1位的化合物節(jié)點(diǎn)及其靶基因的關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)和富集分析

利用五苓散-腎結(jié)石共同靶基因，采用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。使用R軟件4.0.3版本的clusterprofile軟件包進(jìn)行GO和KEGG富集分析，通過(guò)生物過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能和關(guān)鍵信號(hào)通路揭示其潛在分子機(jī)制。

1.5 分子對(duì)接技術(shù)

選擇化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)中關(guān)聯(lián)最多且最有價(jià)值的化合物進(jìn)行后續(xù)分子對(duì)接分析。在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.uniprot.org/)中搜索目標(biāo)基因編碼的受體蛋白。然后從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.rcsb.org/)中下載該蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。該分子化合物二維結(jié)構(gòu)從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載。利用ChemBio 3D軟件計(jì)算并輸出自由能最小的三維結(jié)構(gòu)。用PyMOL 2.4.0軟件對(duì)受體蛋白進(jìn)行脫水，用Autodock軟件對(duì)蛋白進(jìn)行氫化和電荷計(jì)算。受體蛋白對(duì)接位點(diǎn)的參數(shù)設(shè)置包括小分子配體結(jié)合的活性口袋位點(diǎn)。利用Autodock Vina將受體蛋白與五苓散最有價(jià)值的分子化合物配體進(jìn)行對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物和潛在靶點(diǎn)的篩選

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，得到茯苓、澤瀉、豬苓、桂枝、白術(shù)5種五苓散成分。共獲得51個(gè)藥物靶基因。從Genecards、OMIM、DrugBank和DisGeNet數(shù)據(jù)庫(kù)中分別獲得720、54、60、262個(gè)腎結(jié)石相關(guān)基因。剔除重復(fù)基因并結(jié)合搜索結(jié)果，共獲得729個(gè)腎結(jié)石相關(guān)基因集(圖1A)。進(jìn)一步將藥物靶基因與疾病相關(guān)基因取交集，最終得到13個(gè)五苓散-腎結(jié)石共同靶基因(圖1B)。

A.腎結(jié)石相關(guān)基因的鑒定；B.五苓散靶基因和腎結(jié)石相關(guān)基因的交集

2.2 五苓散活性化合物靶標(biāo)藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)

在明確五苓散活性化合物和五苓散-腎結(jié)石共同靶基因后，采用Cytoscape 3.8.0可視化了20個(gè)節(jié)點(diǎn)和19條關(guān)聯(lián)線路的化合物靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖2A)。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)基因可以被多個(gè)活性化合物靶向，而一個(gè)化合物也可以靶向多個(gè)基因。在13個(gè)基因中，CHRM3是五苓散成分最具針對(duì)性的基因。通過(guò)CytoNca plugin確定MOL000358(β-谷甾醇)為最有價(jià)值的化合物，隨后構(gòu)建了一個(gè)β-谷甾醇及其靶基因的關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)(圖2B)。

A.藥靶相互作用藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)，圓形代表五苓散中的小分子化合物，每一種顏色代表一種中藥成分；矩形表示腎結(jié)石相關(guān)的靶基因，邊緣表示小分子化合物與靶基因的相互作用;B.基于β-谷甾醇的關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)及靶向基因集富集分析

由STRING數(shù)據(jù)庫(kù)衍生的PPI網(wǎng)絡(luò)顯示，五苓散-腎結(jié)石共同靶基因編碼的蛋白具有復(fù)雜的相互作用(圖3A,3B)。利用GO富集分析挖掘這13個(gè)靶基因的潛在生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能，共得到326個(gè)顯著富集的GO項(xiàng)，前10個(gè)如圖3C所示。GO的富集結(jié)果表明，這些靶基因在G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路中發(fā)揮了重要作用，也在包括血清素、乙酰膽堿、激素、胺等多種激素或神經(jīng)遞質(zhì)的結(jié)合中發(fā)揮了重要作用，并在血管收縮的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。通過(guò)KEGG富集分析，靶基因顯著富集的8條通路如圖3D所示，結(jié)果表明這些靶基因主要影響鈣信號(hào)通路、血管平滑肌收縮、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)通路以及內(nèi)分泌和其他因素調(diào)節(jié)的鈣重吸收通路。

A.從STRING數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)出的PPI網(wǎng)絡(luò)；B.對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)和邊的標(biāo)注；C.目的基因GO富集分析；D.目的基因KEGG富集分析

2.4 β-谷甾醇與CHRM3編碼蛋白的分子對(duì)接

通過(guò)軟件下載β-谷甾醇的2D結(jié)構(gòu)(圖4A)和CHRM3蛋白的3D結(jié)構(gòu)(圖4B)。利用ChemBio 3D軟件以最小自由能預(yù)測(cè)β-谷甾醇的三維結(jié)構(gòu)(圖4C)。隨后，分子對(duì)接表明β-谷甾醇可以很容易地進(jìn)入并結(jié)合CHRM3蛋白活性口袋(圖4D，4E)。對(duì)接評(píng)分為-5.9 kcal/moL，進(jìn)一步表明β-谷甾醇與CHRM3蛋白結(jié)合良好。

A.β-谷甾醇的二維結(jié)構(gòu)；B.CHRM3蛋白的三維結(jié)構(gòu)；C.β-谷甾醇的三維結(jié)構(gòu)；D,E.β-谷甾醇與CHRM3蛋白的分子對(duì)接，其中D為配體和受體的三維結(jié)構(gòu)，E為受體的表面和配體的三維結(jié)構(gòu)

3 討論

腎結(jié)石作為泌尿外科最常見的疾病，發(fā)病率逐年上升，但目前仍缺乏有效的藥物治療手段。有研究報(bào)道，五苓散加味聯(lián)合常規(guī)西藥治療腎結(jié)石效果理想,可降低近期復(fù)發(fā)率,提高排石率[7],但其具體作用機(jī)制仍不得而知。本研究結(jié)果顯示，五苓散中的13種活性成分在腎結(jié)石的治療中發(fā)揮重要作用，并與多種蛋白質(zhì)和信號(hào)通路相關(guān)，表明這些活性成分具有潛在的研究?jī)r(jià)值。β-谷甾醇可能是五苓散發(fā)揮治療腎結(jié)石的主要化合物，而M3毒蕈堿受體(CHRM3)是五苓散成分最具針對(duì)性的基因。GO和KEGG富集分析結(jié)果表明，五苓散-腎結(jié)石共同靶基因主要集中在G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路和血管平滑肌收縮信號(hào)通路等。毒蕈堿受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，包括五個(gè)亞型,其中興奮性毒蕈堿M3受體優(yōu)先與Gq/11結(jié)合[8]。毒蕈堿M3受體通過(guò)動(dòng)員三磷酸肌醇(InsP3)和二酰基甘油(DAG)來(lái)增加細(xì)胞內(nèi)的鈣[9]。有報(bào)道顯示，輸尿管中存在CHRM3分布[10]。我們通過(guò)分子對(duì)接證實(shí)β-谷甾醇可以很容易地進(jìn)入并結(jié)合CHRM3蛋白活性口袋。對(duì)接評(píng)分為-5.9 kcal/mol，進(jìn)一步表明β-谷甾醇與CHRM3蛋白結(jié)合良好。由此可見，五苓散可能通過(guò)其活性成分β-谷甾醇作用于CHRM3，從而通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度來(lái)介導(dǎo)輸尿管蠕動(dòng)，起到促進(jìn)結(jié)石排出的作用。

Hassan等[11]報(bào)道CHRM3可通過(guò)影響T84細(xì)胞表面SLC26A6表達(dá)來(lái)調(diào)控草酸轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而參與腎結(jié)石形成。SLC26A6是一種多功能陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要在小腸絨毛上皮和腎小管上皮細(xì)胞頂膜中表達(dá)，是體內(nèi)介導(dǎo)草酸轉(zhuǎn)運(yùn)最重要的蛋白分子之一。腸道和腎小管上皮中的草酸平衡由SLC26A6維持，其失衡導(dǎo)致高草酸尿和高草酸血癥[12]。而高草酸尿是腎結(jié)石形成的主要危險(xiǎn)因素之一[13]。這提示五苓散中的β-谷甾醇可通過(guò)作用CHRM3來(lái)調(diào)控腸道中SLC26A6蛋白的表達(dá)，從而增加腸道草酸的分泌，減少結(jié)石復(fù)發(fā)。然而，這些活性化合物的深層作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究闡明。

綜上所述，藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)和分子對(duì)接分析可揭示五苓散治療腎結(jié)石的潛在機(jī)制，這可能為新型腎結(jié)石防治藥物的設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)。