黃遠(yuǎn)航，范立明，黃盈，童若宇，申萌，周淑珍，李璟，丁遂碧

(中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院腎臟病科，廣東 廣州 510010)

急性腎損傷(Acute kidney injury, AKI)是指由于多種病因引起的腎功能快速下降而出現(xiàn)的臨床綜合征[1]?？砂l(fā)生于既往無(wú)腎臟病者，也可發(fā)生在原有慢性腎臟病的基礎(chǔ)上。若不及時(shí)給予針對(duì)性治療，會(huì)導(dǎo)致腎功能衰竭，對(duì)患者生命造成嚴(yán)重威脅[2]。目前有關(guān)AKI尚未特定的治療，相關(guān)研究證實(shí)，抗氧化劑、利尿劑等多種藥物治療可預(yù)防性的改善AKI患者癥狀，但治療效果仍無(wú)法令人滿意，其死亡率仍居高不下，且預(yù)后較差[3]。

既往研究顯示，腎臟損傷后的修復(fù)、再生有多種干細(xì)胞參與，其中以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSCs)、腎臟MSCs研究報(bào)道較多見(jiàn)，在治療AKI上具有一定療效[4-5]。然而有關(guān)兩者對(duì)AKI修復(fù)作用的大小尚未清楚。故本組就MSCs與CD133+腎臟細(xì)胞治療急性腎損傷的機(jī)制進(jìn)行了研究，以此為臨床治療AKI提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

選取由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的6～8周齡雄性C57 BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，共48只，體質(zhì)量(20.01±2.24)g。根據(jù)不同的治療方案將48只小鼠分為正常對(duì)照組、缺血再灌注損傷(I/R)組、I/R+MSCs組及I/R+CD133+組4組，每組12只。本次實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1骨髓MSCs、腎臟MSCs的制備 本研究48只C57 BL/6小鼠(湖北貝恩特生物科技有限公司)骨髓MSCs分離采用Percoll密度梯度離心法結(jié)合貼壁分離法。隨后采用F12-DMEM細(xì)胞培養(yǎng)(購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司)基進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到80 %～90 %融合時(shí)，用0.25%胰酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，收集足夠數(shù)量的細(xì)胞以備后續(xù)使用。取第3代細(xì)胞，0.05%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，PBS 洗滌2次，分別加入熒光標(biāo)記的間充質(zhì)標(biāo)志物CD29、CD90 以及血源性標(biāo)志物CD34、CD45的流式抗體,4 C孵育30 min, PBS 洗去未標(biāo)記的抗體，1%多聚甲醛固定后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

CD133+腎臟細(xì)胞分離采用免疫磁珠篩選法結(jié)合貼壁分離法，將分離出的CD133+腎臟細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到80%～90% 融合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，收集足夠數(shù)量的細(xì)胞備用。用免疫熒光法測(cè)定其有無(wú)表達(dá)。

1.2.2不同組別治療方法 4組均進(jìn)行常規(guī)麻醉，麻醉藥物：2%戊巴比妥鈉溶液；打開(kāi)腹腔，用不同的方法對(duì)暴露腎蒂進(jìn)行處理。(1)正常對(duì)照組：腎蒂暴露10 min，將腹腔關(guān)閉，即刻尾靜脈注射生理鹽水，注射劑量0.2 mL；(2)I/R組：雙側(cè)腎蒂用動(dòng)脈夾夾閉10 min，隨后松開(kāi)，將腹腔關(guān)閉，即刻尾靜脈注射生理鹽水，注射劑量0.2 mL；(3)I/R+MSCs組：雙側(cè)腎蒂用動(dòng)脈夾夾閉10 min，隨后松開(kāi)，將腹腔關(guān)閉，分別即刻尾靜脈注射0.2 mL含有 約2×106個(gè)MSCs的PBS溶液(購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司)；(4)I/R+CD133+組：雙側(cè)腎蒂用動(dòng)脈夾夾閉10 min，隨后松開(kāi)，將腹腔關(guān)閉，分別即刻尾靜脈注射0.2 mL含有 約2×106個(gè)MSCs的CD133+腎臟細(xì)胞溶液。4組小鼠在同一環(huán)境下喂養(yǎng)，自由飲食。

1.2.3術(shù)后處理 在模型建立的第1、2、4、8 d分別處死部分小鼠(每次每組均處死3只)，采用無(wú)菌注射器進(jìn)行心臟穿刺抽血，隨后離心，保留血清，-20 ℃低溫保存?zhèn)溆谩＋@取腎臟組織，制作病理切片。

1.3 觀察指標(biāo)

比較各組小鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)與肌酐(creatinine，Cr)水平；檢測(cè)方法：采用Beckman 自動(dòng)生化儀檢測(cè)；對(duì)病理切片進(jìn)行急性腎小管壞死評(píng)分，計(jì)算其平均值，作為腎小管壞死的評(píng)分指數(shù)(ATN評(píng)分)，隨后比較各組不同時(shí)間點(diǎn)ATN評(píng)分；比較各組小鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)腎組織勻漿中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10, IL-10)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte grow th factor, HGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)的濃度。檢測(cè)方法上述因子均采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海鈺森公司。每只小鼠均從左腎取80 mg置于研磨器中，加入1 mlPBS，隨后研磨至無(wú)肉眼可見(jiàn)的組織塊。將勻漿移入1.5 ml離心管，1500 g離心5 min，取上清，移入另一個(gè)離心管，進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 骨髓MSCs與CD133+腎臟細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

經(jīng)分離培養(yǎng)后，骨髓MSCs在培養(yǎng)皿中呈梭形(見(jiàn)圖1)；CD133+腎臟細(xì)胞經(jīng)免疫熒光法檢測(cè)，結(jié)果顯示細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光(見(jiàn)圖2)。

圖1 傳代培養(yǎng)的骨髓MSCs(400×)

圖2 CD133+腎臟細(xì)胞(400×)

2.2 各組小鼠術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)BUN、Cr水平比較

I/R+MSCs組、I/R+CD133+組術(shù)后BUN、Cr水平均顯著高于正常對(duì)照組；術(shù)后4、7 d的BUN、Cr水平均低于I/R組，其中I/R+MSCs組以術(shù)后8 d最為顯著(P<0.05)；I/R+CD133+組以術(shù)后4 d最為顯著(P<0.05)。詳情見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)BUN、Cr水平比較

2.3 各組小鼠術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)ATN評(píng)分比較

I/R+MSCs組、I/R+CD133+組術(shù)后ATN評(píng)分均顯著高于正常對(duì)照組；術(shù)后2、4、7 d的ATN評(píng)分均低于I/R組，I/R+MSCs組與I/R+CD133+組術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)ATN評(píng)分比較，I/R+CD133+組術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)ATN評(píng)分均略低于I/R+MSCs組，但組間比較無(wú)差異(P>0.05)。詳情見(jiàn)表2。

表3 各組小鼠術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)ATN評(píng)分比較

2.4 各組小鼠術(shù)后TNF-α、IL-10、HGF、BMP-7水平變化情況比較

I/R+MSCs組、I/R+CD133+組術(shù)后TNF-α水平均顯著高于正常對(duì)照組術(shù)后，低于I/R組(P<0.05)；術(shù)后2、4、8 d I/R+MSCs組、I/R+CD133+組TNF-α水平有所下降，但仍高于正常對(duì)照組，低于I/R組。詳情見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)TNF-α水平比較

I/R+MSCs組、I/R+CD133+組術(shù)后IL-10、HGF、BMP-7水平均低于正常對(duì)照組，高于I/R組(P<0.05)；術(shù)后2、4、8 d I/R+MSCs組、I/R+CD133+組IL-10、HGF、BMP-7水平有所上升，但仍低于正常對(duì)照組，高于I/R組。詳情見(jiàn)表4、5、6。

圖3 各組小鼠術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)ATN評(píng)分情況

表4 各組小鼠術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)IL-10水平比較

表5 各組小鼠術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)HGF水平比較

表6 各組小鼠術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)BMP-7水平比較

3 討 論

AKI是臨床上常見(jiàn)的一種疾病，發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，且死亡率高，預(yù)后不佳[6]。目前有關(guān)干細(xì)胞治療AKI的報(bào)道最多的是骨髓、腎臟MSCs。骨髓MSCs是在骨髓中發(fā)現(xiàn)的一種起源于胚胎中胚層，具有自我復(fù)制和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，對(duì)骨髓造血干細(xì)胞起支持、誘導(dǎo)作用[7-8]。其次因骨髓MSCs易于提取和體外培養(yǎng)、免疫原性和成瘤性低等特點(diǎn)，使其在臨床治療AKI與實(shí)驗(yàn)研究等方面優(yōu)勢(shì)更大[9]。國(guó)外大量研究發(fā)現(xiàn)，使用MSCs治療AKI安全可靠，且效果良好，可有效減輕患者腎功能損傷，促進(jìn)腎功能恢復(fù)[10-11]。

腎臟MSCs主要來(lái)源于人體后腎間質(zhì)，在成人腎臟中可長(zhǎng)時(shí)間不進(jìn)行有絲分裂，但在適當(dāng)環(huán)境下可快速進(jìn)行大量分裂繁殖，且可分化為成熟細(xì)胞，具有干細(xì)胞的多功能性及自我更新性[12-13]。Der Sarkissian S[14]等報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在成年人腎小囊、腎小管及間質(zhì)中，有少量細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞表面抗原CD133(CD133 +細(xì)胞)。CD133 +細(xì)胞可表達(dá)其他干細(xì)胞標(biāo)志物，而且在一定條件下可形成腎小管樣結(jié)構(gòu)。所以，有部分學(xué)者將CD133 作為腎臟干細(xì)胞的標(biāo)志物。另外大量文獻(xiàn)報(bào)道指出CD133+腎臟細(xì)胞在腎臟損傷后的修復(fù)過(guò)程中具有重要作用[15]。

本組研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD133+腎臟細(xì)胞在AKI修復(fù)過(guò)程中的作用較骨髓MSCs更為明顯，分析其原因可能與干細(xì)胞所處環(huán)境有關(guān)。干細(xì)胞的正常存在、自我更新及其分化能力均與其所處的微環(huán)境有關(guān)[16]。Johnson A K[17]等研究認(rèn)為，MSCs可改善急性腎損傷，可能是因?yàn)槠淇芍苯臃只癁槟I小管上皮細(xì)胞。但Liu N[18]等研究發(fā)現(xiàn)，MSCs直接分化呈腎小管上皮細(xì)胞的百分率極低。這表明。腎臟損傷后的微環(huán)境并不利于分化、增殖成正常腎小管細(xì)胞，而是通過(guò)其他途徑修復(fù)腎臟損傷。Sun B[19]等研究認(rèn)為，骨髓MSCs主要是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子水平，抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、受損細(xì)胞的壞死與凋亡，同時(shí)使殘留的上皮細(xì)胞分化成具有分裂功能的細(xì)胞，再進(jìn)行分化、增殖成成熟細(xì)胞，從而改善局部腎功能。而CD133+腎臟細(xì)胞在腎臟損傷后，可增殖、分化呈腎小管上皮細(xì)胞。其次，在腎臟損傷過(guò)程中常伴有局部微血管損傷，而CD133+細(xì)胞可形成毛細(xì)血管樣結(jié)果，可為腎臟修復(fù)提供營(yíng)養(yǎng)需求[20]。此外，CD133+細(xì)胞也可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)，進(jìn)而修復(fù)腎損傷。本組研究通過(guò)比較各組TNF-α、IL-10、HGF、BMP-7水平發(fā)現(xiàn)，與I/R組比較，I/R+MSCs組、I/R+CD133+組TNF-α水平明顯下降，IL-10、HGF、BMP-7水平明顯上升(P<0.05)，說(shuō)明骨髓MSCs、CD133+腎臟細(xì)胞可調(diào)控小鼠組織中的炎癥細(xì)胞因子水平，減少炎癥細(xì)胞因子對(duì)腎臟的繼續(xù)損傷。推測(cè)其原因可能是骨髓MSCs、CD133+腎臟細(xì)胞通過(guò)旁分泌機(jī)制，調(diào)控部分細(xì)胞因子的水平，抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，抑制受損細(xì)胞的壞死與凋亡。同時(shí)，本組研究還發(fā)現(xiàn)，I/R+MSCs組、I/R+CD133+組術(shù)后BUN、Cr水平、ATN評(píng)分均顯著高于正常對(duì)照組，其中I/R+MSCs組以術(shù)后8 d最為顯著(P<0.01)；而I/R+CD133+組以術(shù)后4 d最為顯著(P<0.01)，側(cè)面表明CD133+腎臟細(xì)胞修復(fù)受損腎臟的效能比骨髓MSCs更佳。究其原因可能是由于CD133+可形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)，為腎臟修復(fù)提供所需營(yíng)養(yǎng)；另外CD133+可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)，更有助于修復(fù)腎損傷。

綜上所述，骨髓MSCs、CD133+腎臟細(xì)胞均可有效改善腎臟微環(huán)境，促進(jìn)由I/R誘導(dǎo)的AKI恢復(fù)，但CD133+腎臟細(xì)胞對(duì)AKI的修復(fù)作用更為顯著。