石磊泰，李玉華

20世紀(jì)以來全球?qū)ι镏破返漠a(chǎn)能和安全性的需求不斷增加，促使業(yè)內(nèi)開發(fā)更安全、有效和廉價的細(xì)胞基質(zhì)。來源于哺乳動物組織的傳代細(xì)胞系不僅是生命科學(xué)的寶貴工具，也是生產(chǎn)各種生物制品的重要細(xì)胞基質(zhì)。用于疫苗生產(chǎn)最常用的哺乳動物細(xì)胞系之一是Vero細(xì)胞[1]。它是一種連續(xù)傳代細(xì)胞系，被監(jiān)管部門廣泛認(rèn)可并用于病毒疫苗生產(chǎn)[2]。并且這類細(xì)胞可以在含微載體的發(fā)酵罐中大規(guī)模培養(yǎng)，有助于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化并獲得穩(wěn)定的產(chǎn)量。就狂犬病的預(yù)防而言，用Vero細(xì)胞可以制備出大量的狂犬病疫苗，這對提高人用狂犬病疫苗使用的可及性，無疑是一個重大的利好。本文就Vero細(xì)胞在人用狂犬病疫苗中的應(yīng)用和研究做一綜述。

1 Vero細(xì)胞的建株背景和特性研究

Vero細(xì)胞是從非洲綠猴腎組織建立的，Vero細(xì)胞的培養(yǎng)于1962年3月27日在日本千葉大學(xué)開始，傳代數(shù)月后獲得多個連續(xù)的細(xì)胞亞系，后選擇一個亞系作為標(biāo)準(zhǔn)Vero細(xì)胞系[3-4]。1964年6月15日，B.Simizu將該細(xì)胞系的第93代從千葉大學(xué)帶至美國國立衛(wèi)生研究院過敏與傳染病研究所熱帶病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室，后被ATCC(美國模式培養(yǎng)物集存庫收錄)，編號為CCL-81[5]。

該細(xì)胞系的命名是由日本學(xué)者Yasumura從世界語的二個字合并來的，其中“ve”是從世界語意為綠色的“verde”而來，而“re”是意為腎臟的“reno”的前兩個字母所得，但世界語中無“vere”的字形，所以將末尾的“e”改為“o”，即為“Vero”。另外，“Vero”一字在世界語中還有“真理”之意，從而將該細(xì)胞名為Vero細(xì)胞[6]。

Vero細(xì)胞是一種連續(xù)細(xì)胞系，被廣泛用于病毒疫苗生產(chǎn)[7]。它具有假二倍體核型[8]，在低代次時無致瘤性[9-10]。Vero 細(xì)胞對各種類型的病毒高度敏感，包括猿猴多瘤病毒 SV40[3-4]、麻疹病毒[11]、風(fēng)疹病毒[12-13]、蟲媒病毒和腺病毒[14-15]。

Vero細(xì)胞適合不同病毒的生長，所以Vero 細(xì)胞系特別適用于病毒疫苗的生產(chǎn)。大多數(shù)正常細(xì)胞由于病毒感染而產(chǎn)生干擾素，在許多情況下導(dǎo)致這些細(xì)胞中的病毒生長效率降低。但是就Vero細(xì)胞而言，在病毒感染后Vero細(xì)胞不產(chǎn)生干擾素，不影響病毒生長[16]。46年后，這個結(jié)論得到了NAOKI Osada等人[17]的證實(shí)。NAOKI Osada的研究結(jié)果顯示：在2.97 gb的基因組序列中鑒定了25 877個推測的蛋白編碼基因，在Vero細(xì)胞中，第12染色體上的純合子～ 9 Mb缺失導(dǎo)致I型干擾素基因簇和周期依賴性激酶抑制劑基因的丟失。在細(xì)胞系建立過程中，9-Mb的缺失首先發(fā)生在兩條同源染色體12中的一條上，隨后在Vero細(xì)胞系中進(jìn)行了大規(guī)模的轉(zhuǎn)換，固定了該區(qū)域的純合子缺失。第12號染色體的缺失區(qū)域Vero細(xì)胞與人類染色體9p21 -p22同源，其中包含許多I型干擾素基因(a8、a2、a1/13、a6、a14、a4、a17、a21、v1、b1)。

2 Vero細(xì)胞在人用狂犬病疫苗中的研究和應(yīng)用

2.1 國外的主要情況 用Vero細(xì)胞系生產(chǎn)人用疫苗的開創(chuàng)性工作是法國的Merieux研究所從20世紀(jì)80年代初發(fā)起的，該細(xì)胞系最初用于大規(guī)模生產(chǎn)滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗和狂犬病疫苗[18]，隨后用于生產(chǎn)口服脊髓灰質(zhì)炎減毒疫苗。

純化的Vero細(xì)胞狂犬病疫苗(維爾博)由法國Merieux研究所研究成功[19]，用微載體懸浮培養(yǎng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)狂犬病疫苗，其優(yōu)點(diǎn)為短時間內(nèi)可以繁殖大量細(xì)胞并可進(jìn)行工業(yè)化的大罐培養(yǎng)。所用毒種為PM 1503-3M株，感染后培養(yǎng)的病毒液可以多次收獲，病毒滴度可達(dá)106.6TCID50/mL以上，經(jīng)超濾濃縮、蔗糖-密度離心純化、β-丙內(nèi)酯滅活制成凍干疫苗，每劑量為0.5 mL。1985年開始批準(zhǔn)應(yīng)用，疫苗的效價在2.5 IU/0.5mL以上，疫苗的穩(wěn)定性在4 ℃保存至少36個月。對1985年至2019年發(fā)表的關(guān)于維爾博的數(shù)項(xiàng)研究表明：就暴露前免疫而言，數(shù)周內(nèi)報告狂犬病病毒中和抗體的血清陽轉(zhuǎn)率為 90%～100%，1 年時加強(qiáng)免疫反應(yīng)強(qiáng)烈(加強(qiáng)免疫后第 14 d血清陽轉(zhuǎn)率為 100%)。就暴露后免疫而言，進(jìn)行了為期 1 周至 90 d的暴露后評估。在第 14～28 d后誘導(dǎo)了 99% 的血清陽轉(zhuǎn)率[20]。

2020年的一篇關(guān)于維爾博皮內(nèi)注射的回顧性分析顯示[20]，盡管使用皮內(nèi)注射維爾博所產(chǎn)生的狂犬病毒中和抗體水平不能維持1年(1年后<0.5 IU/mL)，一旦暴露后無論采用哪種方式進(jìn)行加強(qiáng)免疫，維爾博都可以迅速誘導(dǎo)出超過閾值0.5 IU/mL的中和抗體水平，大多數(shù)受試者的狂犬病毒中和抗體水平可以持續(xù)超過閾值5年。

2.2 國內(nèi)的主要情況 我國科技工作者在Vero細(xì)胞使用方面的探索也緊跟當(dāng)時世界步伐，用我國自有的狂犬病毒疫苗株CTN-1和aG在Vero細(xì)胞上開展了一系列適應(yīng)研究。

2.2.1 CTN-1株在Vero細(xì)胞上的適應(yīng) 1989年中國藥品生物制品檢定所的李宏玲等[21]報道了用狂犬病毒適應(yīng)Vero細(xì)胞的研究。她們用3株狂犬病毒(CTN-1早代適應(yīng)株C42、晚代適應(yīng)株C103和4aG株)在Vero細(xì)胞上適應(yīng)傳代，結(jié)果表明適應(yīng)初期病毒滴度已較高，繼續(xù)傳代至16～17代，病毒滴度均穩(wěn)定在7.0 lgLD50/mL以上。病毒增殖高峰期出現(xiàn)在感染Vero細(xì)胞后4 d ，其中C42株的滴度略高，并經(jīng)該實(shí)驗(yàn)室反復(fù)驗(yàn)證取得一致的結(jié)果。

在李宏玲工作的基礎(chǔ)上，董關(guān)木[22]繼續(xù)進(jìn)行狂犬病毒CTN-1株Vero細(xì)胞適應(yīng)傳代研究，通過連續(xù)傳代培養(yǎng),病毒滴度可達(dá) 8.0 lgLD50/mL。1998年張玉慧等[23]用Vero細(xì)胞適應(yīng)10代以后的CTN毒種制備了Vero細(xì)胞狂犬病疫苗。后續(xù)桑愛軍等[24]在2000年發(fā)表的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，用小鼠試驗(yàn)驗(yàn)證CTN-1株在Vero細(xì)胞上制備的狂犬病疫苗對國內(nèi)1992年分離自上海的狂犬病街毒株SBD07的保護(hù)作用，經(jīng)腦內(nèi)或肌內(nèi)攻擊保護(hù)率分別為 88.9%和90%。程滿榮等[25]發(fā)表于2008年關(guān)于暴露后免疫的報道描述了 CTN 株疫苗對街毒的保護(hù)作用：先用 CTN 株疫苗免疫昆明小鼠，后用街毒株 CQ92、HN06、J 和標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株 CVS 經(jīng)腦內(nèi)和肌肉攻擊,對照為未免疫小鼠。結(jié)果顯示：CTN 株疫苗免疫的小鼠經(jīng) 3 株街毒腦內(nèi)和肌肉攻擊后,均得到 100%的保護(hù)。表明用Vero細(xì)胞生產(chǎn)的CTN-1株狂犬病疫苗適用于國內(nèi)狂犬病疫情的防控。2010年，這個結(jié)論也得到了石磊泰等[26]的證實(shí)，他們的研究結(jié)果顯示：CTN-1株與國內(nèi)多數(shù)狂犬病街毒株的親緣關(guān)系密切，全基因組的核苷酸同源性在83.7%～93.4%，而與國外街毒株的核苷酸同源性只有81.5%～84.5%。糖蛋白G的同源性結(jié)果表明：CTN-1疫苗株與國內(nèi)街毒株的氨基酸同源性在92.4%～97.7%。

2017年黃莉榮等[27]的報告對CTN-1株生產(chǎn)的凍干人用狂犬病疫苗(Vero 細(xì)胞)進(jìn)行了安全性和免疫原性考察。他們采用隨機(jī)、盲法、陽性對照試驗(yàn)設(shè)計，在廣西岑溪市和蒼梧縣共選擇1 200名10 ～ 60歲健康受試者。將這些受試者按1∶1的比例隨機(jī)分配接種試驗(yàn)疫苗和對照疫苗。按五針0、3、7、14和28 d的免疫程序，初次接種后第14和42 d采集血樣，采用RFFIT法檢測狂犬病病毒中和抗體。最終1 199名受試者完成跟蹤觀察。安全性方面，試驗(yàn)疫苗組(600例)和對照疫苗組(599例)全身反應(yīng)發(fā)生率分別為12.33%和18.03%，常見癥狀為發(fā)熱(發(fā)生率分別為8.00%和13.19%)，局部反應(yīng)發(fā)生率分別為5.33%和10.52%。免疫原性方面，初次免疫后試驗(yàn)疫苗組(571例)和對照疫苗組(576例)在第14 d的抗體陽轉(zhuǎn)率分別為100.00%和99.83%，第42 d均為100.00%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；第14 d抗體均值分別為8.94和7.96 IU/mL，第42 d分別為17.26和15.04 IU/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明Vero細(xì)胞培養(yǎng)的CTN-1株凍干人用狂犬病疫苗具有良好的安全性及免疫原性。該疫苗自2017年上市以來累計批簽發(fā)量為393萬人份[29]。

2018年黃騰等[29]對另一家CTN-1株人用狂犬病疫苗(Vero細(xì)胞)在10 ～ 60歲健康受試者中的安全性及免疫原性進(jìn)行研究。他們采用隨機(jī)、盲法、并行控制設(shè)計,將廣西永?？h的900名受試者以2∶1的比例隨機(jī)配對，接種試驗(yàn)疫苗和對照疫苗觀察安全性和免疫原性。所有受試者均在免前和免疫后14 d、45 d采集血樣。用RFFIT法檢測狂犬病毒中和抗體水平。安全性結(jié)果顯示，試驗(yàn)組和對照組不良反應(yīng)發(fā)生率分別為32.33%和38.67%。接種部位的局部反應(yīng)主要為疼痛、發(fā)紅、腫脹和瘙癢，而全身反應(yīng)主要為發(fā)燒、頭痛和疲勞，且大多數(shù)是輕度。免疫后14 d和45 d，試驗(yàn)組狂犬病毒中和抗體陽轉(zhuǎn)率均為100.00%，抗體均值分別為9.96和28.83 IU/mL，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明國產(chǎn)CTN-1株人用狂犬病疫苗(Vero 細(xì)胞)具有良好的安全性和免疫原性。該疫苗也于2017年上市，累計批簽發(fā)量為338萬人份[28]。

2.2.2 aG株在Vero細(xì)胞上的適應(yīng) 1990年上海生物制品研究所曾蓉芳等[30]應(yīng)用國內(nèi)狂犬病組織培養(yǎng)疫苗的生產(chǎn)毒種aG株建立了Vero細(xì)胞適應(yīng)株RFD，RFD株在Vero細(xì)胞上的狂犬病毒滴度從初次傳代的3.0 lgLD50/mL到第20代即可達(dá)到6.5 lgLD50/mL左右，其高峰收獲期亦可以從12 d縮短到6 d。1997年曾蓉芳等[31]利用自建的狂犬病毒Vero 細(xì)胞適應(yīng)株RFD和細(xì)胞反應(yīng)器微載體系統(tǒng)培養(yǎng)Vero細(xì)胞和狂犬病毒,病毒滴度可達(dá)到6.0～8.0 lgLD50/mL。病毒原液純化后制出的純化狂犬疫苗質(zhì)量基本上均能達(dá)到WHO對此類型疫苗的主要質(zhì)控要求，疫苗小量試制工藝基本可行。但是這項(xiàng)工作未見相關(guān)后續(xù)報道。直到2014年，我們看到吳金妍等[32]將上海所自產(chǎn)凍干人用狂犬病純化疫苗(Vero 細(xì)胞微載體)的臨床結(jié)果進(jìn)行了總結(jié)：該款凍干人用狂犬病疫苗(Vero 細(xì)胞微載體)接種人體后反應(yīng)輕微，免疫原性良好。這項(xiàng)工作在2003-2005年開展，旨在觀察上海所自產(chǎn)狂犬病疫苗在人體的接種反應(yīng)和免疫原性。他們在山東省高密市選取10～60歲符合臨床試驗(yàn)條件的志愿者964名(男性499名，女性465名)，分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期進(jìn)行臨床試驗(yàn)，以法國巴斯德狂犬病疫苗作為對照，進(jìn)行接種反應(yīng)和免疫原性觀察。志愿者接種后不良反應(yīng)發(fā)生率低，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期不良反應(yīng)發(fā)生率分別為6.1%、7.8%和7.7%，反應(yīng)均為注射部位疼痛，不伴有局部紅腫和硬結(jié)，未見體溫升高等全身反應(yīng)。Ⅱ、Ⅲ期臨床免疫后，血清抗體陽轉(zhuǎn)率在14 和45 d 均為100%。與對照組相比，試驗(yàn)組不良反應(yīng)發(fā)生率和免疫后狂犬病毒抗體陽轉(zhuǎn)率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。這項(xiàng)研究的臨床結(jié)果雖然喜人，但遺憾的是未見這款疫苗上市銷售使用的公開報道。

同時期，長春生物制品研究所的顧悅翔等人也在開展狂犬病毒適應(yīng)Vero細(xì)胞的研究。1992年的一篇文獻(xiàn)顯示，顧悅翔等[33]人利用微載體懸浮培養(yǎng)的技術(shù)，將aG株、CTN株和羊腦疫苗生產(chǎn)用北京株進(jìn)行Vero細(xì)胞適應(yīng)研究。CTN株和北京株分別由適應(yīng)初期的4～6 lgLD50/mL和4～5.53 lgLD50/mL提高到第7～14代時的6.53～7.5 lgLD50/mL和6.53～7.87 lgLD50/mL，均能達(dá)到當(dāng)時WHO規(guī)定的純化Vero細(xì)胞狂犬疫苗濃縮前不低于7.00 lgLD50/mL的標(biāo)準(zhǔn)。但遺憾的是當(dāng)時aG株適應(yīng)較緩慢，沒有取得突破性進(jìn)展。在接下來的將近20年間似乎找不到長春所關(guān)于aG株研究的公開文獻(xiàn)，直到2009年袁彥寶等[34]獲得1株狂犬病毒aG株在Vero細(xì)胞的適應(yīng)株4aG V時，業(yè)內(nèi)才確知長春所對aG株適應(yīng)Vero細(xì)胞的研究工作并未停止。他們將滴度為8.0 lgLD50/mL狂犬病毒4aG株稀釋到10-3后，以1∶1 000的比例感染Vero細(xì)胞，7 d后將細(xì)胞放入-70 ℃冰箱凍存。采用病毒和細(xì)胞同時感染法傳下一代，交替?zhèn)鞔?6代獲得4aG V株。該毒株的滴度可達(dá) 8.5 lgLD50/mL，并可連續(xù)收液12 d且具有很好的抗原性及免疫原性。2011年的另一篇文獻(xiàn)[35]顯示，長春所的另一工作組在進(jìn)行3aG株在Vero細(xì)胞的適應(yīng)研究。郭秀俠等人自 2008 年起對3aG 株在 Vero 細(xì)胞上傳代適應(yīng)，建立了疫苗生產(chǎn)用aGV毒種庫。取病毒滴度為7.5lgLD50/mL的3aG株，采用同時感染法，以0.1～0.01MOI接種Vero細(xì)胞，連續(xù)傳代建立種子批系統(tǒng)，主種子批為3aGV9，工作種子批為3aGV12。經(jīng)過多年的科研攻關(guān)，2021年長春生物制品研究所獲得凍干人用狂犬病疫苗(Vero細(xì)胞)生產(chǎn)批件[28]。

2.2.3 PV株在Vero細(xì)胞上的適應(yīng) 談及國內(nèi)的Vero細(xì)胞狂犬病疫苗，不得不提到PV2061株生產(chǎn)的Vero細(xì)胞狂犬病疫苗。2002年遼寧成大引進(jìn)微載體生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，利用巴斯德疫苗PV2061株狂犬病病毒和Vero細(xì)胞，開始研發(fā)純化Vero細(xì)胞狂犬病疫苗(SPEEDA PVRV)。SPEEDA PVRV是國內(nèi)首個基于生物反應(yīng)器技術(shù)純化的人用Vero細(xì)胞狂犬病疫苗，2005年被國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)使用[36]。2017年，Shi N等[37]報道接種SPEEDA PVRV后，狂犬病暴露后具有良好的安全性、免疫原性。這項(xiàng)研究采用兩種接種方案(4針的Zagreb方案和5針的Essen方案)，結(jié)果顯示Zagreb方案在第1次和第2次注射時的不良反應(yīng)發(fā)生率雖高于Essen方案，但兩組之間在第3次和第4次注射時的發(fā)生率也相似。在第42 d，100%的受試者對兩種接種方案都產(chǎn)生了足夠的狂犬病病毒中和抗體濃度 (0.5 IU/mL)。在第180 d和第365 d，抗體水平急劇下降。但是，具有足夠抗體濃度的受試者百分比仍然很高(分別高于75%和50%)。1年后，經(jīng)確認(rèn)的狂犬病病毒暴露受試者均未患狂犬病，并且在第14 d和42 d時，具有足夠抗體濃度的受試者百分比達(dá)到100%。目前，該公司人用狂犬病疫苗年產(chǎn)能達(dá)1 000萬人份，產(chǎn)品主要出口到泰國、菲律賓和埃及等一帶一路國家[38]。

3 結(jié) 語

狂犬病是一種傳統(tǒng)的人獸共患病，在150多個國家和地區(qū)都有發(fā)生。除南極洲外所有大陸都有狂犬病分布，95%以上的人類死亡發(fā)生在亞洲和非洲地區(qū)，主要影響生活在偏遠(yuǎn)農(nóng)村地區(qū)的貧困和脆弱人群，且5～14歲的兒童常常是主要受害者。在全球范圍內(nèi)，每年有2 900多萬人需接受暴露后狂犬病疫苗接種，狂犬病造成的經(jīng)濟(jì)損失估計為每年86億美元[39]。

但狂犬病是一種可以預(yù)防的疾病，接種疫苗是預(yù)防人類狂犬病的最具成本效益的策略。自20世紀(jì)80年代以來，Vero細(xì)胞已被用于生產(chǎn)安全有效的生物治療藥物和疫苗。以Vero細(xì)胞為基質(zhì)生產(chǎn)的狂犬病疫苗在20世紀(jì)80年代也開始應(yīng)用，目前已有40余年的時間，是預(yù)防狂犬病的重要里程碑[40]。因?yàn)閂ero細(xì)胞在限定代次內(nèi)有其獨(dú)特的優(yōu)勢：1)在通用培養(yǎng)基中容易生長，培養(yǎng)系統(tǒng)易于標(biāo)準(zhǔn)化；2)可以在微載體上生長，便于在生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，可以降低生產(chǎn)成本；3)可以建立用于生產(chǎn)的細(xì)胞庫系統(tǒng)，在限定代次內(nèi)能保持傳代細(xì)胞群的一致性和可重復(fù)性，穩(wěn)定可靠[41]。

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的公報，截至2017年8月，全球共23家人類狂犬病疫苗生產(chǎn)供應(yīng)商中，有10家使用Vero細(xì)胞作為細(xì)胞基質(zhì)[42]。我國批簽發(fā)數(shù)據(jù)顯示，2020年全年共簽發(fā)1 755萬人份人用狂犬病疫苗，其中Vero細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)的狂犬病疫苗簽發(fā)量為1 573萬人份，占全年狂犬病疫苗簽發(fā)總量的90%[28]。因此可以認(rèn)為，Vero細(xì)胞生產(chǎn)的人用狂犬病疫苗在預(yù)防狂犬病方面發(fā)揮著重要的作用。但人用狂犬病疫苗的用量越多，說明狂犬病的防治形勢越嚴(yán)峻。很顯然，目前的狂犬病疫情形勢與實(shí)現(xiàn)WHO提出的2030年狂犬病清零目標(biāo)[43]還有差距，這就需要我們齊心協(xié)力、團(tuán)結(jié)合作，一起為消除狂犬病而共同努力。畢竟，不管是哪種細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)的狂犬病疫苗，無論其質(zhì)量如何優(yōu)良、其數(shù)量如何龐大，我們使用疫苗的終極目標(biāo)是消除狂犬病。