徐素萍　黃小芳　劉宇明　蘇荷　李曉寧　羅廷榮

摘要：[目的]對比狂犬病毒固定強毒株CVS-24、廣西街毒株GX074、弱毒株rRC-HL和重組毒株rRC-HLAG感染小鼠后的臨床癥狀及腦組織病理學變化，為揭示狂犬病毒的致病機理提供參考依據(jù)。[方法]將CVS-24、GX074、rRC-HL和rRC-HLAG分別通過腦內(nèi)注射SPF級昆明小鼠，以注射DMEM為對照，每只小鼠注射30μL，攻毒后連續(xù)觀察測量小鼠的體重和死亡情況，采取瀕臨死亡小鼠的腦組織制作石蠟切片，經(jīng)HE染色后觀察腦組織的病理變化。[結(jié)果]與DMEM組的小鼠相比，rRC-HL組小鼠攻毒后的體重先下降后恢復正常，而其他攻毒組小鼠的體重迅速下降直至死亡。DMEM組和rRC-HE組的小鼠在整個試驗周期內(nèi)未見死亡；CVS-24組、GX074組和rRC-HL△G組的小鼠在攻毒后全部發(fā)病死亡，其中，CVS-24組小鼠出現(xiàn)死亡的時間最早（攻毒后第5 d），且在攻毒后第6 d全部死亡。通過觀察小鼠腦組織的病理學變化，發(fā)現(xiàn)rRC-HL組小鼠腦組織的炎癥反應最嚴重，其神經(jīng)纖維紊亂，神經(jīng)元細胞變形，細胞邊緣不清晰，少量細胞固縮甚至消失，海馬回神經(jīng)膠質(zhì)細胞浸潤，嗜神經(jīng)現(xiàn)象明顯，血管套現(xiàn)象嚴重；rRC-HLAG組次之；GX074組和CVS-24組小鼠的腦組織病變輕微，可見少量嗜神經(jīng)現(xiàn)象。[結(jié)論]rRC-HL△G、Gx074和CVS-24等3株狂犬病毒強毒株的臨床癥狀更明顯，發(fā)病死亡率達100%，但與弱毒株相比，其炎癥反應較輕微，說明狂犬病毒強毒株可能是通過抑制機體腦組織中促炎因子的產(chǎn)生而抑制炎癥反應出現(xiàn)，阻斷其固有免疫反應，不利于機體對病毒的清除。

關(guān)鍵詞：狂犬病毒；小鼠；感染；臨床癥狀；腦組織；病理變化

中圖分類號：$852.659.5 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）03-0586-06

0引言

[研究意義]狂犬病是一種致死性嗜神經(jīng)性疾病，可感染包括人類在內(nèi)的幾乎所有哺乳動物?？袢〕适澜缧苑植?，廣泛威脅人畜健康，在發(fā)展中國家尤其嚴重。截至2012年，全球仍然有90多個國家或地區(qū)發(fā)生狂犬病（陳奇，2013）。近10年來，我國累計狂犬病致死人數(shù)約22240人，廣西是狂犬病高發(fā)地區(qū)，僅2004年的狂犬病死亡人數(shù)就達601人（熊毅等，2008）?？梢?，狂犬病已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題。目前尚無針對狂犬病的治療特效藥物，只能通過預防控制其發(fā)生，而疫苗接種是最有效的防控措施（陳奇，2013）。因此，研究狂犬病毒不同毒株的致病性及其病理變化，可為闡明其致病機理和研發(fā)新型疫苗提供參考依據(jù)。[前人研究進展]至今，國內(nèi)外已有關(guān)于狂犬病毒不同毒株致病性及其病理變化差異的研究報道。Etessami等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，缺失G基因的狂犬病毒不能經(jīng)突觸傳播。Yan等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，將表達CVS-N2C或CVS-B2C糖蛋白的SN-10重組病毒株（RN2C和RB2C）接種到大鼠海馬后，病毒主要分布在海馬和大腦皮層；當SN-10重組病毒株表達水皰性口炎病毒的G蛋白時，重組病毒SN-10-VG在海馬的分布顯著增多，說明狂犬病毒G蛋白與病毒在腦內(nèi)的分布有關(guān)。Phares等（2006）通過鼻內(nèi)接種狂犬病毒弱毒株，發(fā)現(xiàn)弱毒株可被小鼠小腦細胞清除，是由于感染狂犬病毒弱毒株后機體血腦屏障通透性增強，病毒中和抗體通過血腦屏障進入腦內(nèi)而對病毒起清除作用。Kuang等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，狂犬病毒弱毒株通過誘導趨化因子而增強血腦屏障的通透性，有利于炎癥細胞侵潤中樞神經(jīng)系統(tǒng)。Ito等（2010）研究表明，狂犬病毒弱毒株rRC-HL在小鼠腦內(nèi)的傳播效率低于致病性毒株R（G 242/255/268），且病毒在小鼠神經(jīng)細胞中表現(xiàn)出明顯不同的分布狀態(tài)。Gomme等（2012）通過對比同一來源的感染和未感染狂犬病毒的小鼠腦細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染狂犬病毒后幸存神經(jīng)元細胞的神經(jīng)突生長能力和微管動力學有所下降，即使在清除病毒后也無法恢復其原有功能，說明狂犬病毒能引起永久性的神經(jīng)損傷。近年來，本課題組從廣西健康犬分離獲得1株狂犬病毒街毒株GX074，該毒株對成年小鼠具有很強的致病性，在NA、BHK和Raw264.7細胞中能抑制IFN-α/β產(chǎn)生，但經(jīng)肌肉或腦內(nèi)接種小鼠至病重時會引起腦內(nèi)高水平的IFN-α/β產(chǎn)生（蔣元，2017）。為驗證GX074的致病性，本課題組又以日本疫苗株RC-HL為骨架，利用反向遺傳技術(shù)替換GX074的G蛋白，構(gòu)建了多個突變體。[本研究切入點]狂犬病毒G蛋白介導病毒與宿主細胞的結(jié)合，影響其在神經(jīng)系統(tǒng)中的分布，與病毒的毒力、致病性密切相關(guān)（周松峰等，2011；王攀等，2017）。G蛋白的微小變化哪怕是一個氨基酸的改變均有可能影響病毒的毒力，Sato等（2015）研究證實狂犬病毒缺失G基因后其轉(zhuǎn)錄水平升高，但免疫原性下降，且G蛋白具有細胞毒性作用。但至今鮮見從臨床癥狀及組織病理學變化角度揭示狂犬病毒G蛋白與其致病性關(guān)聯(lián)的研究報道。[擬解決的關(guān)鍵問題]以狂犬病毒弱毒株rRC-HL為骨架替換廣西街毒株GX074的G基因，構(gòu)建rRC-HL△G重組株，對比CVS-24（固定強毒株）、GX074、rRC-HL和rRC-HL△G感染小鼠后的臨床癥狀及腦組織病理學變化，為揭示狂犬病毒的致病機理提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

CVS-24由亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室保存提供；GX074分離自廣西百色市德?？h市場屠宰犬的腦組織；rRC-HL△G由本課題組應用反向遺傳學技術(shù)拯救獲得；RC-HL是目前日本廣泛應用的疫苗株，由西原株（Nishigahara，Ni）經(jīng)細胞傳代后獲得的固定毒株。4周齡SPF級昆明小鼠購自廣西醫(yī)科大學動物實驗中心，體重約20 g/只。硫酸鋁鉀、蘇木色精、伊紅、氧化汞、石蠟、5%冰乙酸、冰醋酸、4%多聚甲醛（PFA）、乙醇、二甲苯、1%鹽酸酒精、環(huán)保脫蠟劑、中性樹膠等均在使用有效期內(nèi)。主要儀器設備有組織石蠟包埋機、輪轉(zhuǎn)式組織切片機和Nicon ECLIPSE Ti光學顯微鏡等。

1.2動物接種試驗

將CVS-24、GX074、rRC-HL和rRC-HL△G用病毒稀釋液稀釋至1000 FFU/30 μL，腦內(nèi)注射SPF級昆明小鼠，每只小鼠注射30 gL，同時以注射DMEM為對照。每組15只小鼠，攻毒后連續(xù)觀察15 d。在攻毒后小鼠瀕臨死亡時剖解采集腦組織，對照組和rRC-HL組于攻毒后第7 d采集5只小鼠的腦組織，剩余小鼠每天觀察體重變化和l臨床癥狀。

1.3石蠟切片制作

采集的小鼠腦組織用4%PFA固定24 h，流水沖洗4 h，然后進行梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋和切片，石蠟切片經(jīng)烤片后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫〞r小艷和潘麗紅，2014）。

1.4HE染色

石蠟切片放入60℃烤箱中復溫10 min，然后進行脫蠟，蘇木精染色10 min，流水沖洗后用1%鹽酸酒精分化1-2 s，流水返藍15 min。經(jīng)梯度酒精脫水，伊紅復染，中性樹膠封片，Nicon ECLIPSE Ti光學顯微鏡觀察染色結(jié)果，并用NIS-Elements AR 3.2進行圖像采集和分析。

2結(jié)果與分析

2.1臨床癥狀觀察結(jié)果

CVS-24組小鼠在攻毒后第4 d出現(xiàn)毛亂、弓背、蜷縮、極度興奮等癥狀，且發(fā)病后死亡。GX074組小鼠在攻毒后第6 d開始出現(xiàn)臨床癥狀，體重下降，之后發(fā)病癥狀不斷加重，表現(xiàn)為狂躁不安，異常興奮，不停跳動；一般病程較短，發(fā)病后24 h內(nèi)死亡。rRC-HL組小鼠在攻毒后第4 d開始出現(xiàn)臨床癥狀，體重下降，精神沉郁，食欲不振，皮毛雜亂，病癥持續(xù)至攻毒后第8 d，至第9d小鼠恢復正常。rRC-HLAG組小鼠在攻毒后第6 d開始發(fā)病，食欲不振，身體消瘦，體重下降，皮毛雜亂，呆立不動，對刺激敏感，至攻毒后第8-9 d全身震顫，后驅(qū)癱瘓，體溫下降，呼吸衰竭，瀕臨死亡。各處理組小鼠的臨床癥狀詳見表1。

2.2接種病毒后小鼠的體重變化趨勢

由圖1可看出，整個試驗期間DMEM組小鼠的體重持續(xù)上升，而CVS-24組、rRC-HL組和rRC-HL A G組小鼠的體重在攻毒后第3 d開始下降，以CVS-24組小鼠體重的降幅最明顯，rRC-HL組小鼠在攻毒后第8 d其體重逐漸恢復正常。GX074組小鼠的體重在攻毒后第4 d才開始下降，但此處理組小鼠一旦發(fā)病即迅速死亡。

2.3接種病毒后小鼠的死亡情況

由圖2可看出，DMEM組和rRC-HL組的小鼠在整個試驗周期內(nèi)未見死亡。CVS-24組、GX074組和rRC-HLAG組的小鼠在攻毒后全部發(fā)病死亡，其中，CVS-24組小鼠出現(xiàn)死亡的時間最早（攻毒后第5 d），且在攻毒后第6 d全部死亡；GX074組和rRC-HL A G組小鼠分別在攻毒后第6和7 d開始出現(xiàn)死亡，至攻毒后第10 d也全部死亡。

2.4接種病毒后小鼠腦組織的病理學變化

鏡檢發(fā)現(xiàn)，狂犬病毒可引起小鼠非化膿性腦炎，且呈彌漫性炎癥，有大量的血管周圍淋巴細胞管套（圖3-A）、神經(jīng)元壞死、嗜神經(jīng)現(xiàn)象（圖3vB）和膠質(zhì)細胞增生（圖3-C），其病理變化多見于灰質(zhì)區(qū)，特別是腦干、海馬、小腦和脊髓，可見神經(jīng)元被膠質(zhì)細胞替代而構(gòu)成小的神經(jīng)結(jié)節(jié)（圖3-D）。在DMEM組小鼠的腦組織切片未觀察到任何病變，其海馬區(qū)神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)完整，邊緣清晰，胞核胞漿分界清楚（圖3-E）；神經(jīng)膠質(zhì)細胞分布均勻，少量圍繞在血管周圍（圖4-A）。rRC-HL組小鼠的腦組織神經(jīng)纖維紊亂，神經(jīng)元細胞變形，細胞邊緣不清晰，少量細胞固縮甚至消失；海馬回神經(jīng)膠質(zhì)細胞浸潤，嗜神經(jīng)現(xiàn)象明顯，血管套現(xiàn)象嚴重（圖4-B）。CVS-24組和GX074組小鼠的腦組織病變較輕微，可見少量嗜神經(jīng)現(xiàn)象（圖4-C和圖4-D）。rRC-HL△G組小鼠的海馬回膠質(zhì)細胞增生，嗜神經(jīng)現(xiàn)象較明顯（圖4-E）。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，CVS-24組小鼠出現(xiàn)死亡的時間最早，于攻毒后第4 d開始出現(xiàn)毛亂、弓背、蜷縮等臨床癥狀，第6 d全部死亡；但其腦組織病理變化不明顯，可能是由于CVS-24是固定強毒株，能逃避宿主的固有免疫和抗病毒應答（Wang et a1.，2005），因此炎癥反應不明顯。rRC-HL（弱毒株）感染小鼠后發(fā)病較早、病程長，但臨床癥狀較輕微，后期體重恢復正常，小鼠可耐過；其腦組織切片可見大量膠質(zhì)細胞增生，血管套現(xiàn)象嚴重，嗜神經(jīng)現(xiàn)象較多。GX074是廣西街毒株，感染小鼠后第6 d才開始發(fā)病，與弱毒株rRC-HL相比，其發(fā)病時間延后，但病程短，死亡前幾小時異常興奮狂躁，死亡率達100%；腦組織病理切片觀察發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細胞增生不如rRC-HL組小鼠的明顯，可能是由于小鼠快速死亡，尚未及時產(chǎn)生膠質(zhì)細胞，也未形成典型的炎癥反應（聶盼等，2011），故病毒性腦炎癥狀不明顯。由于腦組織內(nèi)缺乏淋巴系統(tǒng)，膠質(zhì)細胞作為其特有的免疫細胞，主要參與修復、吞噬、免疫和炎癥反應（孫紅宇和張卉，2001）。大量增生的膠質(zhì)細胞可能在清除變性壞死神經(jīng)組織碎片的過程中發(fā)揮作用（郝玲等，2011）；此外，膠質(zhì)細胞激活后會釋放細胞因子和細胞毒性物質(zhì)，觸發(fā)免疫應答、激活多種蛋白酶而發(fā)揮殺傷性作用（王大力等，2012）。

G基因被認為是決定狂犬病毒致病性的主要基因（Ito et a1.，2001），其他病毒蛋白基因則對狂犬病毒的致病性和毒力起協(xié)同作用?？袢《綠蛋白介導病毒與宿主細胞的結(jié)合，并影響狂犬病毒在神經(jīng)系統(tǒng)中的分布（周松峰等，2011；王攀等，2017）。本課題組的前期研究將GX074的G基因替換到rRC-HL后拯救獲得rRC-HL△G，該重組病毒株能感染小鼠發(fā)病死亡，與rRC-HL相比，小鼠的臨床癥狀更嚴重，出現(xiàn)全身震顫，后驅(qū)癱瘓，呼吸衰竭，進一步證明狂犬病毒的致死性與G蛋白密切相關(guān)；腦組織病理變化較rRC-HL感染的輕微，則表明狂犬病毒的毒力與G蛋白相關(guān)。rRC-HL△G能100%致死小鼠，腦組織的病理變化相對于GX074感染更嚴重，并引起小鼠固有免疫和抗病毒應答，可能與狂犬病毒的其他基因有關(guān)。雖然目前已有研究報道，狂犬病毒強毒株和弱毒株在宿主體內(nèi)引起不同的免疫應答，但不同毒株感染引起的腦組織病理學變化鮮見報道。本研究通過對比rRC—HL△G、rRC-HL、GX074和CVS-24感染小鼠后的臨床癥狀及腦組織病理學變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rRC-HL△G、GX074和CVS-24等3株強毒株的臨床癥狀更明顯，發(fā)病死亡率達100%，但與弱毒株相比，其炎癥反應較輕微，說明狂犬病毒強毒株可能是通過抑制機體腦組織中促炎因子的產(chǎn)生而抑制炎癥反應出現(xiàn)，阻斷其固有免疫反應，不利于機體對病毒的清除。該結(jié)論對深入研究狂犬病毒的致病機理及制訂科學有效的防控措施具有重要參考價值。

4結(jié)論

rRC-HL△G、GX074和CVS-24等3株狂犬病毒強毒株的臨床癥狀更明顯，發(fā)病死亡率達100%，但與弱毒株相比，其炎癥反應較輕微，說明狂犬病毒強毒株可能是通過抑制機體腦組織中促炎因子的產(chǎn)生而抑制炎癥反應出現(xiàn)，阻斷其固有免疫反應，不利于機體對病毒的清除。

（責任編輯 蘭宗寶）