鄧可新，王曉平，宋孚洋，嚴(yán) 娜，張 旭，鄧光存

牛結(jié)核病(Bovine Tuberculosis,bTB)主要是由牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis,M.bovis)引起的一種人獸共患傳染病，給養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生造成了巨大威脅[1]。該病可通過病牛咳嗽噴出的飛沫或空氣中的帶菌塵埃經(jīng)呼吸道傳播，也可通過攝取帶菌的食物和飲水經(jīng)消化道傳播[2]。研究表明，牛和其它動物可以通過人感染結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)[3]。更重要的是，據(jù)報道，在一些發(fā)展中國家，約10%的人結(jié)核病是由牛分枝桿菌引起的[4]。由于人類和牛的關(guān)系密切，因此，檢測和監(jiān)控牛群中的牛結(jié)核病對人類健康具有重要意義。

目前，研究牛分枝桿菌的基因型方法以基于PCR的分型方法為主，包括以插入序列 6110-限制性片段長度多態(tài)性分析(Insertion sequence 6110-restriction fragment length polymorphism,IS6110-RFLP)、間隔區(qū)寡核苷酸序列多態(tài)性(spoligotyping)分型法、利用數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列分析(variable number of tandem repeats,VNTR)、分枝桿菌散在分布重復(fù)單元 (Mycobacterial interspersed repetitive unit,MIRU)分型法等[5]。IS6110-RFLP方法操作繁瑣，不易數(shù)字化，不利于各實驗室的比較[6]；spoligotyping方法分型速度快，但是具有局限性，分型不夠充分[7]。MIRU-VNTR 方法是應(yīng)用最廣泛的，包括精確的串聯(lián)重復(fù)(ETRs)、分枝桿菌散在重復(fù)單元(MIRUs)、可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)(VNTRs)和QUBs 位點[8]。不同的MIRU-VNTR 位點組合則更適合地域性牛分枝桿菌分子流行病學(xué)研究，對分析病原的遺傳特征，闡述結(jié)核病的發(fā)病機制，追蹤傳染源、傳播途徑以及確定防控策略等具有重要意義[9]。

本研究對我國西北三地奶牛場中 PPD 陽性奶牛的分枝桿菌分離株，采用16S rRNA、MPT64以及多位點PCR方法進行菌株分型鑒定，并利用 MIRU-VNTR 基因分型技術(shù)了解其基因型及分布特征，以期為奶牛場牛結(jié)核病的防控和促進養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 30株臨床分離株通過鼻拭子(23株)和咽拭子(7株)采集的方法從甘肅、新疆和寧夏的規(guī)?；膛霾杉?3株采自甘肅,6株采自寧夏，其余21株采自新疆)，并置于-80 ℃冰箱凍存。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(ATCC-27294)：由中國疾病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實驗室提供。

1.2 主要實驗試劑以及儀器設(shè)備

1.2.1 試劑 改良羅氏培養(yǎng)基(海博，中國)；G+細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(莊盟，中國)；2×Power Taq MasterMix(康為世紀(jì)，中國)；GelRed核酸染料(Biotium公司，美國)；TAE緩沖液(50×)(索萊寶，中國)；100 bp DNA Ladder(Thermo公司，美國)；2 000 bp DNA Ladder(Thermo公司，美國)；TE緩沖液(天根，中國)。

1.2.2 儀器 NanoDrop 8000(美國Thermo公司)；水平電泳槽(美國BIO-RAD公司)；PCR儀(美國BIO-RAD公司)；凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)。

1.3 牛源臨床分離株的培養(yǎng) 將分離株均勻接種至酸性羅氏培養(yǎng)基斜面上，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4周后，培養(yǎng)基斜面上出現(xiàn)菜花樣菌落，然后在羅氏培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)4～8周后，將菌種滅活置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.4 細(xì)菌基因組DNA的提取 使用G+細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司，中國)對分離株基因組DNA進行提取，并采用瓊脂糖凝膠電泳方法鑒定。

1.5 細(xì)菌的PCR分析鑒定 采用16S rRNA基因、MTP64基因和分枝桿菌復(fù)合種群鑒定基因16S rRNA、MPT64、Rv3349、Rv0577、Rv1510、RV3877/8、Rv1970、Rv3120多位點基因?qū)Ψ蛛x株進行菌株種屬鑒定(引物序列見表1)。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×Power Taq MasterMix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板(10 μmol/L)1 μL，ddH2O 7 μL。PCR擴增程序：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性 1 min，60 ℃退火1 min和72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃充分延伸 10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳(100 V)電泳30 min鑒定，以標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv作為陽性對照，以2 000 bp DNA Marker作為分子量參照物。采用Image Lab 軟件(BIO-RAD，美國)對凝膠圖像進行分析，結(jié)果判定依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表1 牛源分枝桿菌多位點分型引物及MIRU-VNTR引物表Tab.1 Multi-locus typing primers for Mycobacterium bovine and MIRU-VNTR primers

1.6 MIRU-VNTR分析 采用 15 位點MIRU-VNTR 對分離株進行基因分型研究，各位點引物序列詳見表 1。PCR反應(yīng)體系(10 μL)：2×Taq Master Mix 5 μL;上下游引物(10 μmol/L)各1 μL;DNA 模板1 μL;ddH2O 1 μL;DMSO 1 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 10 min；95 ℃變性 1 min，Tm溫度退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，40 個循環(huán)；72 ℃充分延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳(100 V)電泳40 min鑒定，以100 bp DNA marker作為分子量參照物，以標(biāo)準(zhǔn)菌株 H37Rv作為陽性對照，ddH2O作為陰性對照，采用BIO-RAD 凝膠成像儀分析凝膠圖像，通過拷貝數(shù)計算公式得到待檢菌株各位點的重復(fù)次數(shù)。

1.7 VNTR拷貝數(shù)結(jié)果分析 采用凝膠成像系統(tǒng)配套的 Image Lab 軟件對本電泳結(jié)果進行分析。根據(jù)MIRU-VNTR拷貝數(shù)計算公式進行判定：R=Rc+(Mx-Mc)/U，其中，Rc：標(biāo)準(zhǔn)菌株(H37Rv)在該位點的重復(fù)序列拷貝數(shù)；R：待檢菌株在該位點重復(fù)序列的拷貝數(shù)；Mx：待測菌株在該位點的分子量大?。籑c：參照菌株(H37Rv)在該位點的分子量大??；U：該位點的重復(fù)序列的堿基數(shù)。使用SPSS軟件分析拷貝數(shù)結(jié)果，定義：若分枝桿菌分離株具有完全相同MIRU-VNTR基因型且≥2株，認(rèn)為成簇。

成簇率計算公式：成簇率=(NC-C)/N×100%，其中，N：代表結(jié)核分枝桿菌分離株總數(shù)；C：代表結(jié)核分枝桿菌分離株所形成的簇數(shù)；Nc：代表成簇的結(jié)核分枝桿菌分離株總數(shù)。成簇率可以評價某地區(qū)菌株的近期傳播情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件的系統(tǒng)聚類功能對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 牛源臨床分離株的培養(yǎng)結(jié)果 30株臨床株在羅氏培養(yǎng)基內(nèi)生長狀態(tài)良好，菌落呈干燥不透明的米黃色菜花樣菌落。

2.2 牛源臨床分離株的PCR分型鑒定 以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株 H37Rv核酸為陽性對照，ddH2O為陰性對照，合成分枝桿菌屬16S rRNA特異性引物。通過PCR技術(shù)鑒定30株牛源臨床分離株16SrRNA序列。結(jié)果顯示，30株分離株16SrRNAPCR產(chǎn)物均擴增出陽性條帶。進一步將產(chǎn)物測序，并將測序結(jié)果進行同源性比對，一致性為100%，表明30株牛源臨床分離株均為分枝桿菌(圖1A)。

注:A為16S rRNA擴增結(jié)果,目的片段:543 bp;B為MPT64擴增結(jié)果,目的片段240 bp;M為2 000 bp DNA Marker;NC為陰性對照(以dd水為PCR模板);PC為陽性對照(以標(biāo)準(zhǔn)株 H37Rv DNA為模板)。圖1 牛源分枝桿菌臨床株16S rRNA及MPT64擴增結(jié)果Fig.1 Results of amplification of clinical strain 16S rRNA and MPT64 of Mycobacterium bovine

以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株 H37Rv核酸為陽性對照，ddH2O為陰性對照，合成結(jié)核分枝桿菌MPT64基因特異性引物。通過PCR技術(shù)鑒定30株牛源分枝桿菌臨床株MPT64基因序列。結(jié)果顯示，12株擴增產(chǎn)物均為陽性條帶，其它分離株擴增產(chǎn)物為陰性條帶，表明30株牛源分枝桿菌中有12株屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(圖1B)。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群在采集自3個地區(qū)30株分離株中的占比情況如下：甘肅0株(0/3)，寧夏0株(0/6)，新疆12株(57.1%，12/21)。

進一步采用多位點PCR鑒定法，通過16SrRNA、Rv0577、Rv3349、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8和Rv3120 7個位點鑒定12株MTBC亞型。結(jié)果顯示，12株MTBC中，9株為牛分枝桿菌，2株為人結(jié)核分枝桿菌，1株為牛分枝桿菌BCG(圖2)。

注:A為標(biāo)準(zhǔn)株 H37Rv 多位點PCR產(chǎn)物電泳;B為陰性對照多位點PCR產(chǎn)物電泳;C為人結(jié)核分枝桿菌多位點PCR產(chǎn)物電泳;D為牛分枝桿菌多位點PCR產(chǎn)物電泳;E為牛分枝桿菌BCG多位點PCR產(chǎn)物電泳;F為非結(jié)核分枝桿菌多位點PCR電泳產(chǎn)物;M為2 000 bp DNA Marker;1～7號泳道分別為16S rRNA(543 bp)、Rv3120(404 bp)、Rv0577(786 bp)、IS1561(943 bp)、Rv1510(1 033 bp)、Rvl970(1 116 bp)、Rv3877/8(999 bp)PCR產(chǎn)物。圖2 結(jié)核分枝桿菌分離株多位點PCR電泳結(jié)果Fig.2 Multi-site PCR electrophoresis results of Mycobacterium tuberculosis isolates

表2 30株牛源分枝桿菌MPT64和多位點鑒定結(jié)果Tab.2 MPT64 and multiple locus identification of 30 Mycobacterium bovine strains

2.3 MIRU-VNTR PCR結(jié)果 采用 Image Lab 軟件對 MIRU 4、MIRU 10、Mtub 39、MIRU 40、Mtub04、ETR-C、MIRU16、Mtub21、Mtub30、ETR-B、MIRU24、MIRU 26、ETR-E、QUB26、QUB11b 共 15 個MIRU-VNTR 位點的PCR電泳圖譜(圖3)進行定量分析(圖4B)，得到 12 株MTBC臨床株的拷貝數(shù)(圖4A)。

2.4 MIRU-VNTR聚類結(jié)果 使用SPSS統(tǒng)計軟件對12株MTBC的15個VNTR位點拷貝數(shù)進行聚類分析(圖4C)。12株MTBC呈現(xiàn)出10種VNTR基因型，其中8株為單一基因型，即一株菌代表一種基因型，占所有菌株的66.7%；其余4株(33.3%)每2株聚集成一個基因簇，每一基因簇代表一種基因型，共聚集成兩個基因簇，菌株成簇率為16.7%。根據(jù)聚類圖可知，兩個基因簇具有較近的親緣關(guān)系，聚類為一個較大的基因群，同一基因簇中的菌株來自于新疆地區(qū)的同一牛場，且不同簇來源于不同牛場。

注:M為100 bp DNA Ladder;A為標(biāo)準(zhǔn)株 H37Rv(陽性對照)15個VNTR基因位點多態(tài)性:B為結(jié)核分枝桿菌在MIRU 24(左1-8)和MIRU 26(右1-8)兩個基因位點多態(tài)性檢測結(jié)果;C為結(jié)核分枝桿菌在QUB26(1-8)和Mtub21(9-16)兩個基因位點多態(tài)性檢測結(jié)果;D為結(jié)核分枝桿菌在MIRU 4(左1-8)和Mtub39(右1-8)兩個基因位點多態(tài)性檢測結(jié)果;E為結(jié)核分枝桿菌在MIRU 10(左1-8)和MIRU 40(右1-8)兩個基因位點多態(tài)性檢測結(jié)果;F為結(jié)核分枝桿菌在Mtub 30和ETR-B兩個基因位點多態(tài)性檢測結(jié)果;G為結(jié)核分枝桿菌在ETR-C(左1-8)和MTUB 04(右1-8)兩個基因位點多態(tài)性檢測結(jié)果;H為結(jié)核分枝桿菌在ETR-E(左1-8)和MIRU 16(右1-8)兩個基因位點多態(tài)性檢測結(jié)果;I為結(jié)核分枝桿菌在QUB11b(1-8)位點多態(tài)性檢測結(jié)果。圖3 MIRU-VNTR 15 位點電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis results of MIRU-VNTR 15 site

注:A.12株MTBC MIRU-VNTR 15 位點拷貝數(shù);B.Image Lab 軟件對 M.b14 號分離株 Mtub 21 位點電泳條帶分析結(jié)果;C.標(biāo)準(zhǔn)株 H37Rv 和 12 株 MTBC 臨床株的系統(tǒng)聚類圖(紅框內(nèi)的菌株聚集為一個基因簇)。圖4 MIRU-VNTR聚類分析結(jié)果Fig.4 Results of MIRU-VNTR cluster analysis

3 討 論

目前，結(jié)核病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，人獸感染狀況居高不下，危害極其嚴(yán)重[15]。MTBC的基因分型鑒定能夠追蹤其傳染源和傳播途徑，了解感染的優(yōu)勢菌株，鑒別外源性感染或內(nèi)源性復(fù)發(fā)，對于地理區(qū)域性防控牛結(jié)核病具有重要意義。本研究通過結(jié)核分枝桿菌多位點鑒定基因PCR鑒定的相關(guān)結(jié)果提示，新疆地區(qū)養(yǎng)殖場中存在結(jié)核分枝桿菌，這一結(jié)果與相關(guān)報道一致。有研究發(fā)現(xiàn)，新疆地區(qū)8個規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場中的乳樣和糞便中都分離出結(jié)核分枝桿菌[2]，推測可能是攜帶Mtb的人員流動并傳染給奶牛。且MTBC以牛分枝桿菌為主，這一結(jié)果與已有報道一致。王巖、林康等的研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖場環(huán)境來源的MTBC以牛分枝桿菌為主[16-17]，推測牛分枝桿菌存在于感染奶牛的糞便及污染養(yǎng)殖場的土壤、飲水和飼料中，提示奶牛養(yǎng)殖場應(yīng)做好牛分枝桿菌的防控工作。

對MIRU-VNTR 的 15 個位點的PCR結(jié)果進行聚類分析，12 株結(jié)核分枝桿菌呈現(xiàn)出 10 種VNTR 基因型。其中 8 株為單一基因型，即一株菌代表一種基因型，這些分離株呈現(xiàn)單獨基因型，推測該菌株相互獨立，可能不具有地域流行特點；根據(jù)聚類圖可知，兩個基因簇包含 4 株分離株并且具有相似的基因型，推測該基因型是新疆地區(qū)奶牛場結(jié)核分枝桿菌中主要流行的基因型。

總之，本研究為我國甘肅、新疆和寧夏地區(qū)奶牛場牛結(jié)核病的防控和促進養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展提供一定依據(jù)。