王麗梅,姜 泓,康 健,靳芊芊

結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)感染的慢性傳染病。全球每年TB新發(fā)患者約1 000萬，目前約1/3的人口已潛伏感染Mtb，其中5%～10%的人終會發(fā)展為TB患者。我國是TB高負擔(dān)國家，TB患者數(shù)位居世界第3[1]?？ń槊?BCG)是目前用于預(yù)防TB的唯一疫苗，但其僅對兒童TB具有較好的保護效果，對成人TB卻無保護[2]。因此，研制新型TB疫苗成為防控TB迫切需要解決的科學(xué)問題。

腺病毒是一種無包膜的雙鏈 DNA 病毒，宿主范圍廣，不整合到人體基因，可以承載較大的外源基因片段，是一種廣泛應(yīng)用的疫苗抗原遞送載體。腺病毒載體遞送的疫苗靶抗原能高效刺激機體產(chǎn)生針對靶抗原的體液和細胞免疫應(yīng)答。同時，腺病毒載體還可通過腸道或呼吸道進行黏膜免疫，并能夠制成不同的劑型如凍干粉、口服等延長保存期[3]。目前腺病毒載體已被廣泛應(yīng)用到多種病原體疫苗的研究，如埃博拉病毒、人類免疫缺陷病毒、流感病毒、惡性瘧原蟲和丙型肝炎病毒等的疫苗研究[4]。2020年，基于人血清5 型腺病毒 (Adenovirus 5,Ad5)載體的新型冠狀病毒肺炎疫苗(Ad5-nCoV)被成功用于人群預(yù)防2019新型冠狀病毒感染的免疫接種。臨床研究數(shù)據(jù)表明，該疫苗單劑接種的保護效力可達74.8%，對重癥新型冠狀病毒肺炎的保護效力達100%，未發(fā)生與疫苗相關(guān)的嚴重不良反應(yīng)事件[5-6]。

本研究利用非復(fù)制的人血清5型腺病毒載體，構(gòu)建雙啟動子表達結(jié)核分枝桿菌增殖期優(yōu)勢抗原融合蛋白和休眠期優(yōu)勢抗原融合蛋白的重組腺病毒，為其用于結(jié)核病新型疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 質(zhì)粒、細胞及菌株 pAdTrack-CMV質(zhì)粒和pAdeasy-1質(zhì)粒購自上海漢恒生物科技有限公司，pMDTM18-T質(zhì)粒購自日本TaKaRa公司。人胚胎腎細胞(HEK293細胞)、小鼠巨噬細胞Raw264.7、大腸埃希菌DH5α菌株、含有Mtb Ag85B和ESAT-6抗原的融合蛋白基因質(zhì)粒pDE22-Ag85B-ESAT6、含有Mtb Rv2031c和Rv2626c抗原的融合蛋白基因質(zhì)粒pDE22-Rv2031c-Rv2626c，均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、PvuⅠ、AluⅠ、XhoⅠ、DNA marker 2000等購自日本TaKaRa公司；HB-infusionTM無縫克隆試劑盒、LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑購自上海漢恒生物科技有限公司；DMEM、胎牛血清和胰酶購自美國Hyclone公司；膠回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；質(zhì)粒DNA小量、大量提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；病毒基因組提取試劑盒購自北京天根生化科技北京有限公司；抗Ag85B 單克隆抗體(mAb)、抗ESAT-6 mAb、抗Rv2031c mAb和抗Rv2626c mAb均購自英國Abcam公司；FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；Adneo-X TM raid Titer Kit 腺病毒滴度測定試劑盒(殼蛋白免疫法)購自日本 TaKaRa 公司；1 mL Qhp預(yù)裝柱、1 mL Capto Core 700預(yù)裝柱、AKTA純化儀(AKTA primeplus)購自美國 GE 公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 EF1α啟動子DNA合成 根據(jù)GenBank公布的人EF1α啟動子的DNA序列(MZ648044.1)，設(shè)計合成EF1α啟動子的 DNA片段，并在片段的5′端引入PvuI限制性內(nèi)切酶位點，3′端引入AluI限制性內(nèi)切酶位點，具體序列如下：AAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGA-GCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTT-GGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTG-CCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGG-AAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTT-TTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATA-AGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTT-CGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTG-AAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCA-CGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATC-CACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCC-CGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGC-CGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGA-GACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGA-GCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGC-TTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACG-TCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTT-ACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTAC。EF1α啟動子的DNA片段由上海金斯特生物公司合成。

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank公布的人EF1α啟動子序列、以及本課題組前期構(gòu)建的AE[6]、R2[7]融合蛋白基因序列，應(yīng)用Primer 7.0設(shè)計6條PCR擴增引物，見表1。

表1 PCR引物Tab.1 PCR primers

1.2.3 AE和R2融合蛋白基因的PCR擴增 以pDE22-Ag85B-ESAT6 質(zhì)粒和pDE22-Rv2031c-Rv2626c質(zhì)粒為模板，分別應(yīng)用引物AE-F/AE-R和R2-F/R2-R PCR 擴增AE、R2基因。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 再延伸10 min。將擴增片段連接至pMD18-T載體，構(gòu)建克隆質(zhì)粒18T-AE和18T-R2，并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)，挑取陽性菌落進行液體培養(yǎng)，陽性菌液送測序公司進行測序鑒定。

1.2.4 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAd-AE-R2的構(gòu)建 將質(zhì)粒18T-AE、合成的EF1α DNA片段和質(zhì)粒18T-R2分別用KpnⅠ和PvuⅠ、PvuⅠ和AluⅠ、AluⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后回收目的基因片段。將回收的目的基因片段依次與相應(yīng)酶切的pAdTrack-CMV載體采用HB-infusionTM進行無縫克隆連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α菌株，挑取陽性菌落進行液體培養(yǎng)，陽性菌液送測序公司進行測序鑒定。

1.2.5 重組腺病毒Ad-AE-R2的包裝 將pAd-AE-R2穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒pAdeasy-1用PacI單酶切進行線性化處理，酶切產(chǎn)物用無水乙醇沉淀回收，并將線性化質(zhì)粒2 μg與2 μL LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染HEK293單層細胞中，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，7～10 d后，待細胞出現(xiàn)細胞病變后收集HEK293細胞，并反復(fù)凍融3次，之后重新接種HEK293細胞進行擴增，收集獲得的Ad-AE-R2重組腺病毒，并進行病毒純化和滴度的測定。

1.2.6 AE、R2靶基因表達的RT-PCR檢測 以MOI=1∶5接種純化的Ad-AE-R2重組腺病毒于培養(yǎng)的HEK293單層細胞，48 h后提取細胞總RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄cDNA。以3 μL cDNA為模板，以AE、R2特異性引物進行RT-PCR。PCR擴增的反應(yīng)體系:12.5 μL 2×Mix buffer,上、下游引物各0.25 μL，雙蒸水12 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，94 ℃變性 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。以hGAPDH作為內(nèi)參對照。

1.2.7 AE、R2目的蛋白的間接免疫熒光(IFA)檢測 將Ad-AE-R2重組腺病毒以MOI=1∶5接種于培養(yǎng)在玻片上的小鼠Raw264.7單層細胞中，12 h后終止培養(yǎng)。PBS漂洗細胞3次后，用冷丙酮固定細胞15 min；PBS漂洗后加入1% 牛血清白蛋白BSA，37 ℃封閉1 h；棄去封閉液，加入含1% BSA PBS稀釋的一抗，一抗分別為Ag85B mAb，ESAT-6 mAb，Rv2031c mAb和Rv2626c mAb，37 ℃ 2 h；漂洗后加入Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，37 ℃ 1 h；漂洗后，加入DAPI進行細胞核染色，室溫10 min。漂洗后，用50%的甘油水溶液進行封片，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 重組腺病毒pAd-AE-R2穿梭載體的構(gòu)建 利用限制性酶切和無縫克隆技術(shù)，構(gòu)建CMV和EF1α雙啟動子分別表達AE和R2融合蛋白的重組腺病毒穿梭載體 pAd-AE-R2，并進行測序鑒定。測序結(jié)果表明，pAd-AE-R2重組載體中的AE、R2基因片段大小和核苷酸序列完全正確。

2.2 重組腺病毒Ad-AE-R2的包裝和純化 將重組腺病毒穿梭載體pAd-AE-R2與pAdeasy-1骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293單層細胞，包裝重組腺病毒Ad-AE-R2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染的HEK293單層細胞在培養(yǎng)約7～10 d左右，大部分細胞變圓、聚集，出現(xiàn)細胞病變并從底部脫落，如圖1所見，表明轉(zhuǎn)染的HEK293細胞中能夠包裝出重組腺病毒。將包裝的重組腺病毒擴大培養(yǎng)、純化，并進行病毒滴度測定，結(jié)果Ad-AE-R2重組腺病毒經(jīng)純化后的滴度可達1.26×1011PFU/mL。

注：A為正常的HEK293細胞;B為pAd-AE-R2穿梭載體與骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的HEK293細胞。圖1 重組腺病毒Ad-AE-R2的包裝Fig.1 Packaging of recombinant adenovirus Ad-AE-R2

2.3 AE和R2基因轉(zhuǎn)錄水平的RT-PCR鑒定 重組腺病毒Ad-AE-R2感染HEK293細胞，用RT-PCR對感染細胞中AE和R2基因的轉(zhuǎn)錄水平進行鑒定。Ad-AE-R2感染HEK293細胞后，AE和R2重組基因均能夠在細胞中被轉(zhuǎn)錄，且基因的轉(zhuǎn)錄水平高于內(nèi)參基因hGAPDH的，表明Ad-AE-R2能夠特異性地轉(zhuǎn)錄表達AE和R2基因，見圖2。

圖2 RT-PCR檢測Ad-AE-R2感染HEK293細胞中AE和R2基因的轉(zhuǎn)錄水平Fig.2 Transcription levels of AE and R2 genes in Ad-AE-R2 infected HEK293 cells,detected by RT-PCR

2.4 AE和R2蛋白表達的間接免疫熒光(IFA)鑒定 用Mtb抗原的mAbs對Ad-AE-R2感染小鼠巨噬細胞中的AE和R2融合蛋白進行IFA檢測。結(jié)果如圖3所示，anti-Ag85B mAb、anti-ESAT-6 mAb、anti-Rv2031c mAb和anti-Rv2626c mAb 4種抗體均能檢測到感染細胞中有特異性的綠色熒光表達，表明Ad-AE-R2重組腺病毒感染細胞后能夠在細胞內(nèi)正確地表達AE和R2融合蛋白。

注：A為腺病毒空載體(AdC)感染的巨噬細胞；B-E為Ad-AE-R2感染的巨噬細胞；B為Anti-Ag85B mAb的IFA 檢測；C為Anti-ESAT-6 mAb的IFA 檢測；D為Anti-Rv2031c mAb的IFA檢測；E為Anti-Rv2626c mAb的IFA檢測。圖3 重組腺病毒Ad-AE-R2感染小鼠巨噬細胞中AE和R2融合蛋白的IFA檢測Fig.3 Expression of fusion proteins of AE and R2 in mouse macrophages infected with the recombinant adenovirus Ad-AE-R2,detected by IFA

3 討 論

腺病毒作為疫苗遞送載體目前已被廣泛用于各類疾病的疫苗研究。雖然大部分人體內(nèi)會含有針對腺病毒的特異性抗體，影響以腺病毒為載體的疫苗的免疫保護效果，但由于腺病毒免疫原性強、安全性好，其作為疫苗遞送載體仍具有很高的科研和臨床應(yīng)用價值[4]。尤其是基于腺病毒載體的新型冠狀病毒肺炎疫苗的成功應(yīng)用，進一步肯定了腺病毒載體疫苗的研究前景[5-6]。腺病毒有100種以上的血清型，但大多數(shù)腺病毒載體以人血清5型腺病毒(Ad5)和人血清2型腺病毒(Ad2)為基礎(chǔ)[3]。腺病毒載體分為3代，目前研究的腺病毒載體疫苗大多基于第一代腺病毒載體進行研制。第一代腺病毒載體缺失E1和E3基因，是一類腺病毒復(fù)制缺陷的載體，能夠引發(fā)機體產(chǎn)生較強的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，但該類載體僅適合于在細胞內(nèi)外的瞬時轉(zhuǎn)染，如果需要進行重組腺病毒的復(fù)制，必須在含有E1區(qū)基因表達的細胞內(nèi)進行復(fù)制，如HEK293細胞[9]。

本研究選用的腺病毒載體是一種E1區(qū)基因缺失的人血清5型的復(fù)制缺陷型腺病毒(Ad5)，利用該載體的CMV啟動子，表達Mtb增殖期的兩個優(yōu)勢抗原Ag85B與ESAT-6的融合蛋白基因AE。Ag85B是Mtb胞壁中含量較為豐富，且具有強烈免疫原性的一個抗原[10]，ESAT-6是致病性分枝桿菌與非致病性分枝桿菌的一個差異蛋白，也具有良好的免疫原性[11]。大量研究已表明Ag85B和ESAT-6作為疫苗的靶抗原能夠有力抵抗Mtb感染[12]。為了能夠使重組腺病毒載體攜帶表達更多的Mtb抗原，本研究在該腺病毒載體中增加了人延長因子EF1α啟動子，并利用該啟動子表達Mtb休眠期的兩個優(yōu)勢抗原Rv2031c和Rv2626c的融合蛋白基因R2，從而使該重組腺病毒載體攜帶更全面的Mtb抗原，全面刺激機體產(chǎn)生抗Mtb感染的保護性免疫。Mtb致病機制復(fù)雜，其在體內(nèi)可以休眠菌的狀態(tài)存在，而休眠期的Mtb可特異性轉(zhuǎn)錄表達一組與其休眠相關(guān)的抗原，將這些抗原作為疫苗的靶抗原，可以增強疫苗對Mtb休眠菌的免疫識別，從而增強疫苗的免疫保護效果[13]。將Mtb增殖期和休眠期抗原即Mtb多階段抗原共同作為疫苗的靶抗原，是當(dāng)前TB新型疫苗研究的趨勢。

本研究利用Ad5腺病毒載體作為疫苗抗原遞送載體，遞送表達Mtb多階段抗原融合蛋白AE和R2。結(jié)果表明，構(gòu)建的重組腺病毒Ad-AE-R2能夠高效轉(zhuǎn)錄AE和R2融合蛋白基因，并正確表達AE和R2融合蛋白，為其用于TB新型疫苗的研究奠定了工作基礎(chǔ)。