王薪默 ，曾朝旺 ，陳旺 ，劉瀟璇 ，朱丹丹

（1. 中國(guó)藥科大學(xué) 天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009；中國(guó)藥科大學(xué) 藥物科學(xué)研究院高端藥物制劑與材料研究中心，江蘇 南京 210009）

1 引言

基因治療（gene therapy）是將核酸藥物導(dǎo)入到患者特定的靶細(xì)胞中，以調(diào)控或糾正疾病相關(guān)基因的表達(dá)，從而在基因水平高效精準(zhǔn)地治療相關(guān)疾病，為癌癥、遺傳性疾病、自身免疫性疾病和傳染性疾病等重大疾病的治療帶來(lái)了曙光[1]。目前為止，已有20余款核酸類治療產(chǎn)品被批準(zhǔn)用于疾病治療（見圖1）[2]，包括質(zhì)粒DNA（plasmid DNA，pDNA）、信使RNA（messenger RNA，mRNA）、反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）和小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）等。值得一提的是，新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）疫情發(fā)生后，mRNA疫苗得到快速研發(fā)并率先獲批上市，為遏制疫情的擴(kuò)散作出了巨大貢獻(xiàn)，使得核酸藥物被大眾所熟知，也將核酸藥物的研發(fā)與投資推向新的高潮[3]。

圖1 已獲批上市的核酸類治療產(chǎn)品Figure 1 The approved nucleic acid therapeutics

核酸藥物可以突破傳統(tǒng)藥物靶點(diǎn)的“難以成藥性”和“不可成藥性”，在新藥研發(fā)中備受青睞。然而，核酸藥物的研發(fā)和臨床轉(zhuǎn)化主要面臨著以下3個(gè)挑戰(zhàn)。1）體內(nèi)不穩(wěn)定性：核酸藥物在血液循環(huán)中極易被核酸酶降解，也易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（reticuloendothelial system，RES）識(shí)別并清除[4]；2）入胞困難：核酸藥物是帶負(fù)電荷的親水性分子，不易穿透同樣帶負(fù)電的細(xì)胞膜，因此難以進(jìn)入靶細(xì)胞發(fā)揮相應(yīng)的功能[5]；3）免疫原性：外源性核酸在體內(nèi)常被識(shí)別為病原相關(guān)分子模式（pathogenassociated molecular pattern，PAMP），作為病毒感染信號(hào)引起機(jī)體的先天免疫[6]。因此，開發(fā)高效安全的核酸藥物遞送系統(tǒng)是提高核酸藥物成藥性、推動(dòng)基因治療臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟。

目前常見的核酸藥物載體主要分為病毒類載體和非病毒類載體[7]。盡管病毒類載體的轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較高，但其存在免疫原性高、易整合到宿主基因序列、負(fù)載核酸藥物分子大小受限、研發(fā)成本高、大規(guī)模生產(chǎn)困難等問題[8]。不同于病毒類載體，非病毒類載體具有免疫原性低、安全性高、易制備等優(yōu)點(diǎn)[9]。它們能與核酸藥物分子形成穩(wěn)定的復(fù)合物，避免其被核酸酶降解和被RES系統(tǒng)識(shí)別清除，輸送至病變部位后，即可進(jìn)入靶細(xì)胞發(fā)揮治療作用[10]。首個(gè)上市的siRNA藥物Onpattro和COVID-19 mRNA疫苗都是基于脂質(zhì)納米顆粒的核酸藥物制劑[2]，進(jìn)一步鼓舞人們致力開發(fā)安全高效的非病毒核酸遞送載體。尤為重要的是，非病毒類載體還能根據(jù)藥物遞送需求進(jìn)行定制，例如根據(jù)疾病病理特征設(shè)計(jì)刺激響應(yīng)型的遞送載體，實(shí)現(xiàn)核酸藥物的按需遞送，從而提高其療效[11]。

疾病部位的氧化還原環(huán)境與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，例如活性氧（reactive oxygen species，ROS）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）的異常[12]。因此，研究者利用這一病理特征，借助于氧化還原敏感基團(tuán)，開發(fā)了一系列氧化還原響應(yīng)型藥物遞送系統(tǒng)，用于實(shí)現(xiàn)核酸藥物在腫瘤治療中的按需遞送。這些敏感基團(tuán)在病變部位異常氧化還原環(huán)境的刺激下，會(huì)發(fā)生斷裂或性質(zhì)的改變，使得遞送系統(tǒng)解交聯(lián)或解組裝，特異性釋放出負(fù)載的核酸藥物，從而實(shí)現(xiàn)其按需遞送，以提高其治療效果[12-13]。本文將介紹疾病部位的氧化還原微環(huán)境，歸納和總結(jié)氧化還原響應(yīng)型核酸藥物遞送系統(tǒng)在癌癥及炎癥等疾病治療中的最新研究進(jìn)展，并討論氧化還原響應(yīng)型核酸遞送系統(tǒng)的合理構(gòu)建與設(shè)計(jì)。

2 疾病部位的氧化還原微環(huán)境

生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)通常會(huì)維持在相對(duì)平衡的狀態(tài)，這對(duì)體內(nèi)各種生理功能的調(diào)節(jié)十分重要[14]。當(dāng)機(jī)體受到外界環(huán)境刺激或相關(guān)信號(hào)調(diào)控時(shí)，體內(nèi)的氧化性物質(zhì)或還原性物質(zhì)隨即發(fā)生相應(yīng)的改變，進(jìn)而打破氧化還原平衡穩(wěn)態(tài)[15]。病理狀態(tài)下，疾病部位細(xì)胞的線粒體功能紊亂、能量代謝異常以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能改變等均會(huì)導(dǎo)致其氧化還原狀態(tài)失衡（見圖2）[16]。

圖2 疾病部位氧化還原微環(huán)境示意圖Figure 2 Schematic illustration of redox microenvironment in diseased tissues

其中，作為細(xì)胞內(nèi)典型的氧化性物質(zhì)，ROS主要依賴于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶（NOX）家族產(chǎn)生，包括O2?-、H2O2、?OH、RO?及1O2等[15,17-18]。生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)ROS往往維持在一個(gè)較低的水平（0.02 ～ 1 μmol · L-1）；然而，在腫瘤或炎癥等疾病組織，細(xì)胞內(nèi)ROS水平會(huì)大幅上升（50 ～ 100 μmol · L-1），打破胞內(nèi)原有的氧化還原穩(wěn)態(tài)，使細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸瘧?yīng)激（oxygen stress）狀態(tài)[19-20]。過高的ROS水平通常會(huì)對(duì)胞內(nèi)的功能分子造成不可逆的損傷，從而加劇疾病的進(jìn)展，如腫瘤、炎癥相關(guān)疾病、神經(jīng)退行性疾病等[21]。

為了維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的動(dòng)態(tài)平衡，細(xì)胞內(nèi)有相應(yīng)的還原性物質(zhì)可下調(diào)ROS，如GSH、Vc、TrxR、Fe2+和GILT等[22]。作為胞內(nèi)主要的還原性物質(zhì)，GSH結(jié)構(gòu)中半胱氨酸上的巰基是主要的活性基團(tuán)，其可以通過形成GSSG氧化態(tài)的方式消耗細(xì)胞中的ROS[23]。這對(duì)調(diào)控胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)和維持機(jī)體正常的生理功能至關(guān)重要。此外，許多疾病部位的GSH水平也較高，例如腫瘤組 織 中 的GSH濃 度 高 達(dá)2 ～ 10 mmol · L-1，至 少是正常組織中的4倍[24]?；诖?，借助ROS和GSH在生理環(huán)境與病理環(huán)境中的濃度梯度差異，研究者開發(fā)了一系列氧化還原響應(yīng)型遞送載體并將其廣泛應(yīng)用于核酸藥物的遞送，為個(gè)性化治療提供可能。

3 氧化響應(yīng)型載體用于核酸藥物遞送

利用腫瘤和某些炎癥等疾病微環(huán)境中高ROS水平特征，研究者們?cè)O(shè)計(jì)開發(fā)了一系列ROS響應(yīng)型核酸藥物遞送載體，用于實(shí)現(xiàn)核酸藥物的按需遞送，進(jìn)而提高相關(guān)疾病治療效率[13,20,25]。其中，ROS響應(yīng)部分的設(shè)計(jì)是實(shí)現(xiàn)核酸藥物精準(zhǔn)遞送的關(guān)鍵，常見的ROS響應(yīng)結(jié)構(gòu)主要包括縮硫醛/酮、苯硼酸（酯）、二硒鍵和二茂鐵（Fc）等[13]（見表1）。這些敏感基團(tuán)在疾病組織異常氧化環(huán)境的刺激下，發(fā)生斷裂或性質(zhì)改變，使得遞送系統(tǒng)解交聯(lián)或解組裝，特異性釋放出負(fù)載的核酸藥物，從而精準(zhǔn)遞送核酸藥物。以下將簡(jiǎn)要總結(jié)氧化響應(yīng)型載體用于核酸藥物遞送的研究進(jìn)展。

表1 代表性的ROS響應(yīng)結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)制Table 1 Representative ROS-responsive structures and their mechanisms

3.1 縮硫醛/酮結(jié)構(gòu)響應(yīng)型核酸藥物遞送系統(tǒng)

縮硫醛/酮在ROS作用下會(huì)被氧化裂解并生成相應(yīng)的硫醇和醛/酮[26]，因此也常被用于構(gòu)建ROS響應(yīng)型核酸藥物遞送載體，如利用縮硫醛/酮基團(tuán)作為結(jié)構(gòu)單元來(lái)構(gòu)建ROS響應(yīng)型聚合物，這些聚合物在ROS作用下，其縮硫醛/酮結(jié)構(gòu)斷裂，使載體降解，實(shí)現(xiàn)核酸藥物的按需釋放，提高核酸藥物的轉(zhuǎn)染效率。2019年，Zhang等[30]通過氟苯取代的縮硫醛雙環(huán)氧基化合物和三（2-氨基乙基）胺的開環(huán)聚合反應(yīng)，得到了一系列含氟的ROS響應(yīng)型陽(yáng)離子聚合物TAEA-S-xF（1 ～ 5）。其中，優(yōu)選載體TAEAS-4F（5）能有效提高復(fù)合物的細(xì)胞攝取和內(nèi)涵體逃逸，且其可在ROS作用下發(fā)生結(jié)構(gòu)斷裂，在前列腺癌PC-3細(xì)胞中特異性釋放出增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）質(zhì)粒（pEGFP），且顯著提高了pEGFP的遞送效率，約為聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）的5.4倍。Wang等[31]采用相似的策略開發(fā)了一種基于ROS響應(yīng)型聚合物載體TISUH的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶4（NADH dehydrogenase 4，ND4）質(zhì)粒（phND4）遞送系統(tǒng)TPP-SUH（6），用于Leber遺傳性視神經(jīng)病變（Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON）的線粒體原位基因治療。縮硫醛/酮基團(tuán)也可作為核心基團(tuán)被引入到樹形分子結(jié)構(gòu)中。Liu課題組在聚酰胺-胺類樹形分子（PAMAM）的核心中引入了縮硫酮基團(tuán)用于荷載siRNA。此基團(tuán)可以在肺癌A549細(xì)胞高濃度ROS的作用下發(fā)生斷裂，促進(jìn)siRNA的釋放（12 h釋放率約為80%）。與以乙二胺為核心的傳統(tǒng)PAMAM相比，此策略不僅提高了PAMAM轉(zhuǎn)染效果（其靶基因敲除率提升約1.6倍），同時(shí)降低了遞送體系的毒性[32]。

聚陽(yáng)離子核酸藥物載體存在著一個(gè)共性問題：高相對(duì)分子質(zhì)量陽(yáng)離子載體能夠有效遞送基因藥物，但通常存在毒性問題；低相對(duì)分子質(zhì)量陽(yáng)離子聚合物細(xì)胞毒性較低且生物相容性良好，然而其不能有效壓縮和遞送核酸藥物[33]。交聯(lián)策略是解決這一問題的方法之一，通過交聯(lián)可在提高低相對(duì)分子質(zhì)量聚合物遞送效果的同時(shí)降低載體的細(xì)胞毒性。因此，研究者利用這一策略將含縮硫醛/酮結(jié)構(gòu)的化合物作為交聯(lián)劑，使低相對(duì)分子質(zhì)量的聚合物交聯(lián)成較高相對(duì)分子質(zhì)量的ROS響應(yīng)型聚合物，用作核酸藥物載體。Zhang等[34]利用含縮硫酮的交聯(lián)劑（TKNHS）將低相對(duì)分子質(zhì)量聚乙烯亞胺（OEI，相對(duì)分子質(zhì)量為800）交聯(lián)成聚合物OEI-TKx（7），其可響應(yīng)于人胚腎HEK293T細(xì)胞及宮頸癌HeLa細(xì)胞內(nèi)的ROS，觸發(fā)縮硫酮斷裂，促進(jìn)交聯(lián)聚合物解體，降低細(xì)胞毒性。此外，另有研究者利用相似的策略構(gòu)建了具有靶向功能的ROS響應(yīng)型共聚物：聚乳酸-縮硫酮-聚乙二醇-葉酸（PLGA-TK-PEG-FA，8），其可響應(yīng)于肝癌Huh7細(xì)胞內(nèi)高濃度的ROS，觸發(fā)縮硫酮斷裂，促進(jìn)PLGA-TK-PEG-FA解體，短時(shí)間內(nèi)（4 h）釋放大量荷載的靶向NEDD8結(jié)合酶（UBC12）的siRNA（siUBC12），顯著提高其遞送效果，下調(diào)癌基因UBC12以抑制蛋白類泛素化途徑并促進(jìn)Cullin-RING E3泛素連接酶（CRL）底物的積累，從而在體內(nèi)有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡[35]。

3.2 苯硼酸（酯）結(jié)構(gòu)響應(yīng)型核酸藥物遞送系統(tǒng)

苯硼酸及其酯可在ROS的作用下快速被氧化降解成硼酸或硼酸酯以及烯醌中間體，后者進(jìn)一步水解為對(duì)羥基芐醇[27]（見表1）。與其他幾種氧化敏感基團(tuán)相比，苯硼酸及其酯的ROS響應(yīng)性較好，因 此被廣泛用于構(gòu)建ROS響應(yīng)型基因藥物遞送載體[18]。

苯硼酸及其酯可被引入聚合物側(cè)鏈，用于構(gòu)建ROS響應(yīng)型電荷翻轉(zhuǎn)的基因載體。例如，Qiao等[36]利用季銨化反應(yīng)將苯硼酸與聚[2-（二甲氨基）乙基丙烯酸酯]（PDMAEA）聚合物側(cè)鏈的叔胺共價(jià)連接得到聚合物[（2-丙烯酰基）乙基(對(duì)硼酸芐基)二乙基溴化銨]（BA-PDMAEA，BAP，9），用于遞送siRNA，來(lái)實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的診斷和治療。在生理?xiàng)l件下，正電性的聚合物BA-PDMAEA可通過靜電相互作用與帶負(fù)電的siRNA結(jié)合形成復(fù)合物，當(dāng)復(fù)合物被遞送至腫瘤細(xì)胞后，載體中的苯硼酸被ROS氧化而脫離，從而加速載體中酯鍵水解生成羧酸，使載體表面電荷由正變負(fù)，致使載體與核酸分子間的靜電相互作用轉(zhuǎn)變?yōu)殪o電排斥作用，降低載體與核酸形成復(fù)合物的穩(wěn)定性，促進(jìn)核酸藥物的釋放，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的表達(dá)，顯著改善膠質(zhì)瘤小鼠的免疫抑制微環(huán)境，并延長(zhǎng)小鼠生存期約2倍。此外，由于病變組織的異質(zhì)性，異常ROS水平可能不足以完全觸發(fā)苯硼酸結(jié)構(gòu)響應(yīng)斷裂從而釋放出負(fù)載的核酸藥物，研究者將促進(jìn)ROS生成的藥物（如索拉菲尼[37]）與ROS響應(yīng)型核酸藥物遞送系統(tǒng)聯(lián)用以升高腫瘤微環(huán)境中的ROS濃度，從而促進(jìn)核酸藥物的釋放。

苯硼酸酯的疏水特性使其可作為載體的疏水部分用于構(gòu)建兩親性的ROS響應(yīng)型核酸藥物遞送載體。Zheng等[38]以乙二醇、N-（3-甲基丙烯酰胺基丙基）胍與含苯硼酸酯側(cè)鏈的丙烯酸酯為重復(fù)單元設(shè)計(jì)合成了兩親性三嵌段共聚物PEG-b-P（Gu/Hb，10）。共聚物結(jié)構(gòu)中的胍基可通過靜電相互作用和氫鍵作用與靶向Polo樣激酶1（Polo-like Kinase 1，PLK1）的siRNA（siPLK1）和靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）的siRNA（siVEGFR2）結(jié)合，同時(shí)，苯硼酸酯之間的疏水作用使兩親性共聚物能穩(wěn)定組裝。該遞送系統(tǒng)同樣可在星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG細(xì)胞內(nèi)的高ROS水平下解體，從而提高核酸藥物的釋放效率。

除此以外，含有苯硼酸及其酯的結(jié)構(gòu)可作為交聯(lián)劑，將其與低相對(duì)分子質(zhì)量陽(yáng)離子聚合物交聯(lián)以構(gòu)建交聯(lián)型ROS響應(yīng)的核酸藥物遞送載體。例如，Ruan等[39]利用含苯硼酸酯基團(tuán)的交聯(lián)劑4-（（烯丙氧基）甲基）-2-（4-乙烯基苯基）-1，3，2-二氧雜硼烷（VPBE）將低相對(duì)分子質(zhì)量的支化聚乙烯亞胺（BPEI，相對(duì)分子質(zhì)量為1 200）交聯(lián)成高相對(duì)分子質(zhì)量的ROS響應(yīng)性PEI聚合物SP-Cross-Linked BPEI（11）。此聚合物能成功將siPLK1遞送至人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，載體結(jié)構(gòu)中的苯硼酸酯基團(tuán)在ROS的作用下，發(fā)生氧化斷裂并引起載體解體，釋放出荷載的藥物，對(duì)靶基因的敲除率約為60%。此外，該課題組嘗試用PEG和靶向肽SP修飾載體以增加此遞送體系的長(zhǎng)循環(huán)和靶向功能，從而安全高效地將siPLK1靶向遞送至腫瘤細(xì)胞，產(chǎn)生顯著的抗腫瘤效果。

3.3 其他結(jié)構(gòu)ROS響應(yīng)型核酸藥物遞送系統(tǒng)

除了上述2種經(jīng)典的ROS響應(yīng)型核酸藥物遞送系統(tǒng)，二硒鍵和Fc因其較好的ROS響應(yīng)性能，也被應(yīng)用于構(gòu)建ROS響應(yīng)型核酸藥物遞送系統(tǒng)[13]。其中，二硒鍵較活潑，ROS響應(yīng)靈敏度高[28]，在低濃度ROS作用下即可快速被氧化裂解成硒酸[29]（見表1），因此越來(lái)越多的研究利用二硒鍵構(gòu)建ROS響應(yīng)型載體，用于核酸藥物的輸送[25]。利用含二硒鍵的交聯(lián)劑開發(fā)的一類基于低相對(duì)分子質(zhì)量聚合物的交聯(lián)陽(yáng)離子載體，可以被胞內(nèi)ROS氧化降解為低相對(duì)分子質(zhì)量的片段，從而達(dá)到胞內(nèi)核酸藥物按需釋放的目的。例如，He等[40]設(shè)計(jì)了一種可遞送siPLK1的納米遞送系統(tǒng)UCNO，該遞送系統(tǒng)利用含二硒鍵的交聯(lián)劑將低相對(duì)分子質(zhì)量PEI（相對(duì)分子質(zhì)量為600）交聯(lián)成相對(duì)分子質(zhì)量較高的聚合物PEI-SeSe，并以上轉(zhuǎn)換納米粒子為核、光敏劑孟加拉玫瑰紅（Rose Bengal，RB）共軛的PEI為內(nèi)層、PEI-SeSe為中間層，然后利用穿膜肽R8和透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）組成保護(hù)外殼以防止因二硒鍵的過高靈敏性造成的siPLK1泄露；在波長(zhǎng)為808 nm的近紅外光的照射下，UCNO產(chǎn)生約540 nm的發(fā)射光并激活RB，進(jìn)一步促進(jìn)ROS的生成，從而加速PEI-SeSe的分解以促進(jìn)siPLK1釋放（釋放率約86%），基因沉默效率較未照射組提高約1.8倍，并顯著抑制了肝癌荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)。

具有三明治結(jié)構(gòu)的金屬配合物Fc在高ROS濃度下可被氧化成帶正電的親水性二茂鐵離子（Fc+）（見表1）[18]。利用Fc這一特性，Yue等[41]利用Fc修飾金納米粒得到Au@Fc NP，并利用疏水性聚乳酸（PLA）和親水性PEI與β-環(huán)糊精（β-CD）偶聯(lián)制備了β-CD-PLA-PEI。疏水性Fc可進(jìn)入β-CD的疏水空腔，通過主-客體相互作用連接Au@Fc NP和β-CD-PLA-PEI，組成ROS響應(yīng)型金納米粒Au NV。Au NV可以有效負(fù)載葡萄糖氧化酶（GOx）及可被ROS激活的質(zhì)粒RTP801::p53。腫瘤細(xì)胞內(nèi)高ROS可將疏水性Fc氧化為親水性Fc+，F(xiàn)c+即從β-CD疏水空腔中脫離而破壞了主-客體作用，使得Au NV部分解離并促進(jìn)GOx的高效特異性釋放。釋放出的GOx可進(jìn)一步提高胞內(nèi)的H2O2水平，加速Au NV的解體，從而釋放剩余的GOx及負(fù)載的質(zhì)粒。同時(shí)，胞內(nèi)高ROS水平將激活RTP801::p53的啟動(dòng)子，從而促進(jìn)p53在黑色素瘤B16F10細(xì)胞特異性的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)腫瘤的精準(zhǔn)治療。

4 還原響應(yīng)型載體用于核酸藥物遞送

腫瘤細(xì)胞內(nèi)還原性物質(zhì)如GSH的濃度比胞外高100 ～ 1 000倍。同樣地，借助于腫瘤組織和正常組織之間GSH濃度的差異，研究者將GSH敏感基團(tuán)引入載體結(jié)構(gòu)中，構(gòu)建了各種還原響應(yīng)型聚合物載體，用以實(shí)現(xiàn)核酸藥物的按需遞送。常見的GSH敏感型化學(xué)鍵（基團(tuán)）有二硫鍵、二硒鍵[12]以及對(duì)二硝基苯醚[42]等（見表2）。以下將對(duì)還原響應(yīng)型核酸藥物遞送系統(tǒng)的研究成果進(jìn)行簡(jiǎn)要概述。

表2 GSH響應(yīng)結(jié)構(gòu)及其響應(yīng)機(jī)制Table 2 GSH-responsive structures and their mechanisms

4.1 二硫鍵響應(yīng)型核酸藥物遞送系統(tǒng)

二硫化合物在生理?xiàng)l件、氧化等環(huán)境下很穩(wěn)定，但在一定量的GSH或二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）等還原物質(zhì)存在下會(huì)被還原生成硫醇。且二硫鍵的反應(yīng)活性較高[43]，被廣泛地用于構(gòu)建還原響應(yīng)型核酸藥物遞送載體。常見的含有二硫鍵的化合物主要有吡啶二硫化物、胱胺、胱胺雙丙烯酰胺、3，3'-二硫代二丙酸及2，2'-二硫代二乙醇等，它們可作為連接鍵或交聯(lián)劑被引入遞送系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)核酸藥物的特異性還原響應(yīng)釋放[44]。

二硫鍵或者含二硫鍵的基團(tuán)可作為連接鍵被用于在聚合物（樹形分子[45-47]、PEI[48]、殼聚糖[49-50]等）表面上修飾PEG或疏水功能基團(tuán)等，在胞內(nèi)高GSH的水平下，二硫鍵的斷裂促進(jìn)遞送載體快速釋放核酸藥物。Christine Dufès課題組利用吡啶二硫化物在PEG功能化的G3代聚丙烯亞胺樹形分子DAB表面引入脂質(zhì)（如膽固醇和疏水烷基鏈），構(gòu)建了一系列功能化的DAB（12 ～ 13），用于編碼β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）的質(zhì)粒（pCMV β-gal）在PC-3細(xì)胞的遞送。研究表明，此類分子可以在水溶液中自組裝形成納米囊泡，有效負(fù)載核酸藥物分子；并且膽固醇或者疏水烷基鏈的引入有效增強(qiáng)該遞送體系的細(xì)胞攝取，在胞內(nèi)GSH的刺激下，該體系解散，快速釋放荷載的質(zhì)粒，發(fā)揮治療作用。此外，該課題組還利用喜樹堿（CPT）功能化GSH響應(yīng)的PEG化DAB（14）以共遞送質(zhì)粒與CPT，達(dá)到協(xié)同抗腫瘤的效果[45-47]。采用類似的策略，Chen等[51]在中性聚合物PBLA-PEG的側(cè)鏈引入含二硫鍵的陽(yáng)離子片段胱胺（AED），隨后在部分側(cè)鏈的氨基表面修飾咪唑基團(tuán)得到陽(yáng)離子嵌段共聚物P（Asp-AEDICA）-PEG（15）。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，咪唑基團(tuán)質(zhì)子化促進(jìn)DNA的內(nèi)涵體逃逸后，胱胺響應(yīng)GSH斷裂使載體由正電性轉(zhuǎn)變?yōu)橹行?，從而促進(jìn)DNA的釋放；該遞送載體不僅能高效遞送DNA，還能成功遞送mRNA和Cas9/sgRNA基因編輯體系，是一類極具潛力的可遞送不同類型核酸藥物的載體。

此外，含二硫鍵的結(jié)構(gòu)（如L-胱氨酸二甲酯[52]、胱胺雙丙烯酰胺[53]）也可作為聚合物單體的組成成分之一，用于構(gòu)建GSH響應(yīng)型聚合物核酸藥物載體。此類聚合物在胞內(nèi)高GSH的環(huán)境下可降解為小片段的化合物，從而釋放其負(fù)載的核酸。例如，Xu等[52]以含有二硫鍵的L-胱氨酸二甲酯和脂肪酸為聚合單元合成聚二硫酰胺PDSA（16）。PDSA、陽(yáng)離子脂質(zhì)（G0-C14）以及二硬脂酰磷酸乙醇胺（DSPE）-聚乙二醇（DSPE-PEG）通過納米共沉淀法與siRNA形成一類GSH響應(yīng)的殼核型siRNA遞送系統(tǒng)。該體系具有較高的GSH響應(yīng)siRNA釋放性能，與10 mmol · L-1GSH孵育24 h后即可釋放約80%負(fù)載的siRNA；同時(shí)，其能夠高效荷載靶向驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員11（kinesin family member 11，KIF11）或癌基因MYC的siRNA并將其高效輸送至PC-3細(xì)胞，并能有效抑制腫瘤組織中KIF11或MYC的表達(dá)，從而有效抑制前列腺腫瘤的生長(zhǎng)。此外，含有二硫鍵的小分子前藥[如10-羥基喜樹堿（10-hydroxycamptothecin，HCPT）]也可以作為聚合物結(jié)構(gòu)單元，實(shí)現(xiàn)siRNA藥物與化療藥物協(xié)同治療[54]。二硫鍵同樣可作為交聯(lián)劑交聯(lián)低相對(duì)分子質(zhì)量聚合物（如PEI[55-56]等），構(gòu)建交聯(lián)型GSH響應(yīng)核酸藥物遞送載體。這類載體在GSH的作用下解交聯(lián)，從而有效釋放核酸藥物。例如，Wu等[56]利用“模塊交聯(lián)”策略將PEI-X（X代表膽固醇、七氟丁酸酐和4-羧基苯基硼酸）3種功能結(jié)構(gòu)通過二硫鍵相互交聯(lián)，構(gòu)建還原響應(yīng)型PEI-X-SS-X-PEI共聚物。其中，膽固醇作為脂質(zhì)錨可增強(qiáng)聚合物和細(xì)胞膜的相互作用并提高體系的穩(wěn)定性，七氟丁酸酐修飾促進(jìn)體系的細(xì)胞攝取和內(nèi)體逃逸，而二硫鍵可以在腫瘤胞內(nèi)高GSH催化下斷裂，釋放荷載的siRNA，提高遞送體系的轉(zhuǎn)染效率。優(yōu)選的載體PEI-Ch-SS-FPEI-SS-PBA-PEI（17）在乳腺癌4T1細(xì)胞及MDAMB-231細(xì)胞中基因沉默率高達(dá)60%。

4.2 其他結(jié)構(gòu)GSH響應(yīng)型核酸藥物遞送系統(tǒng)

除二硫鍵之外，對(duì)二硝基苯醚結(jié)構(gòu)也逐漸被用于構(gòu)建GSH響應(yīng)型核酸藥物遞送系統(tǒng)。Shen課題組利用對(duì)二硝基苯醚開發(fā)了一種基于（2，4-二硝基苯氧芐基）-銨陽(yáng)離子的GSH響應(yīng)型電荷翻轉(zhuǎn)聚合物（PADDAC），將其用于DNA的遞送。在胞內(nèi)高GSH作用下，PADDAC中的對(duì)二硝基苯醚與GSH結(jié)構(gòu)中游離巰基反應(yīng)，使得醚鍵斷裂生成苯酚陰離子并迅速轉(zhuǎn)化為羥甲基苯酚，最終水解為帶負(fù)電的聚丙烯酸，實(shí)現(xiàn)電荷翻轉(zhuǎn)，從而在HeLa細(xì)胞內(nèi)快速釋放負(fù)載的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）質(zhì)粒（pTRAIL），在體內(nèi)外均有較好抗腫瘤活性，體內(nèi)抑瘤率高達(dá)82%[57]。含對(duì)二硝基苯醚結(jié)構(gòu)的GSH響應(yīng)型遞送載體用于核酸藥物遞送還處于起步階段，需要進(jìn)一步的研究。

5 調(diào)控病理氧化還原微環(huán)境的聚合物核酸藥物 遞送系統(tǒng)

細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)對(duì)維持細(xì)胞正常生理功能至關(guān)重要，而這主要取決于ROS和GSH之間的動(dòng)態(tài)平衡，使得一定水平的自由基既能夠維持細(xì)胞正常的生理功能，卻又不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷。相較于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞和炎癥細(xì)胞內(nèi)異常的氧化還原穩(wěn)態(tài)十分脆弱，更容易被打破，引發(fā)ROS在細(xì)胞內(nèi)的過量累積，加速疾病的進(jìn)程[58]?；诖耍芯空咄ㄟ^聯(lián)合光動(dòng)力療法、放射療法構(gòu)建了一系列調(diào)控病理氧化還原微環(huán)境的聚合物核酸藥物遞送系統(tǒng)，如促進(jìn)ROS生成或耗竭GSH、清除ROS等，協(xié)同基于核酸藥物的基因治療，以達(dá)到高效治療疾病的目的。

利用陽(yáng)離子聚合物核酸遞送系統(tǒng)包載光敏劑（如Ce6），可聯(lián)合光動(dòng)力療法促進(jìn)ROS生成，調(diào)控病理部位的氧化還原微環(huán)境，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)疾病的精準(zhǔn)定點(diǎn)治療。例如，Zhou等[59]利用Ce6修飾了具有靶向功能的O-羧甲基殼聚糖（O-carboxymethyl chitosan，CMCS），并將其包覆在PEI/DNA復(fù)合物表面，構(gòu)建了一種可促進(jìn)ROS生成的核酸藥物遞送系統(tǒng)PD@CCPNR。該體系中的檸檬酸酐及CMCS在內(nèi)涵體中發(fā)生斷裂，促進(jìn)Ce6的釋放，使其在660 nm的光照下產(chǎn)生適量的ROS，加速?gòu)?fù)合物的內(nèi)涵體逃逸，又可避免DNA損傷，有效協(xié)同光熱療法和基因治療。此外，利用聚合物核酸遞送系統(tǒng)包載氧化劑[如六價(jià)鎢離子（W6+）]，可聯(lián)合放射療法既促進(jìn)ROS生成又耗竭胞內(nèi)的GSH，協(xié)同放大疾病組織的氧化應(yīng)激，進(jìn)而提高療效。例如，Yong等[60]設(shè)計(jì)了一種含有釓（Gd）和W的多金屬氧酸鹽偶聯(lián)殼聚糖GdW10@CS系統(tǒng)，用于遞送以缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）為靶點(diǎn)的siRNA（siHIF-1α）。其中，GdW10@CS中的Gd和W作為外源輻射增敏劑，經(jīng)X射線照射，可在肝癌BEL-7402細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS；同時(shí)，W6+又作為內(nèi)源性氧化劑，與GSH發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而耗竭胞內(nèi)的GSH，進(jìn)一步放大細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，促進(jìn)BEL-7402細(xì)胞凋亡；該體系可成功將siHIF-1α靶向遞送至肝癌細(xì)胞，下調(diào)HIF-1α的表達(dá)，減輕腫瘤乏氧，并協(xié)同內(nèi)外源性放射增敏，提高腫瘤治療效果。

利用核酸遞送系統(tǒng)包載ROS清除劑[如表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）]，可清除疾病部位過量ROS，改善疾病的進(jìn)程。例如，腫瘤中高水平的ROS可影響同源性磷酸酶-張力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的表達(dá)，進(jìn)而加速腫瘤細(xì)胞增殖。針對(duì)這一問題，Wang等[61]設(shè)計(jì)了一種可共載質(zhì)粒pPTEN和EGCG的納米粒，該納米粒由DSPE修飾的PEI（DSPE-PEI）、膽固醇和二棕櫚酰磷脂酰膽堿（dipalmitoyl phosphatidylcholine，DPPC）組成。該體系中的EGCG可有效清除PC-3細(xì)胞中過量的ROS，從而促進(jìn)PTEN的表達(dá)，恢復(fù)相關(guān)蛋白質(zhì)功能，從而通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號(hào)通路，發(fā)揮強(qiáng)效的抗腫瘤作用。

6 結(jié)語(yǔ)與展望

近幾年，隨著研究者對(duì)疾病部位氧化還原微環(huán)境的了解以及對(duì)納米材料的探索，氧化還原響應(yīng)型核酸藥物遞送系統(tǒng)取得了許多鼓舞人心的研究成果。研究者針對(duì)疾病組織氧化還原環(huán)境的差異，利用各種氧化還原響應(yīng)型基團(tuán)，設(shè)計(jì)了一系列氧化還原響應(yīng)型納米遞送系統(tǒng)。這些遞送系統(tǒng)中的ROS敏感基團(tuán)[縮硫醛/酮、苯硼酸（酯）、二硒鍵和二茂鐵等]或GSH敏感基團(tuán)[二硫鍵、對(duì)硝基苯醚等]在異常的氧化還原環(huán)境下被氧化或被還原，使得遞送系統(tǒng)即可通過結(jié)構(gòu)斷裂或親疏水性質(zhì)轉(zhuǎn)變實(shí)現(xiàn)解離或解組裝，或利用電荷翻轉(zhuǎn)策略減弱載體與核酸分子的靜電相互作用以促進(jìn)荷載核酸藥物的釋放，成功實(shí)現(xiàn)核酸藥物在疾病部位的按需遞送，從而有效提高核酸藥物的遞送效率，同時(shí)增強(qiáng)遞送系統(tǒng)的安全性。

然而，這類遞送系統(tǒng)在設(shè)計(jì)開發(fā)過程中仍存在以下挑戰(zhàn)，值得進(jìn)一步探索。1）各類氧化響應(yīng)型載體在核酸藥物遞送中的研究較為深入，而還原響應(yīng)型載體的研究主要為基于二硫鍵所構(gòu)建的載體，其他還原敏感基團(tuán)所構(gòu)建的還原型載體在核酸遞送中的應(yīng)用還有待進(jìn)一步開發(fā)。2）載體的結(jié)構(gòu)、氧化還原響應(yīng)性、核酸藥物遞送效率三者之間的關(guān)系需要進(jìn)一步闡明。不同敏感基團(tuán)的響應(yīng)機(jī)制各異，并且其在載體中的位置對(duì)遞送體系的敏感性的影響也尚不清晰，仍需建立合適的評(píng)價(jià)機(jī)制來(lái)探究。3）疾病組織的復(fù)雜性和異質(zhì)性對(duì)遞送系統(tǒng)在體內(nèi)的響應(yīng)性能的影響還需要深入研究。此外，這些載體在病理微環(huán)境中的特異性釋藥過程可能會(huì)調(diào)控細(xì)胞的氧化還原水平，具體機(jī)制仍有待研究。4）氧化還原響應(yīng)型載體的響應(yīng)后降解產(chǎn)物在體內(nèi)的代謝機(jī)制尚不清晰，仍需要深入研究。

總之，氧化還原響應(yīng)型遞送系統(tǒng)在核酸藥物按需輸送方面極具潛力，尤其是氧化響應(yīng)型核酸遞送系統(tǒng)被廣泛用于炎癥性疾病和腫瘤治療的基礎(chǔ)研究，但其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用仍任重道遠(yuǎn)，迫切需要從載體開發(fā)、遞送系統(tǒng)體內(nèi)毒理學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)研究，以及工業(yè)化轉(zhuǎn)化等多方面聯(lián)合攻關(guān)。希望本綜述可以為氧化還原響應(yīng)型遞送載體的合理化設(shè)計(jì)提供一定的參考和幫助。