郭家晶，平淵

（浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310058）

1 引言

在過去的幾年中，由于成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）-CRISPR相關(guān)蛋白9（Cas9，也稱Cas9核酸酶）技術(shù)的普及，全球基因編輯研究呈現(xiàn)井噴式的發(fā)展[1]。2020年CRISPRCas9技術(shù)被授予諾貝爾化學(xué)獎，凸顯了該技術(shù)在基因治療方面的非凡潛力[2]。這一新興的基因工程技術(shù)從基礎(chǔ)生物學(xué)到生物醫(yī)學(xué)工程、食品科學(xué)和醫(yī)療保健等諸多領(lǐng)域都展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用前景[3-5]。由于CRISPR-Cas9技術(shù)在國內(nèi)外獲得了廣泛的認(rèn)可和關(guān)注，基于CRISPR-Cas9技術(shù)的基因組編輯相關(guān)產(chǎn)品在全球市場中也獲得了爆炸性的增長[6]。

CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)依賴于Cas9定向切割,引發(fā)DNA雙鏈斷裂（double-strand break，DSB），需要預(yù)先設(shè)計的單鏈引導(dǎo)RNA（single guide RNA，sgRNA）分別與Cas9和需要切割的DNA結(jié)合形成三元復(fù)合物，引導(dǎo)Cas9到特定的基因位點產(chǎn)生切割[7-8]。DNA發(fā)生雙鏈斷裂后，細(xì)胞內(nèi)存在的2種內(nèi)源性DNA修復(fù)途徑，會對斷裂位點進(jìn)行非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復(fù)（HDR，需要模板DNA），從而實現(xiàn)特定基因的敲除或者敲入[9-10]。與前兩代基因編輯工具鋅指蛋白核酸酶（ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）相比，基于CRISPR-Cas9的基因編輯工具有明顯的優(yōu)勢[11-12]（見圖1）：首先，在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中，Cas9是固定的，只需要針對特定的目標(biāo)基因設(shè)計sgRNA即可，sgRNA長度只有約100個堿基對，很容易定制設(shè)計，而使用ZFN或TALEN工具需要設(shè)計和合成一個龐大的引導(dǎo)蛋白[13-14]（鋅指蛋白DNA結(jié)合域或轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子），更為復(fù)雜；其次，與前面2種方法相比，CRISPR-Cas9技術(shù)在基因組編輯方面具有更高的精度和效率[15]；最后，CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以同時編輯多個基因位點，這是前面兩代基因編輯技術(shù)無法實現(xiàn)的[16]。

圖1 基因組編輯和雙鏈斷裂修復(fù)示意圖[11]Figure 1 Schematic diagram of genome editing and double-strand break repair

遞送CRISPR-Cas9基因編輯工具可以通過3種形式實現(xiàn)，包括同時編碼Cas9蛋白和sgRNA的質(zhì)粒（Cas9/sgRNA-質(zhì)粒）、編碼Cas9蛋白和sgRNA的mRNA（Cas9/sgRNA-mRNA）或核糖核蛋白[17-19]（RNP，Cas9蛋白和sgRNA的復(fù)合物）。3種CRISPR-Cas9工具遞送形式具有各自的特點[20]，質(zhì)粒的穩(wěn)定性較好，可以實現(xiàn)較長時間的編輯，但也伴隨著起效慢、編輯效率低、脫靶率高并且有基因組整合風(fēng)險等缺陷；mRNA避免了DNA插入的風(fēng)險，但由于其不穩(wěn)定、容易被降解，也可能降低整體的編輯效率；RNP具有穩(wěn)定性較高、作用快速、脫靶率低、免疫原性低，同時沒有基因插入突變的風(fēng)險等優(yōu)勢，但也存在成本較高、基因編輯作用時間較短的問題[21-23]。

DNA、mRNA和RNP均帶有較高的電荷和較大的體積，導(dǎo)致它們很難穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中[24]。因此，發(fā)展新的胞內(nèi)遞送CRISPR-Cas9工具的策略一直是拓展基因編輯應(yīng)用領(lǐng)域的核心問題[25]。目前，病毒和非病毒載體都被用于CRISPR-Cas9工具的遞送[26-27]。病毒載體，如腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）和慢病毒（lentivirus，LV）等，是用于高效胞內(nèi)遞送基因編輯工具的常用載體，但由于裝載能力的限制、免疫原性以及誘導(dǎo)突變的風(fēng)險，使得它們的應(yīng)用受到限制[28-29]。此外，病毒遞送會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)長時間的編輯作用，這可能引起較嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)[30]（見表1）。

表1 用于遞送CRISPR-Cas9工具的病毒載體Table 1 The viral vectors for delivery of CRISPR-Cas9 tools

非病毒載體與CRISPR-Cas9系統(tǒng)形成的納米粒子（NP）用于基因編輯工具的遞送有望解決上述問題。多種非病毒載體如脂質(zhì)、聚合物、硅基材料，以及金納米粒子等已被報道用于CRISPR-Cas9的胞內(nèi)遞送[22]。然而，非病毒載體用于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的遞送仍然存在2個關(guān)鍵的問題。首先，與病毒載體相比，非病毒載體的遞送效率仍然較低，主要原因在于非病毒載體用于CRISPR-Cas9的遞送需要克服多種屏障[31-32]（包括細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)屏障）。具體來說，細(xì)胞外的障礙包括納米粒子與血清蛋白的非必要相互作用、免疫細(xì)胞的吞噬作用、血管表皮細(xì)胞的質(zhì)密連接導(dǎo)致納米粒子難以滲透以及靶向等；細(xì)胞內(nèi)屏障包括納米粒子容易在內(nèi)涵體/溶酶體中降解，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后難以將CRISPR-Cas9工具釋放，釋放后的工具還需要進(jìn)入細(xì)胞核才能發(fā)揮作用。其次，靶向遞送CRISPR-Cas9系統(tǒng)、實現(xiàn)精準(zhǔn)基因組編輯仍然是一個大問題[33]。

因此，為了應(yīng)對上述提到的挑戰(zhàn)，實現(xiàn)高效且精確的基因組編輯，研究人員開發(fā)了多種刺激響應(yīng)型載體系統(tǒng)用于CRISPR-Cas9工具的胞內(nèi)遞送，這些新一代載體也代表著CRISPR-Cas9遞送領(lǐng)域的未來發(fā)展方向[32]。刺激響應(yīng)型納米遞送系統(tǒng)能從時間和空間上對特殊的反應(yīng)發(fā)生感知和應(yīng)對，從而觸發(fā)釋放出CRISPR-Cas9工具并產(chǎn)生相應(yīng)的作用。這些觸發(fā)開關(guān)有多種，比如內(nèi)源性的生物因素（pH值、酶、氧化還原因子水平等），或者外源性的因素（聲、光、電、小分子、磁場等）[34]。在本文中，筆者對刺激響應(yīng)性材料用于CRISPR-Cas9工具的胞內(nèi)遞送的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。這些特殊材料與CRISPR-Cas9工具形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物后，能在時間和空間上實現(xiàn)CRISPR-Cas9工具的控制釋放。此外，重點介紹了這些載體的設(shè)計原理和可能的生物應(yīng)用方向。

2 內(nèi)源性刺激響應(yīng)載體

隨著生物科學(xué)、材料科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)工程等學(xué)科的快速發(fā)展，內(nèi)源性刺激響應(yīng)型智能藥物遞送系統(tǒng)被研發(fā)問世，深刻地影響了醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，極大地提高了現(xiàn)有藥物的臨床表現(xiàn)和治療潛力[35]。這些研究成果也能應(yīng)用于CRISPR-Cas9工具的體內(nèi)外遞送。智能響應(yīng)型藥物遞送的概念起源于20世紀(jì)70年代，當(dāng)時有人利用熱響應(yīng)的脂質(zhì)體實現(xiàn)了藥物的控制釋放[36]。從那時起，大量的工作開始聚焦于智能遞送材料的設(shè)計與研究，這些材料可以通過感知特殊生物化學(xué)因素的變化從而實現(xiàn)藥物時空釋放，應(yīng)用于臨床患者[37]。內(nèi)源性因素包括pH值、酶、氧化還原水平的變化等，同時多種疾?。ㄈ鐞盒阅[瘤、自身免疫疾病、神經(jīng)退行性疾病、心腦血管疾病和感染等）的病理過程也伴隨著相應(yīng)生理因素的變化[34]。智能藥物遞送材料與CRISPR-Cas9工具（質(zhì)粒、mRNA和RNP）形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物后，通過感知這些內(nèi)源性生理因素的變化，實現(xiàn)CRISPRCas9工具的控制釋放，發(fā)揮基因組編輯作用[22]。

2.1 pH響應(yīng)的CRISPR-Cas9遞送系統(tǒng)

生物體內(nèi)某些特殊的器官具有不同的pH值，比如胃中pH值1.5 ～ 3.5、小腸中pH值5.5 ～ 6.8、結(jié)腸中pH值6.4 ～ 7.0；細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器，如內(nèi)涵體/溶酶體中pH值4.0 ～ 6.5；此外，一些疾病微環(huán)境（如腫瘤或者炎癥部位）中，與正常組織相比，pH值也會發(fā)生變化。這一特點已被廣泛用于設(shè)計智能刺激響應(yīng)型藥物遞送系統(tǒng)[38]。CRISPR-Cas9遞送的一個關(guān)鍵障礙就是細(xì)胞內(nèi)涵體/溶酶體系統(tǒng)，里面較低pH值和大量酶會迅速使CRISPR-Cas9工具降解失活[39]。因此，考慮到內(nèi)涵體/溶酶體系統(tǒng)中較強(qiáng)的酸性環(huán)境，一些研究者在將pH響應(yīng)納米復(fù)合物用于CRISPR-Cas9工具的遞送時，通過載體材料的質(zhì)子化來打破溶酶體膜，實現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸，從而發(fā)揮作用。2019年，Liu等[40]開發(fā)了一種苯硼酸（phenylboronic acid，PBA）修飾的樹形高分子材料P4。一方面，PBA上的芳香環(huán)可以通過陽離子-π相互作用與蛋白質(zhì)表面的陽離子和陰離子基團(tuán)相結(jié)合；另一方面，蛋白質(zhì)上的陰離子羧酸酯基團(tuán)可以通過離子相互作用與帶正電荷的P4有效結(jié)合。因此，P4能與多種蛋白質(zhì)（包括RNP）結(jié)合形成穩(wěn)定的納米粒子（見圖2）。同時，由于P4上面還有大量的氨基基團(tuán)，可以結(jié)合質(zhì)子，具有很強(qiáng)的pH緩沖作用。納米粒子被細(xì)胞攝取后，能快速地質(zhì)子化，打破溶酶體膜，實現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞實驗結(jié)果表明，P4遞送RNP可以高效敲除AAVS1和HBB基因，效率最高分別能達(dá)到29.6%和22.5%。

圖2 P4與蛋白質(zhì)相互作用形成納米粒子的示意圖[40]Figure 2 Schematic diagram of P4 interacting with proteins to form nanoparticles

Chen等[41]設(shè)計合成了不同長徑比（長度與直徑的比值）的金納米棒（gold nanorod），通過在金納米棒表面包裹一層支鏈的聚乙烯亞胺（PEI）形成新的陽離子金納米棒（AuNR-PEI，ARP，見圖3），其能絡(luò)合Cas9質(zhì)粒形成穩(wěn)定的納米粒子，同時具有優(yōu)良的細(xì)胞內(nèi)化能力和內(nèi)涵體逃逸能力。該課題組合成了一系列不同長徑比（1 ～ 9）的ARP，篩選后發(fā)現(xiàn)其長徑比為8時（對應(yīng)的ARP即ARP-8）具有最好的基因遞送效率。細(xì)胞實驗表明，以ARP-8負(fù)載Cas9質(zhì)粒，對AAVS1和PLK1這2種不同基因都有較好的敲除效率。隨后，課題組用半乳糖（Gal）修飾ARP-8得到了具有肝臟靶向能力的Gal-ARP，通過遞送CRISPR/Cas9的質(zhì)粒靶向敲除肝細(xì)胞的腫瘤壞死因子基因Fas，成功保護(hù)了急性肝損傷小鼠，體內(nèi)對小鼠肝細(xì)胞的Fas基因敲除效率能達(dá)到7.6%。Lee等[42]制備了一種基于金納米粒子的載體，用來遞送Cas9 RNP和模板DNA（該遞送系統(tǒng)命名為CRISPR-Gold）。通過硫醇可以將模板DNA附著在金納米粒子上面，同時用pH響應(yīng)性的聚合物——聚（N-（N-（2-氨基乙基））-2-氨基乙基）天冬酰胺[PAsp(DET)]，通過雜交或靜電相互作用將Cas9 RNP和金納米粒子包裹起來，此外，聚合物中的二乙烯三胺（DET）功能基團(tuán)也使得納米粒子具有較好的內(nèi)涵體逃逸性能。納米粒子被細(xì)胞攝取后，PAsp(DET)聚合物通過質(zhì)子海綿效應(yīng)破壞內(nèi)涵體，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。在杜氏肌營養(yǎng)不良（DMD）模型小鼠（mdx小鼠）中進(jìn)行的體內(nèi)實驗結(jié)果表明，CRISPR-Gold能誘導(dǎo)肌萎縮蛋白（dystrophin）基因的同源定向修復(fù)（HDR），治療組mdx小鼠的肌萎縮蛋白基因定向修復(fù)率達(dá)5.4%。

圖3 陽離子金納米棒用于Cas9質(zhì)粒遞送的示意圖[41]Figure 3 Schematic diagram of cationic gold nanorods for Cas9 plasmid delivery

2.2 氧化還原反應(yīng)響應(yīng)的CRISPR-Cas9遞送系統(tǒng)

眾所周知，細(xì)胞內(nèi)外的氧化還原環(huán)境是不一樣的。例如，還原劑谷胱甘肽（GSH）在細(xì)胞內(nèi)的水平比在細(xì)胞外高2 ～ 3個數(shù)量級[38]，因此，將GSH可斷裂的二硫或二硒鍵整合到遞送載體中可以實現(xiàn)特定位點的CRISPR-Cas9胞內(nèi)遞送[43]。另外，能對細(xì)胞內(nèi)活性氧[ROS，如過氧化氫（H2O2）和羥基自由基]響應(yīng)的載體也可用于CRISPR-Cas9的遞送。體內(nèi)多種病理條件下都能產(chǎn)生活性氧，包括癌癥、卒中、動脈粥樣硬化和組織損傷等[44]。

Chen等[45]研制了一種可被GSH降解的聚合物納米膠囊，用于遞送RNP。RNP納米膠囊是由陽離子單體和陰離子單體混合在RNP表面并通過原位聚合交聯(lián)而成，中間由一種含二硫鍵的N，N'-雙（丙烯酰）胱胺作為交聯(lián)劑，使得膠囊被細(xì)胞攝取后可以被GSH降解，導(dǎo)致交聯(lián)聚合物分解，從而釋放RNP用于基因組編輯。該膠囊RNP制劑具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性。在多種體外（293T細(xì)胞和干細(xì)胞）實驗和體內(nèi)[Ai14小鼠的視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）組織和骨骼肌]實驗中，都具有良好的基因組編輯效果。2021年，Guo等[46]設(shè)計了一種含雙硫主鏈的陽離子聚合物材料DET-CPD，該材料由含DET功能基團(tuán)的單體M1和精氨酸甲酯的單體M2通過巰基引發(fā)的開環(huán)聚合反應(yīng)聚合而成，獲得了一系列的聚雙硫陽離子載體（見圖4）。課題組通過篩選獲得了效果最好的材料DET-CPD-12，其能通過分子間的氫鍵、靜電相互作用等弱的相互作用力與3種CRISPR-Cas9基因編輯工具（Cas9/sgRNA-質(zhì) 粒、Cas9/sgRNA-mRNA和RNP）形 成穩(wěn)定的納米粒子。不僅如此，DET-CPD-12能與細(xì)胞外膜上的巰基發(fā)生一種獨特的“硫硫交換”反應(yīng)（disulfide-exchange reaction），能繞開細(xì)胞內(nèi)吞途徑直接進(jìn)入胞內(nèi)，同時在胞內(nèi)高濃度的GSH作用下DET-CPD-12雙硫主鏈被迅速降解，將包載的基因編輯工具釋放出來發(fā)揮作用，因此，DET-CPD-12能高效地將基因編輯工具遞送到細(xì)胞內(nèi)，同時大大降低了材料的毒性。細(xì)胞實驗表明，在293T細(xì)胞內(nèi)，DET-CPD-12分別將3種基因編輯工具遞送到胞內(nèi)后，對CCNE1基因均具有較好的敲除效率，最高能達(dá)到39.2%。體內(nèi)實驗表明，DET-CPD-12與CRISPR-Cas9基因編輯工具形成的納米復(fù)合物能被動靶向遞送到小鼠肝臟部位、被肝細(xì)胞吸收，通過敲除CCNE1基因有效發(fā)揮對急性肝損傷小鼠的肝臟保護(hù)作用，顯著延長了小鼠的生存期。

圖4 DET-CPD-12用于3種基因編輯工具胞內(nèi)遞送的示意圖[46]Figure 4 Schematic diagram of DET-CPD-12 for intracellular delivery of three kinds of gene-editing tools

2021年，Yan等[47]報道了一種用于靶向炎癥部位的CRISPR-Cas9基因編輯前藥遞送系統(tǒng)（NanoProCas9，見圖5）。課題組先構(gòu)建了一種編碼不穩(wěn)定Cas9（destabilized Cas9，dsCas9）蛋白的質(zhì)粒，dsCas9上面帶有一個二氫葉酸還原酶（DHFR）的結(jié)構(gòu)域。然后用陽離子聚（β-氨基酯）聚合物（PBAE）絡(luò)合dsCas9質(zhì)粒形成穩(wěn)定納米復(fù)合物。接著，用巨噬細(xì)胞膜包被于PBAE/質(zhì)粒復(fù)合物表面，使得納米粒子具有靶向炎癥部位的能力。最后，課題組將dsCas9的小分子穩(wěn)定劑甲氧芐啶（TMP）通過硫代酮連接劑（TK）與油基醚改性聚乙二醇（OE-PEG，BAM）結(jié)合，得到ROS響應(yīng)的BAM-TK-TMP，BAM-TK-TMP上面疏水的尾部可以通過脂融合插入到巨噬細(xì)胞膜上面。在正常生理環(huán)境下，上述質(zhì)粒所表達(dá)的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的dsCas9被泛素依賴的蛋白酶所降解；而在炎癥部位等ROS豐富的內(nèi)環(huán)境中，BAM-TK-TMP被激活并釋放能夠穩(wěn)定dsCas9的TMP小分子。在右旋糖酐硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中，ROS依賴的NanoProCas9系統(tǒng)實現(xiàn)了高效的體內(nèi)遞送和CRISPR-Cas9的靶向激活，通過響應(yīng)高水平的ROS，起到基因組編輯作用，從而發(fā)揮對急性結(jié)腸炎小鼠的治療效果。

圖5 NanoProCas9靶向遞送至炎癥部位的示意圖[47]Figure 5 Schematic diagram of targeted delivery of NanoProCas9 to the site of inflammation

2.3 組織特異性響應(yīng)的CRISPR-Cas9遞送系統(tǒng)

一般來說，靶向給藥是基于細(xì)胞特異性受體和配體識別，觸發(fā)靶細(xì)胞內(nèi)吞作用。組織特異性CRISPR-Cas9遞送對于基因編輯工具的遞送非常重要，目的是對靶點組織或細(xì)胞產(chǎn)生編輯作用，減少身體其他部位不需要的基因編輯，減少脫靶。通過設(shè)計具有組織特異性啟動子的Cas9-質(zhì)粒或Cas9-mRNA，只有當(dāng)基因編輯工具被遞送到對應(yīng)的組織才可以啟動Cas9的表達(dá)從而發(fā)揮作用；也可以針對特定的靶組織或細(xì)胞設(shè)計對應(yīng)的配體，用于CRISPRCas9的靶向遞送，以減少非靶細(xì)胞的攝取[48]。Cheng等[49]開發(fā)了一種選擇性器官靶向性（SORT）脂質(zhì)納米顆粒（LNP）遞送系統(tǒng)，用于Cas9-mRNA和RNP的靶向遞送。通過改變和調(diào)控組成納米粒子的小分子組分的物質(zhì)的量比例和內(nèi)部電荷分布，然后加入第5組分SORT分子，就能改變納米粒子在體內(nèi)不同組織和器官中的分布。利用此項技術(shù)，研究團(tuán)隊已經(jīng)分別實現(xiàn)了CRISPR-Cas9工具對小鼠肺、肝、腎等器官的靶向遞送。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，該課題組研制的肝臟靶向SORT-LNP可共遞送Cas9 mRNA和sgPCSK9，使高膽固醇血癥模型小鼠血清中PCSK9蛋白含量降低了90%。

2022年，Xu等[50]報道了可靶向肝臟炎癥病灶部位的雙重納米編輯系統(tǒng)。首先，課題組構(gòu)建了含有肝臟特異性啟動子（P3）Cas編輯器（Cas9或者CasRx）的質(zhì)粒，其中P3啟動子是一種合成的肝臟特異性啟動子，僅在肝實質(zhì)細(xì)胞中具有活性，可啟動下游質(zhì)粒編輯元件的表達(dá)。他們用可以被動靶向到肝臟的聚雙硫陽離子高分子材料（PD）包裹上述質(zhì)粒，通過弱的相互作用壓縮質(zhì)粒，形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物（PD/P）。最后，在PD/P納米粒子的表面包覆一層仿生巨噬細(xì)胞膜，組成了仿生納米粒子，從而將質(zhì)粒遞送到肝臟炎癥病灶部位（見圖6）。小鼠通過全身給藥后，巨噬細(xì)胞膜可以將多聚納米粒子靶向遞送到肝臟炎癥病灶，在那里，含有肝特異啟動子的質(zhì)粒啟動基因編輯器（Cas9或CasRx）的表達(dá)，實現(xiàn)肝臟特異性的基因編輯，干擾靶點基因的表達(dá)或下調(diào)與肝臟疾病進(jìn)展相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。盡管有小部分Cas編輯器會分布到非靶點組織或者器官中，但由于P3啟動子控制的基因編輯器只在肝臟表達(dá)，導(dǎo)致基因編輯器在非靶部位的表達(dá)會受到極大的限制，從而最大程度地減少脫靶效應(yīng)，提高了安全性和編輯的準(zhǔn)確性。課題組研制的這種雙重特異性CRISPR-Cas9納米編輯系統(tǒng)能有效地聚集于肝臟部位，通過P3啟動子的控制表達(dá)，使基因編輯工具只在肝臟部位表達(dá)。在3種小鼠疾病模型（肝臟缺血再灌注、急性肝損傷、肝纖維化）中進(jìn)行的體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，相比于未給藥的小鼠，使用本策略有效敲除了肝臟缺血再灌注模型小鼠肝臟的12-脂氧合酶（Alox12）基因（敲除率27.7%）與急性肝損傷模型小鼠的Fas基因（敲除率22.3%），以及使肝纖維化模型小鼠Alox12基因mRNA的表達(dá)下調(diào)約50%。

圖6 雙特異性CRISPR/Cas納米系統(tǒng)在肝病治療中的應(yīng)用[50]Figure 6 Application of dual-specific CRISPR/Cas nanosystem in the treatment of liver diseases

2.4 酶響應(yīng)的CRISPR-Cas9遞送系統(tǒng)

在病理條件下，體內(nèi)某些蛋白酶的表達(dá)會發(fā)生改變?；诖耍恍┭芯空咴O(shè)計了特定酶響應(yīng)的載體，用于藥物靶向遞送。目前，大多數(shù)酶響應(yīng)的給藥系統(tǒng)基本都是利用存在于細(xì)胞外的酶，例如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）和透明質(zhì)酸酶（HAase）這2種在腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)的酶[51]。MMP在腫瘤微環(huán)境、腫瘤信號通路以及腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等一系列過程中都發(fā)揮著重要作用。腫瘤微環(huán)境中高水平的透明質(zhì)酸（HA）會降低腫瘤組織的彈性，增加間質(zhì)液體壓力，同時與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)[52]。

Yang等[53]設(shè)計了一種可編程的層層響應(yīng)的納米CRISPR遞送系統(tǒng)PUN@Cas-PT，用于靶向調(diào)控細(xì)胞程序性死亡配體1（PD-L1）和蛋白酪氨酸磷酸酶N2（PTPN2）。PUN@Cas-PT同時包含可對MMP和HAase響應(yīng)的底物，納米粒子含有的HA還能延長納米復(fù)合物的血液循環(huán)時間，增加納米粒子在腫瘤部位的滯留和吸收，同時促進(jìn)了納米粒子的內(nèi)涵體逃逸和胞內(nèi)釋放。PUN@Cas-PT通過層層響應(yīng)的方式遞送CRISPR-Cas9工具。首先，在腫瘤微環(huán)境中，過表達(dá)的MMP會降解PEG外層連接的MMP的底物，暴露出RGD腫瘤靶向肽和HA，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對納米粒子的識別和攝取。然后，溶酶體中的HAase降解HA，使得納米粒子電荷發(fā)生反轉(zhuǎn)，實現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸。最后，由對ROS敏感的聚乙烯亞胺衍生物和Cas9質(zhì)粒組成的核心進(jìn)入細(xì)胞后，在腫瘤細(xì)胞中高水平ROS作用下，納米粒子裂解釋放Cas9質(zhì)粒，通過下調(diào)PD-L1和PTPN2改善腫瘤組織的免疫抑制微環(huán)境，從而增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

3 外源性刺激響應(yīng)載體

近年來，研究人員嘗試通過外部刺激進(jìn)行CRISPR-Cas9工具的遞送，使基因編輯在時間和空間上的精確控制成為了可能。通常能實現(xiàn)外部刺激響應(yīng)的方法包括光控制、超聲波控制和磁場控制等。

3.1 光響應(yīng)的CRISPR-Cas9遞送系統(tǒng)

光是一種無創(chuàng)的、時間和空間的控制開關(guān)，可用于基因編輯系統(tǒng)的精確控制遞送。在光照射下，某些材料可以產(chǎn)生一些物理或化學(xué)的變化，包括光誘導(dǎo)光熱劑的光熱效應(yīng)、光敏物質(zhì)的ROS產(chǎn)生以及上轉(zhuǎn)化材料的光子轉(zhuǎn)換等。這些獨特的光響應(yīng)材料也被應(yīng)用于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的控制遞送[54]。

近紅外光（NIR，波長范圍為800 ～ 2500 nm）由于其安全性良好同時具有較好的組織穿透性（可達(dá)3 cm），是一種理想光源。相比之下，紫外光或可見光穿透深度只有不到1 mm。通過光敏材料產(chǎn)生的光熱轉(zhuǎn)換在生物醫(yī)學(xué)工程應(yīng)用中比較常見，比如光熱治療。光熱劑（包括有機(jī)的吲哚菁綠和聚多巴胺，無機(jī)的金納米粒子和石墨烯等）可以將光能轉(zhuǎn)化為熱能，導(dǎo)致局部溫度升高。值得一提的是，已有研究表明，光熱效應(yīng)還可以促進(jìn)納米粒子的內(nèi)涵體/溶酶體逃逸，并且可以通過打斷熱敏化學(xué)鍵實現(xiàn)內(nèi)容物的釋放和激活[55]。2020年，Chen等[56]報道了可被近紅外二區(qū)的光（NIR-II，1 000 ～ 1 700 nm）激活的CRISPR-Cas9納米系統(tǒng)（nanoCRISPR）的遞送研究（見圖7），用于可編程的基因組編輯。作者首先合成了β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin）-聚乙烯亞胺（PEI）包裹的金納米棒（APC）材料，然后用這種材料包裹含有特異性熱啟動子HSP70的Cas9質(zhì)粒（HSP-Cas9-質(zhì)粒），形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物nanoCRISPR。陽離子聚合物能夠吸附和攜帶質(zhì)粒到目標(biāo)細(xì)胞，APC作為光熱轉(zhuǎn)化器能將外部的光能轉(zhuǎn)為細(xì)胞內(nèi)的局部熱能，啟動質(zhì)粒的表達(dá)，因此，APC不僅可以作為質(zhì)粒遞送的載體，還可以作為細(xì)胞內(nèi)的光熱轉(zhuǎn)換器來啟動Cas9和sgRNA的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，光信號就可以通過APC轉(zhuǎn)換為熱源來調(diào)節(jié)Cas9表達(dá)和活性。在1 064 nm的光照射下，APC在細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境中迅速產(chǎn)生局域熱，誘導(dǎo)熱休克因子（HSF）從非活性單體轉(zhuǎn)化為活性三聚體，并能使活性三聚體進(jìn)入細(xì)胞核。然后，核內(nèi)三聚體與HSP70啟動子的熱休克元件（HSE）結(jié)合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活。但是，一旦關(guān)閉光照，溫度迅速降低，三聚體將從HSE上解離下來并重新轉(zhuǎn)化為單體，從而抑制轉(zhuǎn)錄過程。因此，將APC作為光遺傳開關(guān)調(diào)節(jié)Cas9的表達(dá)，可實現(xiàn)時間和空間上的調(diào)控。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，該遞送策略對PLK1基因的敲除效率最高可達(dá)28.3%。不僅如此，相比于近紅外一區(qū)，采用二區(qū)的光也具有更深的組織穿透性。體內(nèi)和體外數(shù)據(jù)表明，APC介導(dǎo)的光控制Cas9基因的表達(dá)能以精確和可編程的方式指導(dǎo)Cas9的基因編輯作用，并顯著減少脫靶效應(yīng)。

圖7 光響應(yīng)的nanoCRISPR納米系統(tǒng)在Cas9質(zhì)粒遞送中的應(yīng)用[56]Figure 7 Application of light-responsive nanoCRISPR nanosystem in Cas9 plasmid delivery

光照除了能誘導(dǎo)光熱效應(yīng)外，在光敏劑（如二氫卟啉）存在下，還能引發(fā)ROS[如單線態(tài)氧（1O2）]的產(chǎn)生，用于某些疾病的治療，這種光介導(dǎo)的療法稱為光動力療法（photodynamic therapy，PDT）。當(dāng)產(chǎn)生的ROS濃度足夠高時，就可以殺死腫瘤細(xì)胞或細(xì)菌，從而發(fā)揮抗腫瘤或抗菌療效。另一方面，生成的ROS也可以用于誘導(dǎo)內(nèi)涵體/溶酶體膜破裂或者對ROS敏感的化學(xué)鍵的斷裂，使納米粒子中的藥物釋放[57]。Deng等[58]開發(fā)了一種將Cas9/sgRNA的RNP和二氫卟酚e6（Ce6）共同遞送的近紅外GSH響應(yīng)遞送系統(tǒng)。該課題組用氮基三乙酸（NTA）-二硫二丙酸酯（SS）-聚乙二醇（PEG）-聚己酸內(nèi)酯（PCL）共聚物膠束與Ce6通過自組裝生成納米粒子，其中用組氨酸標(biāo)記的Cas9/sgRNA和用iRGD修飾的NTA-SS-PEG-PCL包覆在納米粒子表面。Ce6作為光敏劑在671 nm光照下產(chǎn)生1O2，破壞內(nèi)涵體/溶酶體膜，將納米粒子釋放到胞漿中，然后在細(xì)胞質(zhì)中GSH作用下打斷雙硫鍵釋放RNP。體內(nèi)實驗表明，該遞送策略能通過靶向敲除Nrf2基因顯著降低細(xì)胞中Nrf2蛋白的表達(dá)，具有治療CNE-2型鼻咽癌的潛在價值。

稀土摻雜的上轉(zhuǎn)化納米粒子（UCNP）是一種獨特的無機(jī)納米粒子，可以將低能量的近紅外光轉(zhuǎn)化為高能的可見光或者紫外光，利用這一特點可以在深層次的組織區(qū)域中發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)[59]，而直接使用紫外線或可見光是無法實現(xiàn)的。Pan等[60]設(shè)計了一種基于UCNP的RNP遞送系統(tǒng)。RNP通過一種可以被紫外線切斷的光敏分子4-（羥甲基）-3-硝基苯甲酸（ONA）結(jié)合到UCNP的表面。在980 nm近紅外光照射下，UCNP產(chǎn)生紫外光，降解ONA并釋放RNP，實現(xiàn)了近紅外光控制的體外和體內(nèi)基因組編輯，顯著延長了A549荷瘤小鼠的生存期。

3.2 小分子響應(yīng)的CRISPR-Cas9遞送系統(tǒng)

最近，通過有機(jī)小分子調(diào)控Cas9功能的相關(guān)研究也為在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平對Cas9活性的調(diào)控開辟了新的途徑。通常情況下，對Cas9功能的化學(xué)控制是利用量身定制的小分子激活或抑制Cas9核酸酶的活性。為了提高CRISPR-Cas9基因組編輯的時空特異性，研究人員嘗試了一些化學(xué)控制策略來調(diào)控Cas9的活性，如dsCas9系統(tǒng)、自剪接內(nèi)嵌Cas9系統(tǒng)，以及分裂Cas9系統(tǒng)（split-Cas9）的二聚體等[61-62]。與光調(diào)控的Cas9功能相反，小分子可以通過器官特異性的方式從給藥部位到達(dá)深層組織，解決了光調(diào)控存在的穿透深度問題，從而實現(xiàn)對Cas9的精準(zhǔn)調(diào)控。Davis等[63]設(shè)計了一種通過小分子特異性調(diào)控Cas9活性的基因編輯系統(tǒng)。作者開發(fā)了一種新的Cas9核酸酶，在Cas9的特定位置嵌入4-羥基他莫昔芬（4-HT）響應(yīng)基團(tuán)。在4-HT存在的情況下，Cas9的編輯活性顯著提升。4-HT可以通過滲透作用直接進(jìn)入細(xì)胞，激活Cas9，產(chǎn)生編輯作用。該課題組嘗試在Cas9不同位置插入活性內(nèi)基并進(jìn)行篩選，最終發(fā)現(xiàn)活性內(nèi)基在Cys574位置時Cas9特異性最高，通過4-HT控制激活的該Cas9的編輯能力是野生型核酸酶的25倍。

3.3 超聲波響應(yīng)的CRISPR-Cas9遞送系統(tǒng)

除了光以外，超聲波也能用于基因編輯工具的胞內(nèi)遞送。與光相比，超聲波通常具有更深層次的組織穿透性，同時還顯示出與超聲波強(qiáng)度和頻率相關(guān)的生物效應(yīng)。高強(qiáng)度的超聲波能通過分子共振產(chǎn)生熱能，而低頻率的超聲波能產(chǎn)生空穴效應(yīng)。此外，將聲敏劑暴露于低強(qiáng)度的超聲波下可以觀察到ROS的產(chǎn)生，這也被稱為聲動力療法（sonodynamic therapy）[64]。Pu等[65]利用對ROS敏感的硫醚鍵將Cas9的RNP連接到集成了聲敏劑的納米金屬有機(jī)框架（nMOF）上，通過超聲波觸發(fā)nMOF中的聲敏劑5，10，15，20-四（4-羧基苯基）卟啉（TCPP），產(chǎn)生ROS打斷硫醚鍵從而釋放RNP，有效敲除A549細(xì)胞中的MTH1基因。體內(nèi)實驗結(jié)果表明，這種通過超聲波控制的基因編輯工具遞送系統(tǒng)可有效敲除癌基因從而抑制腫瘤生長，提高小鼠的生存率。

3.4 磁場響應(yīng)的CRISPR-Cas9遞送系統(tǒng)

磁場響應(yīng)的遞送系統(tǒng)通常由帶有磁性的納米材料組成。由于磁場具有優(yōu)異的組織穿透能力，外部磁場可以引導(dǎo)載體向目標(biāo)區(qū)域移動，實現(xiàn)遠(yuǎn)程控制的靶向給藥[66]。具有磁性的材料與CRISPR-Cas9形成納米粒子，在磁場的引導(dǎo)下可以減少非靶點區(qū)域的編輯作用，提高了基因組編輯的精確性。Zhu等[67]報道了一種納米顆粒-病毒雜合遞送系統(tǒng)，這種系統(tǒng)由含有Cas9/sgRNA-質(zhì)粒的桿狀病毒（BV）和磁性氧化鐵納米顆粒（MNP）組成（即MNP-BV）。大體積的BV提高了DNA的裝載能力，由于BV在哺乳動物細(xì)胞中沒有復(fù)制能力，所以遞送的質(zhì)粒只能在短時間內(nèi)起作用，同時，BV也會被體內(nèi)的免疫系統(tǒng)清除而失活。BV的清除可以被視為基因組編輯活性的關(guān)閉，而外部磁場由于可以促進(jìn)MNPBV復(fù)合物沿著磁場進(jìn)入靶點組織，產(chǎn)生特異性的基因組編輯，可以被視為基因編輯活性的激活。

4 結(jié)語與展望

與病毒載體相比，非病毒載體用于CRISPRCas9系統(tǒng)的遞送顯示出巨大的優(yōu)勢，通過設(shè)計不同的非病毒載體，將CRISPR-Cas9的質(zhì)粒、mRNA或RNP封裝于相應(yīng)的載體中，既提高了生物穩(wěn)定性又提升了基因組編輯效率，同時在一定程度上降低了脫靶效應(yīng)。然而，目前的非病毒納米遞送系統(tǒng)仍然有很多需要改進(jìn)的地方，以實現(xiàn)安全、精準(zhǔn)且高效的基因組編輯。正如本文所總結(jié)的，智能響應(yīng)的納米制劑通過生物體內(nèi)部信號或者外部刺激實現(xiàn)了基因編輯工具的遞送，并能在時間和空間上對CRISPR-Cas9工具予以控制[68]。雖然已經(jīng)有不少智能材料成功用于質(zhì)粒、mRNA、RNP的系統(tǒng)遞送，但由于CRISPR-Cas9/sgRNA工具的特殊性，設(shè)計刺激響應(yīng)納米材料時仍需要多加考慮[22]。

雖然近年來智能刺激響應(yīng)性材料用于CRISPRCas9遞送的研究已經(jīng)取得了一系列卓有成效的結(jié)果，但仍然存在著諸多挑戰(zhàn)。首先，雖然目前開發(fā)出了高效且具有器官或組織靶向能力的CRISPRCas9刺激響應(yīng)型遞送系統(tǒng)，但其精度不高，導(dǎo)致效率低下，仍然不能應(yīng)用于疾病的臨床治療。未來可以考慮設(shè)計具有多種刺激響應(yīng)性的材料來提高遞送的靶向精確性和編輯能力。其次，共遞送基因編輯工具和模板DNA用于基因定向修復(fù)的遞送材料仍然偏少，這可能是共遞送提升了刺激響應(yīng)型系統(tǒng)設(shè)計的難度。同時，對于材料的設(shè)計要充分考慮到實驗結(jié)果的可重復(fù)性和工業(yè)轉(zhuǎn)化應(yīng)用的可能性。再次，設(shè)計智能刺激響應(yīng)型非病毒遞送系統(tǒng)并用于其他最新報道的一些基因編輯工具[如單堿基編輯器（base editors）和先導(dǎo)編輯器（prime editors）等[30]]遞送的研究仍然較少。最后，目前報道的智能刺激響應(yīng)型CRISPR-Cas9遞送系統(tǒng)絕大部分仍然局限于臨床前研究，要將CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)真正應(yīng)用于臨床治療，還有很長的路要走。提高靶點基因的編輯效率、提升向靶細(xì)胞或靶組織遞送的特異性、減少潛在的脫靶效應(yīng)是當(dāng)務(wù)之急。此外，CRISPR-Cas9工具導(dǎo)致潛在的機(jī)體免疫反應(yīng)也是不可忽視的問題。但可以相信，隨著CRISPR-Cas9技術(shù)的不斷進(jìn)步和創(chuàng)新以及智能刺激響應(yīng)型遞送技術(shù)的不斷發(fā)展，兩者結(jié)合將實現(xiàn)更為精準(zhǔn)的基因組編輯，并應(yīng)用于臨床，造福廣大患者。