劉娜輝，王譯，邢磊，姜虎林

（中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009）

1 引言

罕見病是指人群中發(fā)病率極低的疾病，一般為慢性、嚴(yán)重性疾病，通常會導(dǎo)致終身殘疾或危及生命[1]。盡管罕見病的發(fā)病率低，但是由于人口基數(shù)較大，全球約有3.5億人罹患罕見病，約占全球總?cè)丝诘?0%[2]。目前，全球約有7 000多種罕見病，其中80%屬于遺傳性疾病[3]。其中，由單一遺傳缺陷引起的罕見病被稱為單基因罕見病[4]，可分為核基因突變的單基因罕見病和線粒體基因突變的單基因罕見病[5]。線粒體是真核細(xì)胞中必不可少的細(xì)胞器，也是重要的遺傳信息載體。線粒體擁有可獨立遺傳的環(huán)狀基因組，稱為線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA），其具有母系遺傳、基因結(jié)構(gòu)緊密、拷貝數(shù)高、突變率高和異質(zhì)性等特點[6]。在哺乳動物細(xì)胞中，mtDNA由于缺乏組蛋白保護、與線粒體內(nèi)膜距離較近以及缺少DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)等原因?qū)е缕淙菀装l(fā)生基因突變[7]。而當(dāng)細(xì)胞中突變型mtDNA達(dá)到一定數(shù)量時會引起細(xì)胞功能障礙，從而出現(xiàn)線粒體單基因突變罕見病的臨床表現(xiàn)[8-10]。較為典型的線粒體單基因突變罕見病包括Leber遺傳性視神經(jīng)病變（Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON）[11]、線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和腦卒中樣發(fā)作（mitochondrial encephalomyopathy，lactic acidosis，and stroke-like episodes，MELAS）綜合征[12]、肌陣攣性癲癇伴不規(guī)則紅纖維（myoclonic epilepsy with ragged-red fibers，MERRF）綜合征[13]、Kearns-Sayre綜 合 征（Kearns-Sayre syndrome，KSS）[14]、慢性進行性眼外肌麻痹（chronic progressive external ophthalmoplegia，CPEO）[15]等。目前，小分子藥物是線粒體單基因突變罕見病的臨床一線用藥，但是該類藥物僅能緩解疾病的癥狀，而不能從根本上糾正突變的mtDNA，因此無法徹底治愈此類疾病[16]。

基因治療是指通過分子生物學(xué)方法，將正?；蛴兄委熥饔玫幕?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補償基因的缺陷，從而實現(xiàn)治療或者改善某種疾病的目的[17]。因此，傳統(tǒng)的基因治療或基因編輯手段有望通過補充正常的mtDNA或直接修復(fù)突變的mtDNA，達(dá)到治療線粒體單基因突變罕見病的目的。此外，相比于小分子藥物治療而言，基因治療具有特異性強、毒性低和作用時間長等優(yōu)點，可顯著減少給藥次數(shù)并提高患者的順應(yīng)性[18]。目前，已有1款治療單基因罕見眼病——Leber先天性黑朦（Leber congenital amaurosis，LCA）的基因治療藥物上市[19]?？梢韵嘈牛蛑委熢诰€粒體單基因突變罕見病治療領(lǐng)域具有巨大的發(fā)展?jié)摿20]。

線粒體單基因突變罕見病的基因治療方法包括異位表達(dá)和原位線粒體基因療法。由于線粒體遞送屏障的存在，研究人員通過異位表達(dá)實現(xiàn)線粒體疾病治療，該方法首先將含有線粒體靶向序列（mitochondrial-targeting sequence，MTS）的 治 療DNA遞送導(dǎo)入細(xì)胞核，隨后轉(zhuǎn)錄得到的mRNA在MTS引導(dǎo)下靠近線粒體并將功能蛋白導(dǎo)入線粒體基質(zhì)從而發(fā)揮作用。異位表達(dá)最常用的載體是病毒載體，包括慢病毒和腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）。慢病毒因其能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因的長期表達(dá)而被廣泛運用于基因治療領(lǐng)域，但其整合后存在誘變的風(fēng)險[21]；AAV通過表現(xiàn)出染色體外結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性來降低誘變風(fēng)險，從而能夠以較低的致癌風(fēng)險進行長期表達(dá)，然而其安全性風(fēng)險仍存在較大的爭議[22]。異位表達(dá)雖然可以繞過線粒體屏障，但是這種兩步遞送的方法可能會影響整體基因治療的效率。為了簡化遞送程序，研究人員開發(fā)了原位線粒體基因療法，通過病毒或非病毒載體介導(dǎo)的方式將外源基因直接遞送至線粒體。然而如何有效地跨越線粒體屏障將外源基因遞送至線粒體基質(zhì)仍然是原位線粒體基因治療領(lǐng)域的一個巨大挑戰(zhàn)。隨著線粒體分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，越來越多基因遞送系統(tǒng)相繼出現(xiàn)，為線粒體單基因突變罕見病的基因治療提供了希望。

本綜述以2個具有代表性的線粒體單基因突變罕見病為例，歸納了其病理特征、基因遞送屏障和臨床試驗中使用的治療方法，并總結(jié)了針對該類疾病已開發(fā)的基因遞送系統(tǒng)。最后，對基因療法治療線粒體單基因突變罕見病所面臨的挑戰(zhàn)和應(yīng)用前景進行了系統(tǒng)的討論。

2 全身性疾病——MELAS與MERRF綜合征 的基因治療

2.1 MELAS和MERRF綜合征的病理學(xué)特征和線粒體屏障

MELAS綜合征是一種涉及多個器官的疾病，常伴有身材矮小、反復(fù)頭痛、癲癇、卒中樣發(fā)作、聽力障礙等臨床特征[23]。83.7% MELAS綜合征患者的致病突變?yōu)閙.3243A＞G突變（即mtDNA 3243位腺嘌呤脫氧核苷酸突變?yōu)轼B嘌呤脫氧核苷酸）[24]。MERRF綜合征的發(fā)生與4個突變位點有關(guān)，其中最常見的是m.8344A＞G突變[25]。這些由mtDNA的致病性突變而引發(fā)的疾病主要通過母系遺傳，并已被確定為多系統(tǒng)線粒體疾病。

在MELAS和MERRF綜合征患者的全身細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了突變的線粒體。線粒體膜由多孔的線粒體外膜（outer mitochondrial membrane，OMM）和密集的、疏水的線粒體內(nèi)膜（inner mitochondrial membrane，IMM）組成，其雙層膜結(jié)構(gòu)的存在阻礙了治療基因或藥物的線粒體靶向遞送[26]。同時，線粒體膜具有較高的線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP），在體外測量為－200 ～－180 mV，在活細(xì)胞中為－150 ～－130 mV[27]。復(fù)雜的線粒體屏障嚴(yán)格限制了外源離子和分子進入膜間隙，也限制了mtDNA突變相關(guān)單基因罕見病（如MELAS和MERRF綜合征）治療方法的發(fā)展。

2.2 現(xiàn)有治療手段

目前該疾病并沒有有效的治療方法。臨床可用的治療手段主要集中在緩解相關(guān)癥狀或恢復(fù)線粒體呼吸鏈功能方面。例如，l-精氨酸和瓜氨酸療法有利于預(yù)防由MELAS綜合征引起的卒中樣發(fā)作[28]。一些研究發(fā)現(xiàn)，輔酶Q10（coenzyme Q10，CoQ10）可應(yīng)用于緩解MELAS綜合征患者的肌肉無力和疲勞[29]。左乙拉西坦、托吡酯、唑尼沙胺、吡拉西坦和苯二氮?類藥物均為抗癲癇藥物，常用于治療由MERRF綜合征引起的肌陣攣和癲癇[30]。這些對癥治療可以緩解上述癥狀，但對疾病引起的其他并發(fā)癥沒有作用，因此找到一種能從根本上解決基因突變的方法尤為重要。

2.3 MELAS和MERRF綜合征的基因治療策略

2.3.1 病毒載體介導(dǎo)的基因治療基因治療發(fā)展迅速，但大多數(shù)此類研究都集中在具有大量患者的常見疾病上面，而MERRF和MELAS綜合征等罕見疾病受到的關(guān)注相對較少。

盡管很少有研究團隊開發(fā)針對MERRF和MELAS綜合征的基因治療策略，但用于糾正致病性mtDNA突變的線粒體基因編輯可以為治療MERRF和MELAS綜合征提供一種可行的方案。CRSPR/Cas9系統(tǒng)有利于解決核DNA突變，但由于其相對分子質(zhì)量較大，難以進入線粒體基質(zhì)直接糾正mtDNA突變。相反，傳統(tǒng)的基因編輯方法似乎更適用于線粒體基因編輯。一些研究者使用AAV分別將線粒體靶向的鋅指核酸酶（mitochondrially targeted zinc-finger nuclease，mtZFN）[31]或線粒體靶向轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（mitochondrialtargeted transcription activator-like effector nuclease，mitoTALEN）[32]遞送至線粒體，并在小鼠模型中實現(xiàn)了疾病相關(guān)表型的逆轉(zhuǎn)。Mok等[33]發(fā)現(xiàn)了一種名為DddA的細(xì)菌間毒素，它可以催化dsDNA中胞苷發(fā)生脫氨基作用。該課題組融合了DddA的不同部分、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)陣列蛋白和尿嘧啶糖基化酶抑制劑，生成不含RNA的DddA衍生胞嘧啶堿基編輯器（DddA-derived cytosine base editor，DdCBE），在人類mtDNA中該編輯器可以準(zhǔn)確高效地將CG轉(zhuǎn)化為TA。DdCBE的出現(xiàn)使精確操縱mtDNA成為可能，在治療線粒體單基因突變罕見病方面具有廣闊的前景。

2.3.2 克服MELAS和MERRF綜合征基因治療的線粒體屏障在缺乏針對MELAS和MERRF綜合征的線粒體基因治療研究的情況下，可以參考現(xiàn)有線粒體基因遞送的相關(guān)策略[34]。一些研究使用物理方法將遺傳物質(zhì)直接輸送到線粒體，但該方法會對靶細(xì)胞造成較大的傷害。此外有研究者使用化學(xué)或生物學(xué)方法通過IMM的高疏水性和MMP的負(fù)電性實現(xiàn)線粒體靶向的基因遞送[35]。常用的線粒體靶向基團包括非局部凈正電荷基團，例如小分子化合物三苯基膦（triphenylphosphine，TPP）、地喹啉（dequalinium，DQA）和線粒體穿透肽（包括MTS肽和Szeto-Schiller肽）[36]。TPP具有正電性和疏水性，常用于靶向線粒體，筆者所在課題組利用TPP構(gòu)建了一種線粒體靶向共聚物，實現(xiàn)了siRNA和藥物的有效共遞送[37]。

另外，許多研究者正在開發(fā)用于線粒體單基因疾病的非病毒載體材料。Yamada等[38]設(shè)計了一種名為MITO-Porter的復(fù)合物，可以通過膜融合將具有治療作用的基因遞送到線粒體。該課題組篩選多種脂質(zhì)成分并通過八精氨酸表面修飾制備得到精準(zhǔn)靶向線粒體的MITO-Porter體系。隨后，該課題組設(shè)計了一種名為pCMV-mtLuc的遞送體系，其中含有CMV啟動子和熒光素酶（NanoLuc，Nluc）。在這項工作中，他們利用KALA肽代替了先前使用的八精氨酸以制備KALA-MITO-Porter。在KALA和膜融合的共同作用下，KALA-MITOPorter在線粒體單基因疾病患者的G625A成纖維細(xì)胞中表現(xiàn)出較好的線粒體靶向能力（見圖1）[39]。Yamada等開發(fā)的基于非病毒載體的線粒體基因療法有望治療各種線粒體單基因疾病，包括MELAS和MERRF綜合征。

圖1 MITO-Porter體系向線粒體遞送基因的示意圖[39]Figure 1 Schematic diagram of MITO-Porter system delivering genes to mitochondria

3 眼病LHON的基因治療

3.1 LHON 的病理學(xué)和眼屏障

LHON是由mtDNA突變引起的失明[40]，其中超過95%的突變是由于線粒體呼吸鏈復(fù)合物上3個亞基中的1個突變所引起的。在我國，90%的LHON患者為m.11778G＞A突變，導(dǎo)致線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ亞基——還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶4（NADH dehydrogenase 4，ND4）發(fā)生組氨酸取代精氨酸[41]，進而引起線粒體功能障礙。線粒體功能障礙可引起細(xì)胞內(nèi)ATP合成量減少，氧化磷酸化缺陷，同時可產(chǎn)生過量活性氧（reactive oxygen species，ROS），進一步損傷線粒體及細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白和脂類。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell，RGC）只在椎板處有髓鞘覆蓋，其他部位均處于裸露狀態(tài)，動作電位的產(chǎn)生與傳播都需要消耗更多的能量。因此，相對于身體內(nèi)其他類細(xì)胞，RGC更容易受到線粒體功能障礙的影響，導(dǎo)致RGC的功能異常，從而使細(xì)胞凋亡，最終引起視覺喪失[42]。

RGC線粒體活性的恢復(fù)是LHON治療的關(guān)鍵問題。由于RGC位于視網(wǎng)膜的表面，所以其主要的眼屏障是玻璃體屏障[43]。玻璃體分為2個區(qū)域：髓質(zhì)玻璃體和皮質(zhì)玻璃體。髓質(zhì)玻璃體是膠原蛋白和透明質(zhì)酸的無細(xì)胞混合物，以凝膠或液體狀態(tài)存在[44]。皮質(zhì)玻璃體包圍著髓質(zhì)玻璃體。雖然皮質(zhì)玻璃體只占玻璃體總體積的2%，但它含有對玻璃體代謝至關(guān)重要的體細(xì)胞。此外，纖維細(xì)胞是相關(guān)結(jié)締組織的重要組成部分，也位于皮質(zhì)玻璃體中。體細(xì)胞和纖維細(xì)胞的存在，使皮質(zhì)玻璃體以更稠密的纖維狀形態(tài)存在。因此，在LHON中實現(xiàn)生物大分子遞送的先決條件是治療藥物在玻璃體注射后必須保持可移動性才能到達(dá)視網(wǎng)膜層的靶細(xì)胞。

3.2 現(xiàn)有治療手段

艾地苯醌（idebenone，Ide）是目前唯一被批準(zhǔn)用于治療LHON的藥物。作為抗氧化劑，Ide可以繞過線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ直接將電子轉(zhuǎn)移到線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ，恢復(fù)ROS平衡并使細(xì)胞ATP生成正?；痆45]。然而，該藥只能緩解LHON的癥狀，

并不能從根本上解決LHON基因突變所帶來的問題?；蛑委熓侵斡鶯HON最可行的方法[46]。Luxturna是一種由羅氏公司（Roche）開發(fā)的病毒載體基因療法，用于治療因RPE65基因突變導(dǎo)致的失明，如LCA。這是首個上市的用于治療LCA的基因治療藥物，也是首個被批準(zhǔn)用于治療單基因罕見眼部疾病的基因療法，鑒于Luxturna的成功上市[47]，LHON也很可能通過眼部基因療法得到治愈。

3.3 LHON的基因治療策略

3.3.1 病毒載體介導(dǎo)的基因治療隨著對LHON生物分子機制研究的不斷深入，一些研究人員利用異位表達(dá)來恢復(fù)線粒體基質(zhì)中受損蛋白質(zhì)的功能，他們將含有MTS的治療質(zhì)粒DNA導(dǎo)入細(xì)胞核，隨后轉(zhuǎn)錄得到的mRNA在MTS引導(dǎo)下靠近線粒體并將功能蛋白導(dǎo)入線粒體基質(zhì)從而發(fā)揮作用[48-49]。這些基因治療方案目前正處于臨床試驗的不同階段。其中大多數(shù)通過AAV介導(dǎo)的核基因遞送手段將一種線粒體靶向序列修飾的質(zhì)粒遞送到細(xì)胞核，最終將翻譯得到的治療性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運至線粒體中（見表1）。

表1 臨床在研的Leber遺傳性視神經(jīng)病變基因療法Table 1 The gene therapies for Leber’s hereditary optic neuropathy in clinical development

另外一種策略是病毒載體介導(dǎo)的原位線粒體基因療法。與MELAS和MERRF綜合征的基因治療類似，在線粒體基質(zhì)成功表達(dá)mtDNA的2個先決條件是：設(shè)計mtDNA遞送系統(tǒng)和開發(fā)有效的基因載體。Yu等[50]將AAV衣殼蛋白和MTS肽融合作為載體，用于遞送mtND4基因。研究人員在細(xì)胞和動物水平上驗證了該載體的基因遞送效率?？偟膩碚f，這些研究為原位線粒體基因遞送技術(shù)的發(fā)展提出了新的方向。

3.3.2 非病毒載體介導(dǎo)的基因治療在原位線粒體基因治療中構(gòu)建合適的裸mtDNA質(zhì)粒是至關(guān)重要的。為實現(xiàn)mtDNA的遞送，Yasuzaki等[51]設(shè)計了pHSP-mtLuc（CGG）作為高效裸質(zhì)粒DNA。pHSPmtLuc（CGG）是由線粒體重鏈啟動子（heavy strand promoter，HSP）和mtDNA序列構(gòu)成的線粒體報告質(zhì)粒DNA，該mtDNA序列是編碼適應(yīng)線粒體密碼子的NanoLuc（Nluc）熒光素酶報告基因，并且作者驗證了該裸質(zhì)粒DNA對mtDNA遞送的效率（見圖2）。

圖2 含有線粒體重鏈啟動子的裸DNA質(zhì)粒在基因治療中的應(yīng)用[51]Figure 2 Application of naked DNA plasmid containing mitochondrial heavy chain promoter in gene therapy

“2.3.2”節(jié)中介紹的MITO-Porter系統(tǒng)也可應(yīng)用于LHON治療。此外，由于氨基酸在體內(nèi)容易降解，具有生物相容性的多肽可作為基因載體材料。Chuah等[52]通過用酵母細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅳ的12個殘基區(qū)域序列修飾KH序列生成Cytcox-KH，并將鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（ornithine transcarbamylase，OTC）的32個殘基與KH序列融合生成OTC-KH（見圖3）。Cytcox-KH在人胚胎腎（human embryonic kidney，HEK）293細(xì)胞中表現(xiàn)出良好的線粒體轉(zhuǎn)染能力。筆者所在課題組成功構(gòu)建了一種病理響應(yīng)性線粒體基因遞送載體TISUH，其可以通過TPP和氟化作用克服LHON中降低的MMP，較好地實現(xiàn)對病變線粒體的靶向作用；同時該遞送載體可以在線粒體高ROS條件下發(fā)生降解，釋放功能基因，從而提高基因轉(zhuǎn)染效率，從根本上糾正mtDNA突變帶來的異常[53]（見圖4）。

圖3 具有良好生物相容性的雙結(jié)構(gòu)域多肽在靶向線粒體的基因遞送中的應(yīng)用[52]Figure 3 Application of dual-domain peptides with good biocompatibility in gene delivery targeting mitochondria

圖4 TISUH在LHON的原位線粒體基因治療中的應(yīng)用[53]Figure 4 Application of TISUH in in-situ mitochondrial gene therapy for LHON

為了實現(xiàn)LHON的原位線粒體基因療法，基因治療體系需要在玻璃體注射后克服玻璃體屏障到達(dá)RGC才能發(fā)揮作用。Martens等[54-55]報道了一種用于檢測熒光納米粒在完整玻璃體中移動速度的離體實驗。他們使用不同相對分子質(zhì)量的透明質(zhì)酸修飾陽離子聚合物/DNA納米粒，發(fā)現(xiàn)具有較低相對分子質(zhì)量（22 000和137 000）的透明質(zhì)酸可以增加復(fù)合物在玻璃體中的流動性。

目前關(guān)于原位mtDNA遞送的研究較少，在多數(shù)情況下，線粒體基因遞送效率難以在體內(nèi)得到驗證。因此，開發(fā)用于LHON治療的原位線粒體基因療法依舊任重道遠(yuǎn)。

4 結(jié)語與展望

近年來，基因治療已經(jīng)在癌癥和部分遺傳性疾病治療領(lǐng)域取得了重大突破，針對線粒體單基因突變罕見病開展的臨床和臨床前研究也取得了積極的進展。然而，線粒體單基因突變罕見病的基因治療仍面臨著許多挑戰(zhàn)。無論是異位表達(dá)還是原位線粒體基因治療均需要安全有效的基因遞送載體。病毒載體因其轉(zhuǎn)染效率高而在臨床研究中得到了較廣泛的應(yīng)用，但其仍存在潛在的安全問題和免疫原性風(fēng)險；非病毒載體具有成本低、安全性高、可修飾等優(yōu)點，但有限的基因轉(zhuǎn)染效率限制了其在該領(lǐng)域的進一步應(yīng)用。此外，缺乏相應(yīng)的動物模型和足夠的臨床樣本導(dǎo)致臨床轉(zhuǎn)化試驗的開展具有較大難度。

雖然基因治療存在許多挑戰(zhàn)，但它仍然是解決線粒體單基因突變罕見病難題的有效途徑。為安全有效的藥物遞送過程開發(fā)更合適的遞送載體、提高其工業(yè)化生產(chǎn)的可行性，并建立符合疾病臨床特征的動物模型是未來發(fā)展的主要方向。目前，線粒體單基因突變罕見病的基因治療效果及臨床前研究的眾多進展表明，基因療法在治療線粒體單基因突變罕見病方面具有巨大的潛力和發(fā)展前景。