曾 靜，何礎(chǔ)闊，郭建軍，侯安偉，聶俊輝，袁 林,*

（1.江西省科學(xué)院微生物研究所，江西 南昌 330096；2.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 海口 570228）

淀粉糖消費(fèi)領(lǐng)域廣、數(shù)量大，是淀粉深加工的支柱產(chǎn)品[1-2]。我國(guó)的淀粉制糖工業(yè)發(fā)展迅速，淀粉糖的產(chǎn)量、種類、質(zhì)量、規(guī)模都處于較高水平，其中產(chǎn)量?jī)H次于美國(guó)，居世界第二位[1-2]。因此，優(yōu)化淀粉制糖工藝的相關(guān)研究對(duì)我國(guó)淀粉制糖工業(yè)進(jìn)一步發(fā)展具有重要的技術(shù)和經(jīng)濟(jì)意義?，F(xiàn)行工業(yè)淀粉制糖工藝包括液化和糖化兩個(gè)步驟[3-5]。淀粉首先經(jīng)過(guò)高溫液化步驟，經(jīng)過(guò)α-淀粉酶水解，將高聚糖水解為低聚糖，這一過(guò)程的反應(yīng)條件為pH 6.0、95～105 ℃。液化產(chǎn)生的低聚糖隨后在β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和普魯蘭酶以及異淀粉酶等作用下，殘留的直鏈α-1,4-糖苷鍵和支鏈α-1,6-糖苷鍵被進(jìn)一步水解，最終形成葡萄糖漿，該過(guò)程稱為糖化步驟，其最適酶促條件為pH 4.5、60～62 ℃。液化步驟和糖化步驟的反應(yīng)溫度、pH值均不同，并且淀粉制糖工藝中使用了多種淀粉水解酶，這些因素使得工業(yè)淀粉制糖的生產(chǎn)成本增加、生產(chǎn)效率降低。因此，如果能夠獲得一種在高溫液化條件下具有較強(qiáng)水解α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵能力的酶，則可大大降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。

III型普魯蘭多糖水解酶（EC 3.2.1.1/41）屬于糖苷水解酶類的第13家族（GH13_20），是一種雙功能淀粉水解酶，可同時(shí)水解α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵，具有α-淀粉酶和普魯蘭酶的功能[6-9]。嗜熱酸性III型普魯蘭多糖水解酶可在高溫的液化條件下完全水解淀粉為淀粉糖，有望實(shí)現(xiàn)“液化糖化一步法”淀粉酶法制糖工藝。嗜熱酸性III型普魯蘭多糖水解酶TK-PUL來(lái)源于極端嗜熱古生菌（Thermococcus kodakarensis）KOD1，具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性和高溫活性，并且其熱穩(wěn)定性和高溫活性均不依賴于Ca2+，即TK-PUL的酶學(xué)性質(zhì)完全符合淀粉酶法制糖工業(yè)的需求[10-14]。已有研究表明，將TK-PUL以1 mg/g（淀粉干物質(zhì)計(jì)）的使用量加入30%玉米淀粉乳中（100 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液，pH 4.2），100 ℃反應(yīng)10 min，然后于90 ℃反應(yīng)96 h后，玉米淀粉乳完全轉(zhuǎn)化為淀粉糖，產(chǎn)物中聚合度（degree polymerization，DP）1～7所占比例為80.5%，DP7以上所占比例為8.3%，DPn所占比例為11.2%[12]。因此TK-PUL在淀粉酶法制糖工業(yè)中具有巨大的應(yīng)用潛力。

另外，TK-PUL是目前已知的催化活性最高的III型普魯蘭多糖水解酶，其也可作為模板研究III型普魯蘭多糖水解酶以單一活性中心同時(shí)水解α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵的雙功能催化機(jī)制。TK-PUL具有糖苷水解酶類第13家族酶分子結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制上的共同特征，例如保守基序（CSR-I、CSR-II、CSR-III、CSR-IV）、保守的催化活性中心（Asp503、Glu534、Asp601）、3個(gè)結(jié)構(gòu)域（N末端結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域、C末端結(jié)構(gòu)域）等[15]。將TK-PUL與其同源酶進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)TK-PUL具有氨基酸序列和分子結(jié)構(gòu)的特異性[15-16]。TK-PUL的氨基酸序列和分子結(jié)構(gòu)的特異性可能與其雙功能催化機(jī)制相關(guān)。例如，TK-PUL中結(jié)構(gòu)域N2的缺失可影響其底物選擇性，導(dǎo)致其α-淀粉酶活性與普魯蘭酶活性的比值由0.49提高至0.60[16]。本研究選取TK-PUL的保守基序中非保守氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建定點(diǎn)突變體，并通過(guò)比較TK-PUL與突變體的酶學(xué)特性，以確定TK-PUL保守基序中關(guān)鍵氨基酸殘基對(duì)其催化性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）RIK1285、TK-PUL表達(dá)載體pBES-Atkp均由本實(shí)驗(yàn)室保存；TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker、質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒 日本TaKaRa公司；QuickMutation?基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖?上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Chelating SepharoseTMFast Flow 美國(guó)GE Healthcare公司；TLC Silica gel 60硅膠板 美國(guó)Sigma公司；普魯蘭糖、可溶性淀粉、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、潘糖、異潘糖上海惠誠(chéng)生物科技有限公司；Bradford法蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastercycler gradient聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Eppendorf公司；TY04S-3C凝膠成像系統(tǒng) 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；SP-752PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析

采用NCBI在線軟件BLASTP對(duì)TK-PUL的氨基酸序列進(jìn)行相似性分析，選取與其氨基酸序列相似性高的淀粉水解酶。采用Clustal-Omega（http://www.ebi.ac.uk/）[17]對(duì)TK-PUL以及這些淀粉水解酶中4個(gè)保守基序（CSR-I、CSR-II、CSR-III、CSR-IV）的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，生成氨基酸序列比對(duì)文件。將得到的序列比對(duì)文件導(dǎo)入在線工具WebLogo 3.6（http://weblogo.berkeley.edu/）[18]，生成TK-PUL以及多種淀粉水解酶中4個(gè)保守基序的氨基酸序列相關(guān)的序列識(shí)別圖。

采用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org）[19]，以TK-PUL（PDB ID：5OT1）的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)為模板，同源模建突變體的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)。并采用三維圖像軟件PyMOL v0.99顯示TK-PUL及突變體的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3.2 定點(diǎn)突變體的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)QuickMutationTM基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖械恼f(shuō)明書(shū)，結(jié)合基因tk-pul的堿基序列和擬突變的氨基酸位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，如表1所示。以定點(diǎn)突變體I500W的構(gòu)建為例，采用引物I500W-F和I500W-R，以重組質(zhì)粒pBE-S-Atkp為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到包含載體序列和突變基因序列的線性片段。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶DpnI處理后，直接轉(zhuǎn)化E. coliJM109，涂布于卡那霉素抗性平板進(jìn)行篩選。提取轉(zhuǎn)化子中重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，并與相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)。其他定點(diǎn)突變體的構(gòu)建參照突變體I500W的構(gòu)建方法。

表1 構(gòu)建重組質(zhì)粒所用引物Table 1 Primer sequences used for the construction of recombinant plasmids

1.3.3 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入B. subtilisRIK1285感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組B. subtilis。B. subtilisRIK1285感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化采用改進(jìn)的Spizizen法[20]進(jìn)行。重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)與純化參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)重組酶的純度[21]，并采用Bradford法[21]測(cè)定重組酶的濃度。

1.3.4 重組酶的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性測(cè)定

分別以1 g/100 mL可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物，測(cè)定重組酶的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性[16]。酶活力單位[22]定義：在一定反應(yīng)條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.5 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

分別以1%可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物，測(cè)定重組酶的最適反應(yīng)pH值、pH值穩(wěn)定性、最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性[16]。

1.3.6 重組酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定

分別以可溶性淀粉、普魯蘭多糖、麥芽三糖、或異潘糖為底物，采用50 mmol/L 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid monohydrate，MES），pH 4.5緩沖液配制不同濃度的底物，并分別向不同濃度底物中加入等量的酶液。按照1.3.4節(jié)方法測(cè)定酶分別以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物的比活力，參照文獻(xiàn)[23]測(cè)定酶分別以麥芽三糖或異潘糖為底物的比活力。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法，以底物濃度倒數(shù)為橫坐標(biāo)，以酶比活力倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，計(jì)算米氏常數(shù)Km、最大反應(yīng)速度Vmax和反應(yīng)常數(shù)kcat。其中可溶性淀粉和普魯蘭多糖質(zhì)量濃度梯度依次設(shè)定為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL；麥芽三糖和異潘糖質(zhì)量濃度梯度依次設(shè)定為1.6、3.2、6.4、12.8、16.0、20.0 mg/mL。

1.3.7 薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）分析

以低聚糖為底物時(shí)，向100 μL含1 g/100 mL低聚糖的50 mmol/L MES、pH 4.5緩沖液中加入0.1 U的酶液，于90 ℃反應(yīng)1 h后，迅速放入冰水浴中終止反應(yīng)，12 000×g離心5 min，取上清液進(jìn)行TLC分析；以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物時(shí)，向500 μL含1 g/100 mL可溶性淀粉或普魯蘭多糖的50 mmol/L MES、pH 4.5緩沖液中加入1.5 U的酶液，于90 ℃反應(yīng)16 h后，迅速放入冰水浴中終止反應(yīng)，12 000×g離心5 min，取上清進(jìn)行TLC分析。

酶解產(chǎn)物的TLC分析參照文獻(xiàn)[23]進(jìn)行。用毛細(xì)管點(diǎn)樣，點(diǎn)樣時(shí)用吹風(fēng)機(jī)迅速吹干樣品，將點(diǎn)好樣品的薄層板放入層析缸，展層時(shí)間為2 h左右。其中用于可溶性淀粉的酶解物分析的展開(kāi)劑（體積比）為正丁醇∶乙酸∶水=3∶3∶1，用于普魯蘭多糖及低聚糖酶解產(chǎn)物分析的展開(kāi)劑（體積比）為正丁醇∶乙醇∶水=5∶3∶2。展層結(jié)束之后，將薄層板取出，浸沒(méi)在顯色劑溶液中，顯色劑配方為苯胺-二苯胺，0.1 g二苯胺溶于2.5 mL丙酮，100 μL苯胺溶于2.4 mL丙酮；將上述兩液混合后，加入500 μL磷酸，搖勻至白色沉淀消失，4 ℃保存。再立即用吹風(fēng)吹干，放在95 ℃烘干顯色15 min即可觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

酶學(xué)性質(zhì)研究實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。運(yùn)用軟件SigmaPlot 12.5對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，數(shù)據(jù)均以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 TK-PUL保守區(qū)域中突變位點(diǎn)的選擇及突變體的構(gòu)建

采用NCBI的在線軟件BLASTP對(duì)TK-PUL（UniProt ID：Q5JID9）的氨基酸序列進(jìn)行相似性分析，并選取其中序列相似性較高且催化特性不同的9種淀粉水解酶。這9種淀粉水解酶包括來(lái)源于Thermococcus aggregans的III型普魯蘭多糖水解酶（UniProt ID：Q9P9A0）[24]、來(lái)源于Desulfurococcus mucosus的淀粉普魯蘭酶（UniProt ID：Q9HHB0）[25]、來(lái)源于Bacillus acidopullulyticus的麥芽糖淀粉酶（UniProt ID：P32818）[26]、來(lái)源于Thermoanaerobacter ethanolicus的環(huán)糊精水解酶（UniProt ID：P29964）[27]、來(lái)源于Thermoactinimyces vulgaris的I型普魯蘭多糖水解酶（UniProt ID：Q08751）[28]、來(lái)源于Bacillus stearothermophilus的I型普魯蘭多糖水解酶（UniProt ID：P38940）[29]、來(lái)源于Bacillussp. KSM-1876的I型普魯蘭多糖水解酶（UniProt ID：Q57482）[30]、來(lái)源于Geobacillus stearothermophilus的麥芽糖淀粉酶（UniProt ID：Q45490）[31]、來(lái)源于Bacillus cereus的I型普魯蘭多糖水解酶（UniProt ID：Q819G8）[32]。

采用Clustal-Omega對(duì)TK-PUL以及這9種淀粉水解酶中4個(gè)保守基序（CSR-I、CSR-II、CSR-III、CSR-IV）的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，生成氨基酸序列比對(duì)文件。將得到的序列比對(duì)文件導(dǎo)入在線工具WebLogo 3.6，生成TK-PUL以及多種淀粉水解酶中4個(gè)保守基序的氨基酸序列相關(guān)的序列識(shí)別圖（圖1）。可以得出，與以上9種淀粉水解酶相比，TK-PUL中4個(gè)保守基序的一些氨基酸位點(diǎn)存在不同的氨基酸殘基。選取保守基序中在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)（即氨基酸序列）上鄰近酶催化活性位點(diǎn)（Asp503、Glu534、Asp601）的氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建定點(diǎn)突變體I500W、V502L、P505A、L531I、T537H、D598G。并通過(guò)比較TK-PUL與定點(diǎn)突變體的酶學(xué)性質(zhì)研究TK-PUL保守基序中關(guān)鍵氨基酸殘基對(duì)其催化性質(zhì)的影響。

圖1 TK-PUL和多種淀粉水解酶中4個(gè)保守基序的序列標(biāo)識(shí)圖Fig. 1 Sequence logo for the four conserved regions of TK-PUL and other amylolytic enzymes

2.2 突變體的表達(dá)純化及比活力分析

于B. subtilis表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)TK-PUL及各突變體，重組酶TK-PUL以及各突變體均得到成功表達(dá)，且主要位于發(fā)酵上清液中。采用Ni2+親和層析法對(duì)重組酶進(jìn)行純化，并采用SDS-PAGE檢測(cè)各重組酶的純度。如圖2所示，TK-PUL以及各突變體（I500W、V502L、P505A、L531I、T537H、D598G）的表觀分子質(zhì)量均約為84 kDa，大小均與理論值相符。

圖2 重組蛋白質(zhì)的SDS-PAGEFig. 2 SDS-PAGE analysis of the recombinant proteins

采用Bradford法測(cè)定TK-PUL及各突變體的蛋白質(zhì)濃度，并測(cè)定各重組酶分別以可溶性淀粉和普魯蘭多糖為底物的比活力，結(jié)果如表2所示。與TK-PUL相比，突變體V502L、P505A、L531I、T537H、D598G的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性基本不變；突變體I500W的α-淀粉酶比活力為46.15 U/mg，約為TK-PUL的83.03%；I500W的普魯蘭酶比活力為82.27 U/mg，約為TK-PUL的73.02%。即位于CSR-II的氨基酸殘基Ile500突變?yōu)門rp500，導(dǎo)致TKPUL的α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性均明顯下降。本研究進(jìn)一步比較分析TK-PUL和突變體I500W的其他催化特性（如最適反應(yīng)pH值、pH值穩(wěn)定性、最適反應(yīng)溫度、熱穩(wěn)定性、動(dòng)力學(xué)常數(shù)等），確定I500W位點(diǎn)變化對(duì)TK-PUL催化性質(zhì)的影響。

表2 TK-PUL及突變體的比活力Table 2 Specific activities of TK-PUL and its mutants

2.3 TK-PUL與突變體I500W的酶學(xué)性質(zhì)比較

如圖3所示，以1 g/100 mL可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物時(shí)，TK-PUL及突變體I500W的最適反應(yīng)pH值均約為4.5，并且TK-PUL及突變體I500W的最適反應(yīng)pH值曲線的變化趨勢(shì)基本相同。此外，在pH 3.0～9.0的范圍內(nèi)，TK-PUL及突變體I500W的pH值穩(wěn)定性也基本一致（圖4）。這表明TK-PUL中I500W位點(diǎn)變化不影響其最適反應(yīng)pH值和pH值穩(wěn)定性。

圖3 重組酶的最適反應(yīng)pH值Fig. 3 Optimal pH of recombinant enzymes

圖4 重組酶的pH值穩(wěn)定性Fig. 4 pH stability of recombinant enzymes

如圖5所示，以1 g/100 mL可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物時(shí)，TK-PUL及突變體I500W的最適反應(yīng)溫度均為100 ℃，并且在40～110 ℃范圍內(nèi)兩者的相對(duì)酶活力隨溫度變化趨勢(shì)也基本相同。同時(shí)，由圖6可知，TK-PUL及突變體I500W于100 ℃的熱穩(wěn)定性也基本一致，均約為2 h。即TK-PUL中I500W位點(diǎn)變化也不影響其最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性。

圖5 重組酶的最適反應(yīng)溫度Fig. 5 Temperature dependence of recombinant enzymes

圖6 重組酶于100 ℃的熱穩(wěn)定性Fig. 6 Thermal stability of recombinant enzymes at 100 ℃

2.4 TK-PUL及突變體I500W對(duì)可溶性淀粉、普魯蘭多糖及低聚糖的水解作用

采用TLC法檢測(cè)TK-PUL及突變體I500W分別水解低聚糖如麥芽糖、潘糖、麥芽三糖、異潘糖、普魯蘭多糖及可溶性淀粉（糖類分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖7）的水解產(chǎn)物，結(jié)果如圖8所示。TK-PUL及突變體I500W均不能水解麥芽糖和潘糖，兩者的最小作用底物均為麥芽三糖。并且根據(jù)TK-PUL及突變體I500W水解麥芽糖和潘糖所得的水解產(chǎn)物，可以推斷TK-PUL及其突變體I500W可水解麥芽三糖中α-1,4-糖苷鍵和異潘糖中α-1,6-糖苷鍵。在添加0.1 U酶以及90 ℃反應(yīng)1 h的條件下，TK-PUL及突變體I500W均將麥芽三糖完全水解為麥芽糖和葡萄糖。同樣的條件下，TK-PUL作用于異潘糖，將其大部分水解為麥芽糖和葡萄糖，殘留的異潘糖量較少；突變體I500W僅將小部分異潘糖水解為麥芽糖和葡萄糖，殘留的異潘糖量較多。以上結(jié)果表明，TK-PUL及其突變體I500W對(duì)麥芽三糖中α-1,4-糖苷鍵的水解效率基本一致；此外，與TKPUL相比，突變體I500W對(duì)異潘糖中α-1,6-糖苷鍵的水解效率較低。

另外，在添加1.5 U酶以及90 ℃反應(yīng)16 h的條件下，TK-PUL和突變體I500W可完全水解底物，并且作用于普魯蘭多糖或可溶性淀粉產(chǎn)生的產(chǎn)物類型基本一致。但是突變體I500W作用于普魯蘭多糖或可溶性淀粉產(chǎn)生的產(chǎn)物中高分子質(zhì)量糖的含量更高。這表明突變體I500W相對(duì)于TK-PUL作用于普魯蘭多糖或可溶性淀粉的催化效率更低。

圖7 糖類的分子結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 7 Schematic structures of sugars

圖8 酶解產(chǎn)物的TLC分析Fig. 8 TLC analysis of the enzymatic hydrolysates

表3 TK-PUL及突變體I500W的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Table 3 Kinetic parameters of TK-PUL and the mutant I500W

測(cè)定并比較了TK-PUL及突變體I500W于100 ℃以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物時(shí)的比活力和動(dòng)力學(xué)常數(shù)，以此確定TK-PUL中I500W位點(diǎn)變化對(duì)其底物結(jié)合能力和底物降解能力的影響。由表3可知，與TK-PUL相比，突變體I500W以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物的Km值基本不變，kcat值均明顯降低。其中以可溶性淀粉為底物時(shí)，突變體I500W的kcat/Km值約為TK-PUL的87.05%；以普魯蘭多糖為底物時(shí)，突變體I500W的kcat/Km值約為TK-PUL的77.82%。這些結(jié)果表明，TK-PUL中I500W位點(diǎn)變化不影響其對(duì)可溶性淀粉或普魯蘭多糖的底物結(jié)合能力，但導(dǎo)致其對(duì)可溶性淀粉或普魯蘭多糖的水解活性降低。另外，本研究分別以麥芽三糖和異潘糖為底物測(cè)定并比較了TK-PUL及突變體I500W的α-1,4-糖苷鍵水解活性和α-1,6-糖苷鍵水解活性。如表3所示，與TK-PUL相比，突變體I500W以麥芽三糖和異潘糖為底物的Km值基本不變，即突變體I500W對(duì)麥芽三糖和異潘糖的結(jié)合能力基本不變；以麥芽三糖為底物的kcat值基本不變；以異潘糖為底物的kcat值明顯降低，kcat/Km值約為TK-PUL的64.78%。這些結(jié)果表明，TK-PUL中I500W位點(diǎn)變化不影響其α-1,4-糖苷鍵水解活性，但使其α-1,6-糖苷鍵水解活性明顯降低。

以上研究結(jié)果表明，TK-PUL中I500W位點(diǎn)變化不影響TK-PUL對(duì)可溶性淀粉、普魯蘭多糖、麥芽三糖和異潘糖的底物結(jié)合能力，但導(dǎo)致其對(duì)可溶性淀粉、普魯蘭多糖、異潘糖的水解能力明顯降低。TK-PUL中I500W位點(diǎn)變化可能通過(guò)降低其α-1,6-糖苷鍵水解活性，降低其對(duì)可溶性淀粉、普魯蘭多糖以及異潘糖的水解效率。

2.5 突變位點(diǎn)分析與分子結(jié)構(gòu)模擬

圖9 TK-PUL（A）和突變體I500W（B）的三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬圖Fig. 9 Three-dimensional modelling of TK-PUL (A) and the mutant I500W (B)

以TK-PUL（PDB ID：5OT1）的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)為模板，采用SWISS-MODEL同源模建突變體I500W的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)。采用三維圖像軟件PyMOL v0.99顯示TKPUL及突變體I500W的三級(jí)結(jié)構(gòu)。由于蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，單個(gè)氨基酸的突變不會(huì)引起蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)的明顯改變，所以突變體I500W與TKPUL的三級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致（圖9A1、B1）。TK-PUL中第500位氨基酸殘基Ile位于其催化結(jié)構(gòu)域的βM5片層結(jié)構(gòu)上，將Ile替換為Trp未明顯引起βM5片層結(jié)構(gòu)的構(gòu)象位移變化（圖9A2、B2）。已有研究結(jié)果表明，淀粉水解酶保守基序中氨基酸殘基的分子構(gòu)象大小以及側(cè)鏈性質(zhì)影響酶分子水解糖苷鍵的活性和特異性[33]。Ito等[34]研究發(fā)現(xiàn)，I型普魯蘭多糖水解酶TVA II的保守基序II中第326位氨基酸殘基的分子構(gòu)象大小及側(cè)鏈的性質(zhì)影響其水解糖苷鍵的特異性。將Vla326突變?yōu)榉肿訕?gòu)象更小的Ala，突變體V326A更傾向于水解α-1,4-糖苷鍵；將Vla326突變?yōu)榉肿訕?gòu)象更大的Ile，突變體V326I更傾向于水解α-1,6-糖苷鍵。本研究將TK-PUL的保守基序II中I500突變?yōu)榉肿訕?gòu)象更大的Trp，突變體I500W的α-1,4-糖苷鍵水解活性基本不變，其α-1,6-糖苷鍵水解活性明顯降低。另外，在與TK-PUL序列相似性較高且僅作用底物中α-1,4-糖苷鍵的淀粉水解酶中，與TK-PUL中I500對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基為W。根據(jù)以上研究結(jié)果可以推斷：在該氨基酸位點(diǎn)，氨基酸殘基為Trp使得酶分子傾向于水解α-1,4-糖苷鍵；氨基酸殘基為Ile則使得酶分子傾向于水解α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵。即TK-PUL保守基序II中第500位氨基酸殘基對(duì)其水解糖苷鍵的特異性起到關(guān)鍵作用，第500位氨基酸殘基側(cè)鏈大小可影響其催化糖苷鍵的特異性。

3 結(jié) 論

對(duì)III型普魯蘭多糖水解酶TK-PUL保守基序中非保守氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，通過(guò)比較TK-PUL與突變體的酶學(xué)性質(zhì)，確定保守基序中關(guān)鍵氨基酸殘基對(duì)其催化性質(zhì)的影響。其中TK-PUL保守基序II中第500位氨基酸殘基Ile對(duì)其水解糖苷鍵的偏好性起到關(guān)鍵作用。第500位氨基酸殘基為Trp使得酶分子傾向于水解α-1,4-糖苷鍵；第500位氨基酸殘基為Ile則使得酶分子傾向于水解α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵。根據(jù)前人研究結(jié)論以及本研究結(jié)果，初步推斷TK-PUL保守基序II中第500位氨基酸殘基側(cè)鏈大小可影響其催化糖苷鍵的特異性。本研究結(jié)果表明TK-PUL保守基序II中第500位氨基酸殘基可作為其酶學(xué)特性改造的靶點(diǎn)。研究有利于深入了解TK-PUL的雙功能催化機(jī)制，也可以為TK-PUL的分子改造提供理論依據(jù)和設(shè)計(jì)思路。