胡涵翠，李加興，鄭建仙,*

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640；2.湖南省井礦鹽工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410004）

甜味是基本味覺之一，人對糖類存在一種本能的甜味偏好行為，適當?shù)奶鹞洞碳つ軒碛鋹偢衃1]。除用作甜味劑外，糖類還具有防腐增色、黏結(jié)定型、潤滑口感、改善質(zhì)地、降低凝固點等諸多作用[2]。為滿足上述有益特性及必要的營養(yǎng)需求，糖類在一些食品中的添加量往往會偏高，容易造成令人不喜的甜膩口感，如抗疲勞運動飲料及月餅等傳統(tǒng)小吃[3-4]。

甜味抑制劑是一類能解決食品口感過甜問題的天然或人工合成化合物，通過與舌頭味蕾細胞上的甜味受體結(jié)合，以降低甜味受體對甜味物質(zhì)的感應程度[5-7]。森林匙羹藤酸等植物來源性甜味抑制劑的提取工藝復雜，甜味抑制效果弱，實用價值較低[8]。2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸（2-(4-methoxyphenoxy) propionic acid，HPMP）是一種高效甜味抑制劑，最初從咖啡豆中提取得到，目前已經(jīng)通過化學合成實現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)，廣泛應用于月餅、糖果、巧克力等高糖食品中[9-11]。據(jù)報道，HPMP苯環(huán)的疏水性對其甜味抑制活性有積極影響[12]。與HPMP化學結(jié)構(gòu)相似的2-(2,4-二氯苯氧基)丙酸，也含有2-苯氧基丙酸骨架，其甜味抑制效力比HPMP高約10 倍，可能是因為鄰位氯原子增強了其與甜味受體的疏水相互作用[13-14]。因此，可以嘗試在HPMP苯環(huán)上引入不同的鹵原子，以探究鹵素取代對HPMP甜味抑制特性的影響。

甜味的準確測定對化合物的甜味抑制效果評價具有重要意義。目前最常用的甜味評價方法主要是感官評價法和電子舌分析法。感官評價法簡單迅速，但受主觀因素影響較大，易出現(xiàn)味覺疲勞。電子舌是一種智能味覺分析技術(shù)，能有效模擬人類味覺評估過程，具有高靈敏度、準確快捷、樣品無需預處理等優(yōu)點，對安全性未知的樣品也可適用，在食品、制藥等領(lǐng)域應用較多[15-16]。鞏效偉等[17]將電子舌響應值與感官評價結(jié)果進行關(guān)聯(lián)分析，建立了客觀可靠的電子煙甜度評價方法。鄧雯婷等[18]證明了電子舌是一種可用于甜味抑制效果評價的有效工具。

本研究通過鹵素（F、Cl、Br）取代HPMP苯環(huán)的2位或3位的氫原子，設計合成6種HPMP鹵代衍生物，并通過核磁共振、紅外光譜、高分辨質(zhì)譜等手段進行結(jié)構(gòu)表征。采用電子舌進行甜味抑制效果評價，考察6種鹵代衍生物對蔗糖等多種甜味劑的甜味抑制作用，分析其自身呈味及對甜味劑其他風味的影響，以期為甜味抑制化合物的構(gòu)效關(guān)系研究提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔗糖 太古糖業(yè)（中國）有限公司；果糖、葡萄糖、木糖醇、赤蘚糖醇 浙江一諾生物科技有限公司；以上甜味劑均為食品級。

2-氟-4-甲氧基苯酚、3-氯-4-甲氧基苯酚 珠海奧博凱生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；3-氟-4-甲氧基苯酚上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司；3-溴-4-甲氧基苯酚、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇（色譜純） 薩恩化學技術(shù)（上海）有限公司；2-溴丙酸乙酯 上海麥克林生化科技有限公司；2-氯-4-甲氧基苯酚、2-溴-4-甲氧基苯酚、氫氧化鈉、碳酸鉀、溴化鉀 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇、硫酸、乙酸乙酯 廣州化學試劑廠；除甲醇外，以上試劑均為分析純。氘代氯仿（純度≥99.8%） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

VERTEX 33傅里葉變換紅外光譜儀、AVANCE III HD 600M超導核磁共振波譜儀、maXis impact高分辨質(zhì)譜儀 德國Bruker公司；SA402B味覺分析系統(tǒng) 日本Insent公司。

1.3 方法

1.3.1 HPMP鹵代衍生物的合成

參照Williams等[19]的方法并稍作修改。稱取15 mmol相應鹵素（F、Cl、Br）取代苯酚、18.8 mmol碳酸鉀，溶于25 mLN,N-二甲基甲酰胺，隨后加入18.8 mmol 2-溴丙酸乙酯，80 ℃回流攪拌反應13 h。反應結(jié)束后，過濾得濾液，加入適量蒸餾水稀釋，然后用乙酸乙酯萃取，收集有機層，50～55 ℃下減壓旋蒸。將所得油狀液體溶于25 mL乙醇中，加入12 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液，85 ℃下回流反應4 h，減壓旋蒸除去乙醇。所得殘留物溶于蒸餾水中，滴加3 mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié)至pH 1～2，低溫靜置，待晶體析出，抽濾后得到粗產(chǎn)物。對粗產(chǎn)物進行重結(jié)晶，分離結(jié)晶，于50～55 ℃干燥，得到HPMP鹵代衍生物，按下式計算產(chǎn)率：

式中：m為實際產(chǎn)量；m0為理論產(chǎn)量。

1.3.2 HPMP鹵代衍生物的結(jié)構(gòu)表征

1.3.2.1 紅外光譜分析

稱量5 mg待測樣品，采用溴化鉀壓片法，在4 000～500 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進行傅里葉變換紅外光譜掃描。

1.3.2.2 核磁共振波譜分析

稱量25 mg待測樣品，溶于0.6 mL氘代氯仿，以四甲基硅烷為內(nèi)標，在室溫條件下采集1H-NMR、13C-NMR譜，共振頻率分別為600、151 MHz。

1.3.2.3 高分辨質(zhì)譜分析

稱量5 mg待測樣品，經(jīng)甲醇溶解，過0.22 μm濾膜過濾，采用正離子模式進行測試。電噴霧離子源；噴霧器壓力0.6 bar；干燥氣流速4.0 L/min；干燥氣溫度180 ℃；毛細管電壓3 500 V；掃描范圍m/z50～600。

1.3.3 電子舌的味覺測定

SA402B電子舌屬于電位型電子舌，采用類脂薄膜作為味覺傳感器，當其受到味覺物質(zhì)刺激，類脂膜一側(cè)的膜電位發(fā)生變化，并轉(zhuǎn)換為對應的人味覺信號，最后通過計算機輸出為量化味覺值[20-21]。測試前，所有味覺傳感器和陶瓷參比電極均需進行預活化：注入200 μL內(nèi)部液（3.33 mol/L KCl+飽和AgCl溶液）浸沒脂膜；GL1甜味傳感器浸于專用浸泡液中2 d，CA0酸味傳感器、C00苦味傳感器、AE1澀味傳感器、AAE鮮味傳感器、CT0咸味傳感器浸于參比溶液（30 mmol/L KCl+0.3 mmol/L酒石酸）中1 d；向參比電極注入內(nèi)部液至玻璃管頂端5 mm處，用3.33 mol/L KCl溶液浸泡1 d。單獨測定甜味指標，每個樣品重復測定5次；同時測定其他味覺指標，每個樣品重復測定4次。

1.3.4 甜味抑制效果的評價

1.3.4.1 HPMP鹵代衍生物對不同質(zhì)量濃度的蔗糖溶液甜味的影響

分別配制質(zhì)量濃度4.5、22.5、40 g/100 mL蔗糖溶液，設為低、中、高質(zhì)量濃度組，然后向每組分別添加質(zhì)量濃度為200 mg/L的6種鹵代衍生物，使用電子舌進行甜味測定并計算甜味抑制率。

1.3.4.2 不同質(zhì)量濃度的HPMP鹵代衍生物對蔗糖溶液甜味的影響

配制質(zhì)量濃度13.5 g/100 mL蔗糖溶液若干份，分別添加質(zhì)量濃度50、100、150、200、300 mg/L的HPMP及其鹵代衍生物，使用電子舌進行甜味測定并計算甜味抑制率。

1.3.4.3 HPMP鹵代衍生物對不同甜味劑甜味的影響

配制質(zhì)量濃度13 g/100 mL果糖溶液、18.4 g/100 mL葡萄糖溶液、15 g/100 mL木糖醇溶液、15 g/100 mL赤蘚糖醇溶液，分別添加質(zhì)量濃度200 mg/L的HPMP及其鹵代衍生物，混勻后，使用電子舌進行甜味測定并計算甜味抑制率。

1.3.4.4 甜味抑制率的計算

式中：I0為甜味物質(zhì)自身的甜度值；I1為添加了甜味抑制化合物后的甜度值。

1.3.5 HPMP鹵代衍生物的自身呈味特征測定

配制質(zhì)量濃度為200 mg/L的HPMP及其鹵代衍生物，采用電子舌測定甜味、酸味、苦味、澀味、鮮味、咸味6種味覺指標。

1.3.6 HPMP鹵代衍生物對甜味劑其他味覺的影響

配制質(zhì)量濃度13.5 g/100 mL蔗糖溶液若干份，分別添加質(zhì)量濃度200 mg/L的HPMP及其鹵代衍生物，采用電子舌測定酸味、苦味、澀味、鮮味、咸味5種味覺指標。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 HPMP鹵代衍生物的合成及結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 HPMP鹵代衍生物的產(chǎn)率

由表1可知，共得到6種HPMP鹵代衍生物，其中化合物2-F、3-F、3-Cl和3-Br是未經(jīng)文獻報道的新化合物。6種HPMP鹵代衍生物均呈白色晶體狀，產(chǎn)率偏低，在20%～46%之間，可用于后續(xù)結(jié)構(gòu)表征及甜味抑制作用研究。

表1 6種HPMP鹵代衍生物的基本信息Table 1 Basic information of six halogenated derivatives of HPMP

2.1.2 HPMP鹵代衍生物的紅外光譜分析

如圖1所示，由于具有共同的骨架結(jié)構(gòu)，6種HPMP鹵代衍生物的紅外光譜相似度較高：在3 300～2 500 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)均有一個明顯的寬峰，主要是羧基中O—H和苯環(huán)C—H的伸縮振動吸收峰疊加所致；1 730 cm-1波數(shù)處為羧基中C＝O的強吸收峰；1 220、1 050 cm-1波數(shù)處的吸收峰由Ar—O—C的伸縮振動引起；1 600～1 400 cm-1波數(shù)處為苯環(huán)骨架的振動吸收峰；850～750 cm-1波數(shù)處為苯環(huán)三取代產(chǎn)生的特征峰[22]。因此可以表明，6種HPMP鹵代衍生物中均存在—COOH、Ar—O—C結(jié)構(gòu)，且為三取代苯環(huán)。

圖1 6種HPMP鹵代衍生物的紅外光譜Fig. 1 Infrared spectra of six halogenated derivatives of HPMP

2.1.3 HPMP鹵代衍生物的核磁共振分析

通過核磁共振氫譜、碳譜測試，可以確認6種HPMP鹵代衍生物均取得了預期結(jié)構(gòu)。經(jīng)1H NMR確認，6種化合物均含有10個氫原子，比理論值少1個，這是因為羧基氫與溶劑中的活潑氫快速交換，不易出峰。苯環(huán)上3個H的化學位移在δ6.58～7.16之間，δ4.68～4.70為與羧基相連的—CH，δ3.76～3.85為甲氧基的—CH3，δ1.64～1.69為與—CH相連的—CH3[23]。13C NMR中，6種HPMP鹵代衍生物均含有10種處于不同化學環(huán)境中的碳原子，且化學位移值與理論值基本相符。其中，化合物2-F和3-F中由于受到氟原子的強烈作用，與其相連的碳原子被裂分成兩重峰[24]。

2.1.4 HPMP鹵代衍生物的高分辨質(zhì)譜分析

如表2所示，離子峰[M+Na]+的計算值與實測值之間的誤差均不超過5×10-6，進一步證實6種HPMP鹵代衍生物的化學結(jié)構(gòu)。

表2 6種HPMP鹵代衍生物的質(zhì)譜結(jié)果Table 2 Mass spectrometric results of six halogenated derivatives of HPMP

2.2 HPMP鹵代衍生物對蔗糖甜味的影響

2.2.1 HPMP鹵代衍生物對不同質(zhì)量濃度蔗糖溶液的甜味抑制作用

如圖2所示，不同質(zhì)量濃度的蔗糖溶液中，6種鹵代衍生物均能減弱電子舌對蔗糖溶液的甜味響應，這在一定程度上反映了鹵素取代對HPMP改良蔗糖甜味的重要性。隨著蔗糖溶液的質(zhì)量濃度升高，6種HPMP鹵代衍生物的甜味抑制率均呈現(xiàn)出極顯著下降（P＜0.01）的趨勢，說明HPMP鹵代衍生物可能是通過競爭性抑制減少甜味物質(zhì)帶來的甜味刺激，這與HPMP的甜味抑制機制保持一致[25-26]。此外，各蔗糖質(zhì)量濃度組中衍生物的甜味抑制率均有：氟取代衍生物＞氯取代衍生物＞溴取代衍生物。由此可知，鹵素取代基的種類對HPMP鹵代衍生物的甜味抑制作用具有明顯影響。鹵族元素（F、Cl、Br）隨原子序數(shù)升高，原子半徑依次增加，電負性也相應地減弱。氟原子的電負性極大，原子半徑（0.64 ?）最小，C—F鍵鍵能較高，可在碳原子周圍形成緊密排列，從而產(chǎn)生較強的屏蔽效應[27]，這種特性可能使氟代衍生物表現(xiàn)出比氯代、溴代衍生物更為優(yōu)異的甜味抑制性能。因此，苯環(huán)上鹵素取代基的尺寸及電負性大小可能是造成甜味抑制效力差異的關(guān)鍵因素。

圖2 HPMP苯環(huán)的2位（A）、3位（B）上引入鹵素后對不同質(zhì)量濃度蔗糖溶液的甜味抑制率Fig. 2 Sweetness inhibitory effect of HPMP with halogens introduced at the 2-position (A) or 3-position (B) of the benzene ring on different concentrations of sucrose solution

2.2.2 不同質(zhì)量濃度的HPMP鹵代衍生物對蔗糖溶液的甜味抑制作用

如圖3所示，蔗糖溶液質(zhì)量濃度相同時，HPMP及其鹵代衍生物的甜味抑制率均隨添加質(zhì)量濃度的增加而逐漸升高。說明甜味抑制化合物的添加質(zhì)量濃度對其甜味抑制作用的發(fā)揮具有重要影響，進一步驗證了HPMP鹵代衍生物對甜味的抑制作用類型為競爭性抑制。圖3B中，3-F的甜味抑制效果稍優(yōu)于2-F；質(zhì)量濃度為50、150 mg/L時3-F、2-F的甜味抑制率稍低于HPMP；質(zhì)量濃度為200 mg/L時，甜味抑制率：3-F＞2-F＞HPMP；以100、300 mg/L質(zhì)量濃度添加時，甜味抑制率：3-F＞HPMP＞2-F。圖3C中，質(zhì)量濃度為50 mg/L時，甜味抑制率：3-Cl＞HPMP＞2-Cl；質(zhì)量濃度達到100 mg/L后，甜味抑制率：HPMP＞2-Cl＞3-Cl。圖3D中，3-Br、2-Br的甜味抑制效果無明顯比較優(yōu)勢，均弱于HPMP。由此可知，在HPMP苯環(huán)的2位或3位上進行鹵素修飾，對其甜味抑制作用的影響各不相同。這表明，不同取代位置對鹵代衍生物的甜味抑制作用并未表現(xiàn)出明顯的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢。

圖3 不同質(zhì)量濃度的HPMP（A）及其鹵代衍生物（B～D）對蔗糖溶液的甜味抑制率Fig. 3 Sweetness inhibitory effect of HPMP (A) and its halogenated derivatives (B-D) at different mass concentrations on sucrose solution

對HPMP鹵代衍生物進行線性回歸分析，結(jié)果如表3所示，除化合物3-Br外，其余5種鹵代衍生物的甜味抑制率與添加質(zhì)量濃度均存在良好的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)均大于0.91。從鹵素取代位置來看，相關(guān)系數(shù)的大小為：2-F＞3-F、2-Br＞3-Br、2-Cl與3-Cl接近。由此可知，在苯環(huán)的2位上引入鹵素取代基的HPMP衍生物具有明顯的效量關(guān)系。

表3 HPMP鹵代衍生物的線性回歸方程Table 3 Dose-effect relationship of halogenated derivatives of HPMP against sweetness

2.3 HPMP鹵代衍生物對不同甜味劑甜味的影響

甜味受體由T1R2-T1R3異源二聚體組成，具有較低的特異性，可與多種甜味物質(zhì)結(jié)合，進而產(chǎn)生甜味[28-29]。果糖和葡萄糖可為機體生命活動提供能量，是除蔗糖外較常見的營養(yǎng)型甜味劑[30]。木糖醇和赤蘚糖醇是較常見的非營養(yǎng)型甜味劑，在市面上眾多無糖食品中均有應用[31]。如圖4所示，HPMP鹵代衍生物對4種甜味劑均可表現(xiàn)出一定的甜味抑制作用，且抑制程度為：氟取代衍生物＞氯取代衍生物＞溴取代衍生物。

圖4A中，HPMP及其鹵代衍生物對葡萄糖的甜味抑制效果差異顯著（P＜0.05），其甜味抑制率：3-F＞HPMP＞2-F＞2-Cl＞3-Cl＞2-Br＞3-Br；對果糖的甜味抑制率則有：3-F＞HPMP＞2-F＞3-Cl＞2-Cl＞3-Br＞2-Br。圖4B中，3-F、2-F對木糖醇和赤蘚糖醇甜味的抑制效果均優(yōu)于HPMP，2-Cl、3-Cl的甜味抑制效果均與HPMP接近，兩種溴代衍生物的甜味抑制率最低，且3-Br＞2-Br。上述結(jié)果表明，HPMP鹵代衍生物的甜味抑制作用范圍較為廣泛，既能不同程度地減弱營養(yǎng)型甜味劑的甜味，又能抑制非營養(yǎng)型甜味劑的甜味表現(xiàn)。甜味抑制效果也與鹵素取代基的種類有關(guān)，具有較強電負性的氟、氯取代基能較好地阻止甜味分子與甜味受體結(jié)合。同樣地，在苯環(huán)2位或3位上的鹵素取代，均未表現(xiàn)出明顯的取代位置優(yōu)勢。由于電子舌對不同類型甜味劑的甜味響應不同[32]，無法直接比較對不同甜味劑的甜味抑制作用。

圖4 HPMP及其鹵代衍生物對營養(yǎng)型（A）和非營養(yǎng)型（B）甜味劑的甜味抑制率Fig. 4 Sweetness inhibitory effect of HPMP and its halogenated derivatives on nutritive (A) and non-nutritive (B) sweeteners

2.4 HPMP鹵代衍生物的其他味覺分析

2.4.1 HPMP鹵代衍生物的自身呈味特征分析

如圖5所示，HPMP及其鹵代衍生物均以酸味、苦味、澀味為主，鮮味、咸味微弱，幾乎無甜味。與HPMP相比，6種鹵代衍生物的酸味均有所減弱，氟、氯、溴代衍生物的酸味值依次減??；苦味表現(xiàn)則相反，依次為：HPMP＜氟取代衍生物＜氯取代衍生物＜溴取代衍生物，苦味回味強度也呈現(xiàn)出相同規(guī)律；HPMP及其鹵代衍生物的澀味值則較為接近。說明鹵素取代基在HPMP苯環(huán)上的引入，會使苦味強度不同程度地提高，這可能與疏水性增強有關(guān)系[33]，但對酸味有一定的改善作用。

圖5 HPMP及其鹵代衍生物基于電子舌的雷達分析圖Fig. 5 Radar map of electronic tongue data for HPMP and its halogenated derivatives

2.4.2 HPMP鹵代衍生物對甜味劑其他味覺的影響

以蔗糖為例，進一步研究HPMP及其鹵代衍生物對甜味劑其他味覺的影響。如圖6所示，添加甜味抑制化合物后，蔗糖溶液的酸味、苦澀味均明顯增強，鮮味得到抑制，咸味無明顯變化。有研究顯示，HPMP可能會給食品原有風味帶來異味刺激，如引入或加重苦澀味[34]。與HPMP相比，6種鹵代衍生物對蔗糖溶液的苦味增強作用出現(xiàn)不同程度地提高，澀味影響差別不大，酸味刺激則更小，這種特性使其可能更適用于有抑甜增苦需求的食品，如巧克力產(chǎn)品，既能消除甜膩口感又可以突出其獨特的苦味口感。

圖6 含有HPMP及其鹵代衍生物的蔗糖溶液的雷達分析圖Fig. 6 Radar map of sucrose solution containing HPMP and its halogenated derivatives

3 結(jié) 論

通過對HPMP苯環(huán)2位和3位的氫原子進行鹵素（F、Cl、Br）取代，得到6種HPMP鹵代衍生物，并采用1H NMR、13C NMR、紅外光譜、高分辨質(zhì)譜等手段進行結(jié)構(gòu)表征，其中化合物2-F、3-F、3-Cl和3-Br是未經(jīng)文獻報道的新化合物?；陔娮由鄬PMP及其鹵代衍生物進行甜味抑制效果評價，結(jié)果表明，HPMP鹵代衍生物可通過競爭性機制發(fā)揮甜味抑制作用，甜味抑制率隨蔗糖質(zhì)量濃度升高而極顯著下降；作用于同一質(zhì)量濃度蔗糖溶液時，6種HPMP鹵代衍生物的甜味抑制率隨添加質(zhì)量濃度增加而逐漸提高。HPMP鹵代衍生物的作用范圍較廣，對果糖、葡萄糖、木糖醇和赤蘚糖醇也有一定效果。對上述甜味劑的甜味抑制率均有：氟取代衍生物＞氯取代衍生物＞溴取代衍生物，說明不同種類鹵素取代基的尺寸及電負性大小可能是造成甜味抑制效果差異的關(guān)鍵因素。此外，在苯環(huán)的2位上引入鹵素的HPMP衍生物均具有明顯的量效關(guān)系。HPMP鹵代衍生物自身風味均以酸、苦、澀味為主，對蔗糖溶液的苦味加重程度相比于HPMP有所提高，但酸味刺激更小，可能更適用于有抑甜增苦需求的產(chǎn)品。本研究表明鹵素取代對HPMP的甜味抑制作用具有重要影響，可為甜味抑制化合物的構(gòu)效關(guān)系研究提供一定理論支持，為開發(fā)新型甜味抑制劑提供新的思路。