王海，葉燕銳，劉欣，王斌，潘力

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）

普魯蘭酶（Pullulanase，EC3.2.1.41）是α-淀粉酶家族 GH13中的一種脫支酶，最早由 Bender和Wallenfels發(fā)現(xiàn)并命名[1,2]。它能夠以內(nèi)切方式專一性地水解普魯蘭多糖、淀粉和糖原等多糖中的α-1,6糖苷鍵并形成直鏈淀粉[3]。在食品加工行業(yè)的大部分淀粉質(zhì)原料中，支鏈淀粉占總淀粉質(zhì)量約為70%～95%[4]。在支鏈淀粉中出現(xiàn)約每20～25個葡萄糖殘基中存在一個 α-1,6糖苷鍵，所以支鏈淀粉中約含有4%～5%的α-1,6-糖苷鍵[5]。支鏈的存在阻礙淀粉的分解，影響了淀粉的利用和產(chǎn)品的質(zhì)量，造成資源浪費(fèi)。普魯蘭酶能專一性地切斷支鏈淀粉中的 α-1,6-糖苷鍵，其轉(zhuǎn)化率可達(dá)100%[6]，因此普魯蘭酶在提高淀粉利用率、降低原料消耗及提高產(chǎn)品質(zhì)量方面有著相當(dāng)巨大的價值，在淀粉加工業(yè)中有良好的市場前景。

自從1966年Bender和Wallenfels通過產(chǎn)氣桿菌（Aeorbaetere aerogenes）發(fā)酵獲得普魯蘭酶以來[1,2]，各國的科研人員經(jīng)過廣泛深入研究，獲得了不同來源微生物的普魯蘭酶。迄今，已報道的有來自 Bacillus acidopullulyticus[7]、 Bacillus naganoensis[8,9]、Anoxybacillus sp. SK3-4[10]、Bacillus megaterium[11]、Thermus thermophilus HB27[12]以及 Bacillus subtilis 168[13]等微生物的普魯蘭酶基因，這些普魯蘭酶基因被克隆、測序并在大腸桿菌[7,9]、酵母[14]和枯草芽孢桿菌[8]中實現(xiàn)了異源表達(dá)。但是來源于這些微生物的普魯蘭酶大部分是沒有商業(yè)價值的，不具有很好的耐酸性和高溫耐受性，滿足工業(yè)需要條件的僅有 Bacillus acidopullulyticus和 Bacillus naganoensis等極少數(shù)菌株，而且目前普魯蘭酶的表達(dá)水平不高，表達(dá)量較高的是Wan Song等[8]報道的普魯蘭酶活性（24.5 U/mL），這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以工業(yè)化生產(chǎn)。在食品加工工業(yè)中，普魯蘭酶通常應(yīng)用于糖化發(fā)酵中，與糖化酶協(xié)同使用，所以只有具有與糖化酶相似的作用溫度和作用pH的普魯蘭酶，才能最大程度地實現(xiàn)淀粉質(zhì)原料的分解，大大開拓其市場。由于長野芽孢桿菌（Bacillus naganoensis）的普魯蘭酶具有很好的酸性pH和高溫耐受性，適宜于工業(yè)應(yīng)用條件，是目前所篩選到的最好的普魯蘭酶基因之一。近年來，通過基因工程手段表達(dá)并提高普魯蘭酶產(chǎn)量已經(jīng)成為普魯蘭酶基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的主要發(fā)展方向。

本研究從長野芽孢桿菌基因組中克隆普魯蘭酶基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pBE-pul。同時從枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的轉(zhuǎn)錄組中選取高表達(dá)基因的啟動子，克隆到重組質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌B.subtilis ATCC6051?10中進(jìn)行分泌表達(dá)。進(jìn)一步嘗試刪除普魯蘭酶N-末端的108個氨基酸，得到普魯蘭酶突變體基因pul324，實現(xiàn)其在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體

本研究使用的菌株和質(zhì)粒如表1所示。

表1 菌株和載體Table 1 Strains and vectors

1.1.2 試劑和儀器

PrimeSTAR? HS DNA Polymerase（premix）、DNA Ladder Marker和T4 DNA連接酶等購于寶生物工程（大連）有限公司；限制性內(nèi)切酶以及Taq PCR Mix master購于Thermo Fisher Scientific；質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒和 PCR產(chǎn)物回收試劑盒均購于廣州美基（欣研）生物科技公司；普魯蘭酶標(biāo)準(zhǔn)品Pullulanase microbial和普魯蘭多糖均購于sigma公司；紅普魯蘭多糖購于上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；實驗中所用其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。梯度PCR儀Veriti? 96-Well Thermal Cycler， 美 國 Applied Biosystems公司；全自動凝膠成像儀 Gel Logic 212 PRO，美國Carestream Health公司；紫外可見分光光度計NanoDrop1000，美國Thermo Fisher公司；電轉(zhuǎn)化儀Eporator，德國Eppendorf公司；M200多功能酶標(biāo)儀，德國TECAN。

1.1.3 引物設(shè)計

本研究使用的引物如表2所示。

表2 引物序列表Table 2 List of primers

1.1.4 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基（W/V）：1% Tryptone，0.5% Yeast Extract，1% NaCl，121 ℃高壓滅菌 20 min；SOC 培養(yǎng)基（W/V）：2% Tryptone，0.5% Yeast Extract，0.05%NaCl，2.5 mM KCl，121 ℃高壓滅菌20 min，加入10 mM MgCl2和20 mM葡萄糖溶液；LBS培養(yǎng)基（W/V）：1% Tryptone，0.5% Yeast Extract，1% NaCl，0.5 M D-Sorbitol，121 ℃高壓滅菌 20 min；種子培養(yǎng)基（W/V）：1% Tryptone，0.5% Yeast Extract，1% NaCl，2% Glucose，115 ℃高壓滅菌 20 min；發(fā)酵培養(yǎng)基（W/V）：1% Tryptone，0.5% Yeast Extract，1% NaCl，2% Glucose，2% Starch soluble，115 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 普魯蘭酶重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)來源于Bacillus naganoensis ATCC 53909的普魯蘭酶基因pul，設(shè)計引物F-pul（Xho I）、R-pul-His（XbaI）和 F-Pul324（Xho I）（表 2），以 B. naganoensis ATCC 53909基因組為模板擴(kuò)增得到普魯蘭酶基因片段。用XhoI和XbaI雙酶切pBE表達(dá)載體和普魯蘭酶基因 pul，分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及膠回收。使用DNA Ligation Kit的T4 DNA Ligase將普魯蘭酶基因片段連接到載體pBE上，連接液轉(zhuǎn)化至E.coli stellar感受態(tài)細(xì)胞中，加入SOC培養(yǎng)基復(fù)蘇1 h后將復(fù)蘇液涂布在含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子單菌落進(jìn)行驗證篩選，即可得到含有普魯蘭酶重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。普魯蘭酶重組質(zhì)粒經(jīng)過測序驗證。

以B. subtilis 168基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到啟動子P43、PspovG、Phag、PywzA、Pveg、PaprE、PamyE、PfusA、PgapA、Ppgk、Ptsf、PnprB、PnprE、PyqfD片段，以Bacillus licheniformis基因組為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增得到啟動子 PamyL和 PglvA片段，以Bacillus amyloliquefaciens基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到啟動子PsigW片段，然后再分別對啟動子片段和普魯蘭酶重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和SpeI雙酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并膠回收。使用 DNA Ligation Kit的T4 DNA Ligase將各個啟動子片段分別連接到普魯蘭酶重組質(zhì)粒上，連接液轉(zhuǎn)化至 E.coli stellar感受態(tài)細(xì)胞中，加入SOC培養(yǎng)基復(fù)蘇1 h后將復(fù)蘇液涂布在含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子單菌落進(jìn)行驗證篩選，即可得到含有各個啟動子的普魯蘭酶表達(dá)質(zhì)粒。以上構(gòu)建的質(zhì)粒均經(jīng)過測序驗證。

1.2.2 重組普魯蘭酶在 Bacillus subtilis ATCC6051?10中的表達(dá)

將上述測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化于 B.subtilis ATCC6051?10感受態(tài)細(xì)胞，加入890 μL的LBS培養(yǎng)基復(fù)蘇5～6 h后將復(fù)蘇液涂布在含20 μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗證篩選，即可得到普魯蘭酶重組表達(dá)菌株 pBE101（P43），pBE102（PamyL），pBE103（PglvA），pBE104（PsigW），pBE105（PspovG），pBE106（Phag），pBE107（PywzA），pBE108（Pveg），pBE109（PfusA），pBE110（PgapA），pBE111（Ppgk），pBE112（Ptsf），pBE113（PaprE），pBE114（PamyE），pBE115（PnprB），pBE116（PnprE），pBE117（PyqfD）。

長程腦電圖和Glasgow昏迷量表評分對重癥腦功能損傷患者預(yù)后的預(yù)測價值 ……………………………………………………………… 蔣穎，毛可適，岳春賢，等 257

取 20 μL活化的重組菌株接種于 1 mL含 20 μg/mL硫酸卡那霉素的種子培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床以200 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24 h。然后將種子液以1%的接種量（V/V）轉(zhuǎn)接至2 mL含20 μg/mL硫酸卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，每個菌株重復(fù)發(fā)酵三次。置于37 ℃搖床以200 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)48 h后取樣，在4 ℃冷凍離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速10000 r/min離心4 min獲取發(fā)酵上清液，發(fā)酵上清液用于進(jìn)一步的實驗研究。

1.2.3 重組普魯蘭酶的酶活性檢測

根據(jù)降解Red-Pullulan的能力來確定普魯蘭酶的活性。普魯蘭酶酶活的測定參考Jinho Kang[15]的DNS方法和Megazyme公司Red-Pullulan使用說明書，并以諾維信公司市售普魯蘭酶作為標(biāo)準(zhǔn)品，測定方法如下：取適當(dāng)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)普魯蘭酶酶液100 μL，加入300 μL以pH 4.75的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制的1.0%的Red-Pullulane為底物，充分混勻后置于60 ℃水浴鍋中孵育30 min。立即加入1 mL無水乙醇，振蕩混勻后靜置5 min，以5000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，在M200多功能酶標(biāo)儀中以波長510 nm測定出反應(yīng)液的吸光度值。普魯蘭酶酶活測定時，以Bacillus subtilis ATCC6051?10野生菌發(fā)酵上清液作為空白對照。每管樣品重復(fù)檢測三次。根據(jù)所檢測OD510nm值和與酶活力之間的線性關(guān)系即可計算得到發(fā)酵液酶活。普魯蘭酶酶活單位定義：在相應(yīng)條件下，每分鐘分解普魯蘭所釋放的還原糖，其還原力相當(dāng)于1 μmol葡萄糖所需的酶量，以1 U表示。

1.2.4 普魯蘭酶突變體重組表達(dá)菌株的構(gòu)建

在利用PCR方法缺失普魯蘭酶前面108個氨基酸得到普魯蘭酶突變體pul324，克隆到上一步研究中篩選到的強(qiáng)啟動子 PspovG載體上，構(gòu)建菌株 pBE202（PspovG-pul324），進(jìn)行分泌表達(dá)。

1.2.5 搖瓶發(fā)酵

選取野生菌B.subtilis ATCC6051?10，普魯蘭酶重組高表達(dá)菌株 pBE105（PspovG）和 pBE202（PspovG-pul324）進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。分別接種20 μL保種菌液于24孔板中，每個孔加入3 mL含有20 μg/mL硫酸卡那霉素的種子培養(yǎng)基，置于37 ℃搖床200 r/min培養(yǎng)至24 h；檢測各個菌株的生物量OD600nm，并以等生物量（約為1%的接種量）接種適量菌液至50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵；每隔12 h取樣500 μL檢測其生物量和上清液酶活，直至72 h。每個菌株重復(fù)發(fā)酵三瓶。

在4 ℃低溫離心機(jī)中離心收集發(fā)酵上清液，然后通過0.45 μm超濾膜抽濾獲取發(fā)酵蛋白樣品液。隨后利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)和5 mL HisTrapTM FF crude預(yù)裝柱純化處理后的蛋白樣品液，結(jié)果表明在 20%Buffer B條件下洗脫時出現(xiàn)目的蛋白峰，收集此時的洗脫液。然后，分別取40 μL發(fā)酵蛋白樣品液和純化洗脫液，向其中加入 10 μL 5×SDS-PAGE Loading Buffer，渦旋振蕩混勻，沸水浴中加熱處理5 min使蛋白變性。使用5%的濃縮膠，12%的分離膠進(jìn)行發(fā)酵液蛋白分離，然后在考馬斯亮藍(lán)R-250染液中染色，再經(jīng)過脫色處理后顯示蛋白條帶。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)檢測均重復(fù)三次或以上，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 普魯蘭酶重組質(zhì)粒的構(gòu)建

圖1 B.subtilis ATCC6051?10中含不同啟動子的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of expression plasmids for B. subtilis ATCC6051?10 with different promoters

圖2 普魯蘭酶基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Electrophoresis image of pullulanase gene PCR

從長野芽孢桿菌基因組中擴(kuò)增出來的普魯蘭酶基因片段電泳圖如圖2所示。通過PCR方法，成功擴(kuò)增得到普魯蘭酶基因片段pul，大小為2799 bp，大小與預(yù)期的相一致（圖2）。再以限制性內(nèi)切酶XhoI和XbaI對載體pBE-SPamyQ和片段pul分別進(jìn)行雙酶切，連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌stellar感受細(xì)胞中。挑取單菌落鑒定后送至公司測序，測序結(jié)果顯示普魯蘭酶基因片段成功連接到表達(dá)載體上，成功構(gòu)建質(zhì)粒pBE-SPamyQ-Pul。

圖3 不同啟動子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR products of different promoters

分別從枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌基因組中擴(kuò)增出來的啟動子片段電泳圖如圖 3所示。通過PCR方法，成功擴(kuò)增得到17種啟動子片段，大小與預(yù)期的相一致（圖3）。再以限制性內(nèi)切酶EcoRI和SpeI對載體pBE-SPamyQ-pul和啟動子片段分別進(jìn)行雙酶切，連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌stellar感受細(xì)胞中。挑取單菌落鑒定后送至公司測序，測序結(jié)果顯示啟動子片段成功連接到表達(dá)載體上，成功構(gòu)建質(zhì)粒pBE-Promoter-SPamyQ-pul。

2.2 不同啟動子對普魯蘭酶重組菌株表達(dá)水平的影響

通過檢測含不同啟動子的普魯蘭酶重組表達(dá)菌株發(fā)酵液中的普魯蘭酶酶活發(fā)現(xiàn)，不同的啟動子介導(dǎo)的普魯蘭酶的表達(dá)水平差異較大，其中啟動子 P43和PspovG介導(dǎo)的普魯蘭酶的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他啟動子（圖4），在24孔板中培養(yǎng)發(fā)酵48 h后普魯蘭酶酶活分別為81.29 U/mL和86.67 U/mL，含有啟動子PspovG的重組普魯蘭酶表達(dá)菌株所顯示的普魯蘭酶酶活比含有傳統(tǒng)強(qiáng)啟動子P43的重組菌株更高。所以，選用啟動子PspovG進(jìn)行下一步實驗。

圖4 重組菌株的普魯蘭酶酶活性分析Fig.4 Pullulanase activity analysis of recombinant strains

2.3 普魯蘭酶高表達(dá)菌株搖瓶發(fā)酵

圖5 重組菌株表達(dá)產(chǎn)物的普魯蘭酶酶活性分析及菌株生長曲線Fig.5 Pullulanase activity analysis and growth curve of recombinant strains

對于上述篩選出來普魯蘭酶活性最高的啟動子PspovG，成功構(gòu)建質(zhì)粒pBE105（PspovG）和pBE202（PspovG-pul324）。對這兩個質(zhì)粒所在菌株進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)，測定不同時間點(diǎn)的各菌株普魯蘭酶活性變化情況（圖5a）及菌株的生長情況（圖5b）。普魯蘭酶酶活曲線表明，菌株 B.subtilis ATCC6051?10/pBE105（PspovG）的發(fā)酵上清液中普魯蘭酶活性隨著發(fā)酵時間的延長，酶活性持續(xù)升高，并在48 h達(dá)到相對穩(wěn)定期，發(fā)酵72 h時酶活達(dá)到389.85 U/mL；而B.subtilis ATCC6051?10/pBE202（PspovG-pul324）菌株發(fā)酵36 h達(dá)到相對穩(wěn)定期，隨著時間的增長，酶活力增長平緩，發(fā)酵72 h時酶活達(dá)到260.38 U/mL。同時重組菌株生長曲線表明，發(fā)酵菌株 B.subtilis ATCC6051?10/pBE105（PspovG ） 和 B.subtilis ATCC6051?10/pBE202（PspovG-pul324）均在36 h時生物量達(dá)到最高值，隨著時間的延長，菌株B.subtilis ATCC6051?10/pBE202（PspovG-pul324）生物量趨于平 緩 ， 而 菌 株 B.subtilis ATCC6051?10/pBE202（PspovG-pul324）生物量迅速下降，說明不同是重組質(zhì)粒對宿主菌的生長影響差異較大。由圖5展示的兩株普魯蘭酶重組菌株的產(chǎn)酶曲線和生長曲線，可以明顯發(fā)現(xiàn)菌株 pBE105（PspovG）更適用于工業(yè)生產(chǎn)。首先，在相同的表達(dá)宿主菌中，由相同的啟動子介導(dǎo)表達(dá)，菌株pBE105（PspovG）發(fā)酵72 h后表達(dá)量比菌株 pBE202（PspovG-pul324）更高。其次，在菌體達(dá)到最高濃度時，菌株 pBE105（PspovG）的生長狀態(tài)更佳，隨著時間的延長，生物量可以保持相對穩(wěn)定，這為持續(xù)表達(dá)普魯蘭酶提供了保障，這在工業(yè)化發(fā)酵中具有巨大優(yōu)勢。

2.4 發(fā)酵液SDS-PAGE分析

圖6 重組菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of expression products of recombinant strains

SDS-PAGE鑒定結(jié)果表明，重組菌株 pBE105（PspovG）的發(fā)酵上清液及其純化液在100 ku附近有一條表達(dá)條帶，與普魯蘭酶理論大小一致，為普魯蘭酶蛋白，約為 100 ku；而重組菌株 pBE202（PspovG-pul324）的發(fā)酵上清液及其純化液在70～100 ku之間有一條表達(dá)條帶，與普魯蘭酶突變體理論大小一致，為普魯蘭酶突變體，約為90 ku。其中，重組菌株 pBE105（PspovG）的普魯蘭酶表達(dá)量比 pBE202（PspovG-pul324）的更高，條帶更粗，該結(jié)果與普魯蘭酶酶活性檢測結(jié)果一致。同時發(fā)酵液經(jīng)過純化后，效果顯著，說明重組菌株的普魯蘭酶表達(dá)為胞外分泌表達(dá)，純化步驟簡單快捷，效果好，非常適用于工業(yè)生產(chǎn)，為下游生產(chǎn)工藝提供了研究基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了 17種含有不同啟動子的普魯蘭酶重組質(zhì)粒，并對其重組菌株的表達(dá)產(chǎn)物分別進(jìn)行普魯蘭酶酶活性檢測，其中重組菌株 B.subtilis ATCC6051?10/pBE105（PspovG）的普魯蘭酶酶活性最高。接著，本研究又通過突變普魯蘭酶來進(jìn)行一步摸索提高普魯蘭酶表達(dá)量的方法，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBE202（PspovG-pul324）。但是實驗結(jié)果表明，在相同的載體和宿主菌中表達(dá)，普魯蘭酶突變體的表達(dá)量并沒有普魯蘭酶原基因的表達(dá)量高，重組菌株B.subtilis ATCC6051?10/pBE105（PspovG）發(fā)酵72 h后，最高普魯蘭酶酶活為389.85 U/mL。該酶活遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Wan Song等[8]報道的普魯蘭酶活性（24.5 U/mL），實現(xiàn)了普魯蘭酶在枯草芽孢桿菌中的高水平表達(dá)。本研究成功實現(xiàn)了普魯蘭酶在枯草芽孢桿菌中的高效分泌表達(dá)，為普魯蘭酶基因工程改造奠定了一定的基礎(chǔ)，同時推動普魯蘭酶的工業(yè)化生產(chǎn)。