霍雪萍，曹情雯，王海芳，趙向絨，王 晶，董 靜，馬運(yùn)峰

(1. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710061；2. 陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003；3. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中西醫(yī)結(jié)合心血管病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 712046；4. 陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安 710068；5. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 西安 712000)

動(dòng)脈粥樣硬化是一種以動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成為特征的血管慢性炎癥性疾病，血管衰老在其進(jìn)展中起著重要作用[1]。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的纖維帽變薄是導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定和斑塊破裂的重要原因，其中纖維帽中血管平滑肌細(xì)胞的活性和數(shù)量是維持纖維帽厚度和斑塊穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，血管平滑肌細(xì)胞衰老是導(dǎo)致斑塊破裂的重要機(jī)制[2]。衰老血管平滑肌細(xì)胞的增殖抑制、凋亡敏感性增加等特性導(dǎo)致修復(fù)破裂斑塊的能力減弱，同時(shí)衰老細(xì)胞可促進(jìn)炎性因子白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)等表達(dá)增加，產(chǎn)生促炎癥環(huán)境而進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞遷移,加速動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展，抑制斑塊修復(fù)[3]，因此抑制血管平滑肌細(xì)胞衰老有助于維持易損斑塊的穩(wěn)定性?；钛z囊由黃芪、紅花、赤芍、川芎等12味中藥組成，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、活血化瘀、理氣安神等功效。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，活血膠囊可縮小動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積, 減少斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和炎性因子表達(dá)，具有抗炎和增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性的作用[4-5]。課題組前期研究顯示，黃芪、紅花、赤芍中多種單體成分可抑制炎性反應(yīng)，同時(shí)還具有不同程度的抗氧化作用[6-8]。但活血膠囊對(duì)血管平滑肌細(xì)胞衰老是否有影響尚不明確。故本研究利用H2O2誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(mouse aortic smooth muscle cells，mASMC)發(fā)生衰老，研究活血膠囊對(duì)mASMC的抗衰老作用，以期為其藥理學(xué)作用提供直接的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)，為抗動(dòng)脈粥樣硬化中藥復(fù)方和活性成分的研究提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1材料 mASMC購(gòu)自上海諾晨生物技術(shù)有限公司?；钛z囊購(gòu)自西安大唐制藥集團(tuán)有限公司。H2O2購(gòu)自西安依科生物技術(shù)公司。細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Clontech公司，胰蛋白酶和雙抗(青霉素和鏈霉素)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所?？俁NA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄及熒光RT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、β-半乳糖苷酶染色試劑盒和細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，鼠ICAM-1、IL-8和IL-6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒均購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Napco公司)，Model 680型酶標(biāo)分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，倒置光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，熒光PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 取mASMC，加入含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化傳代，取4代以內(nèi)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2藥物溶液配制和細(xì)胞處理 稱取0.9 g活血膠囊顆粒，充分研磨，加入6 mL無(wú)血清培養(yǎng)基37 ℃水浴充分溶解，2 000 r/min離心5 min，吸取溶液層，0.22 m微孔濾膜過(guò)濾分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3細(xì)胞活力檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、活血膠囊150 μg/mL組、活血膠囊300 μg/mL組、活血膠囊750 μg/mL 組。將mASMC以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔細(xì)胞板中，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，其余各組加入相應(yīng)濃度活血膠囊溶液，培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，采用WST-1 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，于1.5 h在酶標(biāo)儀上讀取450 nm 處的吸光度值，計(jì)算各組細(xì)胞活力。相對(duì)細(xì)胞活力(實(shí)驗(yàn)組)=[OD(實(shí)驗(yàn)組)/OD(對(duì)照組)]×100%。

1.2.4細(xì)胞衰老SA-β-gal染色觀察 先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，分別以100，200，300 μmol/L H2O2誘導(dǎo)培養(yǎng)mASMC 3 h，之后換為正常培養(yǎng)液，次日在顯微鏡下觀察細(xì)胞，結(jié)果200 μmol/L H2O2和300 μmol/L H2O2誘導(dǎo)后細(xì)胞存在明顯皺縮、脫落情況，100 μmol/L H2O2誘導(dǎo)后細(xì)胞變化較輕，所以后續(xù)以100 μmol/L H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。正式實(shí)驗(yàn)分為3組：將mASMC接種于6孔板，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)；H2O2組次日加入100 μmol/L H2O2誘導(dǎo)3 h，然后換成正常培養(yǎng)基恢復(fù)細(xì)胞狀態(tài)24 h；活血膠囊+H2O2組次日加入750μg/mL活血膠囊處理細(xì)胞24h后，加入100 μmol/LH2O2誘導(dǎo)細(xì)胞3 h，然后換成正常培養(yǎng)基恢復(fù)細(xì)胞狀態(tài)24 h。各組細(xì)胞處理后，每孔細(xì)胞用預(yù)冷的PBS漂洗1次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定10 min，吸除細(xì)胞固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次3 min，吸除PBS，每孔加入1 mL提前配置好的染色工作液，避二氧化碳條件下37 ℃染色過(guò)夜。倒置顯微鏡下觀察，藍(lán)色細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞數(shù)目的百分比。

1.2.5衰老相關(guān)基因及衰老相關(guān)分泌表型(SASP)因子表達(dá)檢測(cè) p21、ICAM-1、IL-6、IL-8 mRNA檢測(cè)時(shí)分為對(duì)照組、H2O2組、活血膠囊+H2O2組，沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1(SIRT1)mRNA檢測(cè)時(shí)分為對(duì)照組、活血膠囊24 h組、H2O25 h組和活血膠囊+H2O2組。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)：各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)培養(yǎng)處理后，加入適量TRIzol裂解細(xì)胞，收集裂解液，按照說(shuō)明書(shū)提取總RNA。采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說(shuō)明書(shū)以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄出cDNA鏈；采用TaKaRa熒光定量PCR試劑盒按照說(shuō)明書(shū)以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。p21引物：上游為5’-AGATCTTCCGGAGCCAGG-3’，下游為5’-GGCGTCATCAAAGGAATGGT-3’；ICAM-1引物：上游為5’-ATGTGGGTGTTCAAGTTTCTGC-3’，下游為5’-CCACAAGATTCTGGGGACTC-3’；IL-6引物：上游為5’-CAGCTCCCTAGAAGATGGATTCAT-3’，下游為5’-GTCAGGAGTGGGAGCCATATG-3’；IL-8 引物：上游為5’-AGCCAGCCCCTGAAACTG-3’，下游為5’-CTGCCACTATCTTGCGGTTCT-3’； SIRT1引物：上游為5’-CTCAAGACGCCAGAATCCCA-3’，下游為5’-GGGTCCGGGAAAATGAAACC-3’；GAPDH引物：上游為5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’，下游為5’-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3’。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 變性20 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，在延伸階段進(jìn)行熒光信號(hào)采集，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，用公式2-ΔΔCt計(jì)算目的基因表達(dá)量。

1.2.6細(xì)胞上清液中炎癥因子水平檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、H2O2組、活血膠囊+H2O2組，培養(yǎng)方法同1.2.4。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到離心管中，4 ℃下1 200 r/min 離心20 min，除去細(xì)胞雜質(zhì)及碎片，留取上清液。采用ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中ICAM-1、IL-8、IL-6水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，最終在酶標(biāo)儀上測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.2.7細(xì)胞周期檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、H2O2組、活血膠囊+H2O2組，培養(yǎng)方法同1.2.4。用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶收集細(xì)胞，PBS洗滌，加入1 mL預(yù)冷70%乙醇中，輕輕吹打混勻，4 ℃固定2 h以上。1 000×g離心5 min沉淀細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于1 mL PBS中，離心，沉淀細(xì)胞，每管細(xì)胞樣品中加入500 μL配置好的碘化丙啶染色液，緩慢充分混勻，37 ℃避光溫浴30 min 后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞活力比較 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，對(duì)照組細(xì)胞活力為(61.05±0.03)%，活血膠囊150 μg/mL組、活血膠囊300 μg/mL組、活血膠囊750 μg/mL組細(xì)胞活力分別為(65.62±0.04)%、(66.07±0.10)%、(71.3±1.35)%，活血膠囊150 μg/mL組、活血膠囊 300 μg/mL組與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，活血膠囊 750 μg/mL組明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用活血膠囊750 μg/mL濃度進(jìn)行研究。

2.2各組細(xì)胞衰老情況 SA-β-gal染色顯示，與對(duì)照組比較，H2O2組衰老細(xì)胞明顯增多，表現(xiàn)為體積增大，多個(gè)核，SA-β-gal染色深；活血膠囊+H2O2組衰老細(xì)胞明顯較H2O2組少。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞衰老SA-β-gal染色表現(xiàn)(×100)

2.3各組細(xì)胞衰老相關(guān)基因及SASP相關(guān)因子表達(dá)情況 H2O2組p21、ICAM-1、IL-8、IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)；活血膠囊+H2O2組p21、ICAM-1、IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于H2O2組(P均<0.05)，IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)量與H2O2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。H2O25 h組SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，活血膠囊24 h組SIRT 1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05),活血膠囊+H2O2組SIRT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組但明顯高于H2O25 h組(P均<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中p21、ICAM-1、IL-8、IL-6 及SIRT1 mRNA表達(dá)情況

2.4各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子水平比較H2O2組細(xì)胞上清液中ICAM-1、IL-8、IL-6水平均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)；活血膠囊+H2O2組ICAM-1、IL-6水平均明顯低于H2O2組(P均<0.05)，IL-8水平與H2O2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.5各組細(xì)胞周期比較 H2O2組細(xì)胞周期停滯在

表1 各組小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中ICAM-1、IL-8、IL-6水平比較

G1期，G1期細(xì)胞比例為77.87%，明顯高于對(duì)照組的69.39%(P<0.05)；S期細(xì)胞比例為12.48%，明顯低于對(duì)照組的24.65%?；钛z囊+H2O2組G1期細(xì)胞比例為55.31%，明顯低于H2O2組(P<0.05)；S期細(xì)胞比例為21.53%，明顯高于H2O2組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期情況

3 討 論

細(xì)胞衰老最初描述的是正常細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)在數(shù)次連續(xù)傳代后進(jìn)入不可逆的生長(zhǎng)停滯狀態(tài)，也稱為復(fù)制衰老。衰老細(xì)胞具有增殖減慢、凋亡，S期細(xì)胞減少和G1期細(xì)胞比例增加，SA-β-Gal 活性上調(diào)，衰老相關(guān)標(biāo)志物p16INK4a和p53/p21蛋白表達(dá)升高以及SASP等特征[9]。許多內(nèi)外源性刺激因素也能夠誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，稱為應(yīng)激誘導(dǎo)早衰。研究認(rèn)為，細(xì)胞衰老有可能成為某些老年性疾病的治療靶點(diǎn)[10]。許多藥物如白藜蘆醇[11]和人參皂苷Rb1[12]對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用均與抑制斑塊中細(xì)胞衰老相關(guān)。

既往研究顯示，活血膠囊及其所含活性單體均具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中TNF- α介導(dǎo)的黏附分子和IL-6表達(dá)的作用[13-15]?；钛z囊中的有效活性成分黃芪甲苷、羥基紅花黃色素A和芍藥苷能夠通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，抑制血管平滑肌細(xì)胞泡沫化，進(jìn)而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用；還可激活bEND.3中PI3K/AKT/Nrf2信號(hào)通路，從而激活下游分子HO-1的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用，抑制內(nèi)皮功能失調(diào)和動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程[16-17]。上述研究表明活血膠囊可作用于斑塊內(nèi)多種細(xì)胞，影響多種信號(hào)通路，減少炎性因子和黏附因子分泌，改善斑塊內(nèi)炎性環(huán)境，增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)對(duì)活血膠囊是否可抑制H2O2誘導(dǎo)的mASMC衰老進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)H2O2可誘導(dǎo)mASMC衰老及SASP表型的表達(dá)和分泌，活血膠囊可顯著抑制H2O2對(duì)mASMC中衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)作用，可抑制H2O2誘導(dǎo)的ICAM-1、IL-6升高，說(shuō)明活血膠囊可抑制H2O2誘導(dǎo)的mASMC衰老。

沉默信息調(diào)節(jié)因子(Sirtuins)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類具有脫乙酰酶或ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)，是一組NAD+依賴的、高度保守的組蛋白去乙酰化酶，可通過(guò)去乙?；饔谜{(diào)節(jié)眾多底物蛋白質(zhì)的表達(dá)，哺乳動(dòng)物Sirtuins可與p53、FOXO、PGC-1α、NF-κB、Ku70等蛋白相互作用，調(diào)控細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、代謝、衰老和凋亡等過(guò)程[18]。SIRT1是Sirtuins家族中研究最多的亞型之一，其是能量代謝的調(diào)節(jié)因子[18]。修成奎等[19]報(bào)道，人參-三七-川芎提取物可能通過(guò)SIRT1-自噬通路延緩血管內(nèi)皮細(xì)胞的衰老。周毅等[20]報(bào)道，SIRT1可通過(guò)上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞中LXRα和ABCA1的表達(dá),抑制氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞泡沫化，從而影響動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。李書(shū)國(guó)等[21]研究表明，SIRT1能夠減少血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)下血管平滑肌細(xì)胞中p21、p53蛋白表達(dá),降低G0/G1期細(xì)胞比例。p21和p53是細(xì)胞衰老的標(biāo)志蛋白，p21可以抑制細(xì)胞周期蛋白E活性，其是p53的下游靶基因，細(xì)胞內(nèi)p53表達(dá)下調(diào)可以抑制p21的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H2O2誘導(dǎo)mASMC細(xì)胞后，細(xì)胞中p21 mRNA表達(dá)量升高，SIRT1 mRNA表達(dá)量降低，G0/G1期細(xì)胞比例升高；加入活血膠囊預(yù)處理后，細(xì)胞中p21 mRNA表達(dá)量降低，SIRT1 mRNA表達(dá)量升高，G0/G1期細(xì)胞比例降低。提示活血膠囊可能是通過(guò)SIRT1的作用，下調(diào)p21 mRNA表達(dá)，從而減輕H2O2對(duì)mASMC細(xì)胞周期的阻滯作用。

綜上所述，活血膠囊可抑制H2O2誘導(dǎo)的mASMC衰老，機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞中SIRT1表達(dá)、抑制ICAM-1和IL-6表達(dá)有關(guān)。該藥的作用機(jī)制還有待深入研究，以為闡明活血化瘀中藥抑制血管衰老、增強(qiáng)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的作用提供更多證據(jù)和理論依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。