陶飛，孫韜，王鈺，魏婷，倪俊，許平

（1上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240；2天津大學(xué)生物安全戰(zhàn)略研究中心，天津 300072；3中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，國家合成生物技術(shù)創(chuàng)新中心，天津 300308；4中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院，深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院，中國科學(xué)院定量工程生物學(xué)重點實驗室，廣東 深圳 518055）

當(dāng)前，極端天氣的出現(xiàn)日益頻繁，氣候變化已經(jīng)從科學(xué)觀測和理論的層面變成了人們可以切身感受的事實［1］。造成氣候變化主因的碳排放因此受到了越來越多的關(guān)注，各國紛紛制定了自己的減排目標(biāo)。在此背景下，我國提出了自己的減少碳排放的目標(biāo)，計劃在2030年左右實現(xiàn)“碳達峰”，在2060年左右實現(xiàn)“碳中和”［2-3］。實現(xiàn)這個目標(biāo)需要著重在4個方面努力；其一是能源生產(chǎn)的脫碳，這個是指清潔能源的替代，用非化石資源的新能源替代傳統(tǒng)能源；其二是能源消費的脫碳，主要是指各領(lǐng)域的電能替代，構(gòu)建以清潔電力為基礎(chǔ)的產(chǎn)業(yè)體系和生產(chǎn)生活方式，擺脫煤、油、氣依賴；其三是非能利用領(lǐng)域的碳減排，是指傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)向低耗能、低排放、高附加值方向加快轉(zhuǎn)型，大幅減少工業(yè)過程中產(chǎn)生的碳排放；其四是自然碳匯和碳捕集，由于受資源、技術(shù)、經(jīng)濟性等因素影響，到2055年左右，我國能源生產(chǎn)、消費以及工業(yè)非能利用領(lǐng)域還有約14億噸碳排放，需要通過自然碳匯、碳捕集等措施予以解決［4-5］。

藍細菌是一種原核的光合微生物，能夠以陽光作為能源，以CO2為碳源自養(yǎng)生長，在自然界中廣泛分布，種類繁多，承載著地球上重要的初級生產(chǎn)力，在地球碳循環(huán)、地球氧化型大氣的形成等方面起到不可替代的作用［6-7］。它在多個基礎(chǔ)研究和生物技術(shù)領(lǐng)域扮演了十分重要的角色，在當(dāng)前快速發(fā)展的合成生物學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)成為第3類最重要 的 微 生 物 底 盤［8］。例 如，魚 腥 藻7120（Anabaenasp.PCC 7120）是研究生物固氮和細胞分化的模式生物［9-10］；聚球藻和集胞藻經(jīng)常被用于研究光合作用的機制［11］；淡水聚球藻7942（Synechococcus elongatusPCC 7942）和海水聚球藻7002（Synechococcussp.PCC 7002）等已經(jīng)作為宿主進行能源和精細化合物生產(chǎn)［8，12］；淡水集胞藻6803（Synechocystissp.PCC 6803）用于PHB（聚-β-羥丁酸）等多種化合物的合成［13］。目前使用藍細菌作為宿主已經(jīng)實現(xiàn)了數(shù)十種化合物的合成，其中能源類化合物如乙醇、丁醇、烷烴、脂肪酸、蔗糖、石竹烯等，大宗化學(xué)品如乳酸、甘油等，精細化學(xué)品如苯丙烷類化合物等，另外還有淀粉、胞外多糖、蛋白質(zhì)等聚合物［14-15］。

經(jīng)過多年的研究，用藍細菌作為底盤構(gòu)建光驅(qū)動細胞工廠，直接轉(zhuǎn)化CO2生產(chǎn)化合物潛能已得到廣泛的認可。尤其是聚球藻，由于具備良好的性能和可操作性，已經(jīng)成為藍細菌合成生物學(xué)領(lǐng)域的熱門底盤［8，16］。隨著研究的深入，以藍細菌為底盤的光驅(qū)動合成所面臨的問題也逐漸浮現(xiàn)，這其中最為重要的是效率問題和抗逆問題。首先，相較于異養(yǎng)生物，藍細菌細胞工廠的產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)強度都比較低，以乳酸生產(chǎn)為例，以葡萄糖為碳源的細菌可以在幾十個小時內(nèi)生產(chǎn)高達200 g/L的乳酸［17］，而藍細菌在2周的生產(chǎn)周期內(nèi)只能生產(chǎn)不到2 g/L的乳酸［18］。這是藍細菌合成生物學(xué)一直以來被人們廣泛詬病的原因，即使考慮到藍細菌的培養(yǎng)基成本和碳源成本的優(yōu)勢，這樣的生產(chǎn)強度和產(chǎn)物濃度仍然是一個嚴(yán)重的制約因素。另外一個問題是在藍細菌產(chǎn)業(yè)化中所面臨的污染問題。藍細菌的大規(guī)模培養(yǎng)需要用陽光作為能源，戶外培養(yǎng)或者特殊的大規(guī)模光反應(yīng)器是一個必然選擇，再加上培養(yǎng)周期長，外源雜菌的污染就成為了極大的問題，容易造成培養(yǎng)的失?。?9］。鑒于以上問題，以藍細菌作為底盤的生物技術(shù)前景如何，究竟是否值得大力投入研究，一直是被業(yè)界所爭論的話題。尤其是在當(dāng)前“碳達峰”“碳中和”的“雙碳”政策大背景下，發(fā)展新興的生物技術(shù)已經(jīng)成為了迫切的需求，各種新的低碳生物技術(shù)都方興未艾，可以說藍細菌生物技術(shù)的發(fā)展又到了一個新的十字路口［14，20］?；诖?，本文就上述問題展開綜述和討論，以期把上述相關(guān)內(nèi)容梳理出基本脈絡(luò)。

1 光驅(qū)動細胞工廠的理性與愿景

1.1 光合作用是自然選擇的有機物生產(chǎn)方式

放眼我們所處的宇宙，不難發(fā)現(xiàn)宇宙中能量十分富足但有機物極其稀缺。宇宙中從質(zhì)量到能量的轉(zhuǎn)化時時刻刻都在大規(guī)模地發(fā)生，每個恒星都可以持續(xù)不斷通過發(fā)光發(fā)熱的方式向外釋放能量，這種基于熱核反應(yīng)的能量也是人類理想的終極能源［21］。相比于物理意義上的能源，有機物在宇宙中雖然普遍存在，但卻十分稀少，主要是由非生物的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生［22］。人類的一切活動都離不開化合物的生產(chǎn)，特別是有機物的生產(chǎn)，比如食品、纖維、塑料、燃料等，這是由我們的生物本質(zhì)所決定的［23］。如果暫時拋開當(dāng)下能源挑戰(zhàn)，從人類的長遠發(fā)展來看，不難預(yù)見，當(dāng)人類依賴熱核反應(yīng)或者其他方式真正實現(xiàn)能源自由的那一天到來時，物質(zhì)資料的生產(chǎn)，特別是有機物的生產(chǎn)，仍然會是人類活動的重要方面，甚至于將是僅存的恒久話題。

地球的獨特性之一在于存在生命可以利用光能生產(chǎn)有機物，這就是光合作用，它是目前所知利用光能生產(chǎn)有機物的主要天然實現(xiàn)方式，也是自然界存在的利用天然能源合成有機物的最高效的方式［22］。雖然除了光合作用還存在很多的光化學(xué)反應(yīng)、電化學(xué)反應(yīng)等可以實現(xiàn)簡單有機物的合成，但是相比于光合作用，它們的規(guī)模和效率都微不足道［22］。光合作用的誕生對于地球來說是革命性的，它為地球上豐富有機物的出現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)，也根本上改變了地球的氧化還原環(huán)境［7］。從這個意義上說，光合作用是被自然界選擇了的利用光能合成有機物的催化方式，這種方式對于地球的物理環(huán)境來說具有其優(yōu)越性。當(dāng)然，并不是說這種方式是不能超越的，只是說在當(dāng)前的約束條件下它具有最大的合理性。事實上，當(dāng)前的合成生物學(xué)就是期望通過人工的方式對自然進化予以超越［8，24-25］。我們不能否認未來可能存在比光合作用更有效率、更適合的利用能量合成有機物的方式，但僅就目前而言，光合作用系統(tǒng)仍然是人類最可及的體系。以這個天然的系統(tǒng)為基礎(chǔ)進行改造和提升仍然最符合理性。

需要注意到，人類目前所能利用的主要能量來源從根本上說都是太陽能。生物質(zhì)是通過植物的光合作用形成的有機物，可以看作是以生物質(zhì)形式儲存的太陽能；化石資源是遠古生物光合作用形成的有機碳埋藏到地下形成的，根本上也是太陽能［22］。當(dāng)我們以化合物作為最終的目標(biāo)產(chǎn)品時，不難看出，所有的生產(chǎn)方式從根本上都是利用能量合成有機物的實現(xiàn)（圖1）。顯而易見，在能量利用的任何一個環(huán)節(jié)都會損失一定的能量，因為沒有哪個能量轉(zhuǎn)化步驟的效率是100%。因此，在能量使用中，更少的步驟往往意味著更高的效率。因此可以推斷，在利用太陽能來合成有機物的過程中，直接用藍細菌光驅(qū)動的方式由于需要的步驟最少，在能量總體利用效率方面具有潛在的巨大優(yōu)勢，即使當(dāng)前這個優(yōu)勢還未充分得到體現(xiàn)。另外還需要意識到，盡管太陽輸出到地球的能量總量很大，但是受到氣候條件等因素限制，真正可以被使用的太陽能是有限的［26］，對有限的太陽能的利用來說，總體效率的考量十分重要。

圖1 利用太陽能合成有機化合物的幾種不同路徑Fig.1 Different ways for producing chemicals from solar energy

1.2 藍細菌與土地氣候的依賴

技術(shù)的實施依賴于一定的土地和氣候條件，新的能源技術(shù)和綠色生產(chǎn)技術(shù)的實施也不例外，必須考量的因素就是土地和氣候條件對能源開發(fā)利用的影響。事實上，這種影響已經(jīng)造成新能源利用的一些困境，比如風(fēng)電和光伏發(fā)電，受到氣候的影響大，穩(wěn)定性差，并入電網(wǎng)的比例不能超過15%［27-28］。物質(zhì)資料的生產(chǎn)更是如此，例如糧食生產(chǎn)以及生物煉制所需的各種生物質(zhì)資源的生產(chǎn)，都受到土地和氣候條件的制約。開發(fā)新的技術(shù)擺脫這種制約才能利用有限的能源，實現(xiàn)物質(zhì)資料生產(chǎn)效率的最大化。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中這一理念已經(jīng)得到了實踐證實，比如發(fā)展海水稻、旱地稻可以讓糧食的生產(chǎn)一定程度上減少對淡水的依賴［29-30］。需要注意的是，大型藻類及植物和藍細菌一樣可以進行光合作用，對它們來說，“雙碳”背景同樣也為其合成生物學(xué)發(fā)展提供了寶貴的機遇。但是，相比較而言，藍細菌細胞工廠擺脫時空依賴方面可以說具有與生俱來的優(yōu)勢。首先，藍細菌是微生物，可以使用反應(yīng)器來培養(yǎng)，不受濕度、溫度、鹽度等地理氣候因素限制，規(guī)?？梢匀我夥糯?，相同的土地面積上還可以使用立體培養(yǎng)的方式實現(xiàn)光能利用的最大化［31］。其次，藍細菌本身具有生物多樣性，能夠適應(yīng)不同的棲息地，這種具備不同適應(yīng)性的藍細菌可以用于開發(fā)適合不同條件的細胞工廠［32］。再次，藍細菌細胞本身具有晝夜周期律，這與天然的晝夜規(guī)律、太陽能的釋放規(guī)律吻合。藍細菌相較于植物和大型藻也具有更高的效率［33］?？傊?，用藍細菌細胞工廠來進行物質(zhì)的生產(chǎn)，有利于最大程度地擺脫對氣候和土地的依賴，從而實現(xiàn)物質(zhì)生產(chǎn)效率的最大化。

1.3 藍細菌生物技術(shù)在“碳中和”中的應(yīng)用潛力

1.3.1 能源生產(chǎn)

在我國的“碳達峰”和“碳中和”路線中，要實現(xiàn)的是能源消費的電能化，也就是說能源產(chǎn)品的最終形式都要盡可能逐漸歸一到電能上去，然后把電能提供給終端的能源使用者［4］。Sawa等［34］利用打印的方法把藍細菌鋪在碳納米管表面制作了生物太陽能板，可以在光照下實現(xiàn)連續(xù)產(chǎn)電，這證明了利用藍細菌實現(xiàn)發(fā)電的可能性。這種方法目前看來還只能為低功耗的場景提供電能，用途有限，但是產(chǎn)電的相關(guān)機制值得深入研究，尤其是合成生物學(xué)、材料科學(xué)、界面科學(xué)相關(guān)的技術(shù)加持，產(chǎn)電效率將會進一步提高，這種活的光伏發(fā)電裝置，對于解決光伏發(fā)電中的太陽能板污染的相關(guān)問題或許是一種新的選擇［35］。

在電能消費領(lǐng)域，電池能量密度是一個重要的問題，以實驗室性能較好的鋰電池為例，能量密度為600 W·h/kg［36］，而汽油的能量密度可達12889 W·h/kg。因而對于能量需求大的應(yīng)用場景，現(xiàn)有技術(shù)條件下實現(xiàn)電能替代比較困難，例如飛機、大功率的工程機械和裝甲車等。在這些場合中使用液體燃料仍然是相當(dāng)長時期的合理選擇。在這種應(yīng)用場景下要替換化石燃料，使用生物煉制來源的可再生液體燃料將是出路之一。以藍細菌作為細胞工廠生產(chǎn)能源化合物已經(jīng)發(fā)展多年，現(xiàn)在能夠生產(chǎn)乙醇、氫氣等多種能源化合物［12，37］。藍細菌可以一步把太陽能轉(zhuǎn)化為高能量密度的化合物，在太陽能的整體利用效率上比傳統(tǒng)基于生物質(zhì)的生物煉制具有優(yōu)勢，從這個意義上說，藍細菌底盤可以在此方面有較大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

在新能源中風(fēng)能和光伏發(fā)電從能源的豐富程度和技術(shù)成熟度上都接近實用化。尤其是對于我國來說，西部地區(qū)蘊藏的風(fēng)能和光能資源是我國實現(xiàn)“雙碳”目標(biāo)的最大底氣［2，4］。但是太陽能和風(fēng)能發(fā)電、受到氣候條件的強烈干擾，極不穩(wěn)定，并入電網(wǎng)困難，素有“垃圾電”的稱謂。高效、大容量、低成本的電能儲存技術(shù)是解決這個問題的關(guān)鍵［27-28］。現(xiàn)在的電能儲存方法主要是電池、超級電容器、壓縮空氣、抽水法等，這些方法都面臨能量密度低的問題，難以滿足大規(guī)模儲能的要求［28］。如果能夠把基于藍細菌的液體燃料生產(chǎn)和光伏發(fā)電結(jié)合起來，在太陽能盈余的時候用太陽能驅(qū)動藍細菌細胞工廠合成化合物對太陽能儲存，在太陽能不足的時候用儲存的化合物來發(fā)電，就可以解決太陽能發(fā)電的波動性問題，這將是一個值得研究的潛在方案。

1.3.2 非能源化合物制造

在碳排放的構(gòu)成中，除了能源生產(chǎn)之外還有很大一部分來源于工業(yè)生產(chǎn)過程。目前，我國每年工業(yè)過程產(chǎn)生的碳排放大約為10億噸左右［3-4］。針對工業(yè)過程的碳排放，可以從兩個方面入手：一方面用生物煉制來源的還原劑替代化石來源的還原劑，比如在制煉鋼中使用生物煉制的氫氣作為還原劑；另一方面可以利用合成生物學(xué)開發(fā)新型的綠色制造工藝和技術(shù)。生物催化的最大特點就是高選擇性，常溫常壓，碳原子經(jīng)濟性高，發(fā)展生物催化來替代原有的化學(xué)催化將幫助多個領(lǐng)域的減排［38］。藍細菌細胞工廠作為一種綠色生產(chǎn)方式，在很多領(lǐng)域具有替換傳統(tǒng)方式的潛能。首先，藍細菌可以用來生產(chǎn)大宗非能源化合物。例如塑料等聚合物，用量巨大，是最重要的大宗化學(xué)品之一。利用藍細菌已經(jīng)可以實現(xiàn)多種聚合物單體的合成，比如乙烯、1，3-丙二醇、異戊二烯、乳酸、2，3-丁二醇等［14，18，39-41］。有些藍細菌菌株可以直接在胞內(nèi)積累天然的聚合物，比如集胞藻6803可以在胞內(nèi)積累PHB顆粒，這是一種天然的可降解塑料，其最高產(chǎn)量現(xiàn)已達到81%的細胞干重［13］。其次，藍細菌可以用于合成重要的精細化學(xué)品，這主要包括植物天然產(chǎn)物、藍細菌次級代謝產(chǎn)物、醫(yī)藥中間體等［42-43］。藍細菌在食品領(lǐng)域也有重要的應(yīng)用，可以用于合成蛋白質(zhì)、多糖、功能糖等［44］。

1.3.3 碳捕集和碳匯增強

在實現(xiàn)對化石碳資源使用的大幅度削減之后，最終還會有一部分碳排放無法避免，要解決這部分碳排放問題就需要進行減碳，主要是通過碳捕集和自然碳匯強化［4］。藍細菌細胞可以直接把氣體的CO2固定生成生物質(zhì)或生物基產(chǎn)品，能夠直接一步實現(xiàn)碳的捕集和固定，并且和特定的化合物生產(chǎn)偶聯(lián)［45］。具體使用上，可以利用藍細菌在兩種場景下開展碳捕集。其一，可以在接近碳排放的地點建立藍細菌大規(guī)模培養(yǎng)工廠，直接進行高濃度CO2的吸收固定，把CO2資源化。例如可以在大型的鋼鐵廠建立藍細菌的反應(yīng)器，直接利用工廠排放的高濃度CO2，把碳排放和碳捕集偶聯(lián)起來，實現(xiàn)碳的零排放。另外還可以在日光充足的西部地區(qū)建立藍細菌反應(yīng)裝置，從空氣中直接捕集CO2合成生物質(zhì)或者特定化合物，直接把富余的太陽能用于CO2固定。

在實現(xiàn)能源生產(chǎn)和大宗化學(xué)品生產(chǎn)的同時，藍細菌細胞工廠還可實現(xiàn)碳捕捉和碳匯強化［46］。藍細菌細胞工廠生產(chǎn)的能源類產(chǎn)品會經(jīng)過燃燒重新排放碳，細胞物質(zhì)經(jīng)過煉制之后可以用作飼料等，最終也會經(jīng)過動物消化等重新形成排放。但是，非能源的產(chǎn)品比如大宗材料單體等，則會以固定的碳形式存在，從大氣中消除［46-47］。藍細菌在自然界中是形成自然碳匯的重要驅(qū)動力，也可以通過對藍細菌的干預(yù)增強，提升土壤水體的碳匯形成能力。比如在土壤中接種藍細菌可以提高旱地土壤的碳匯形成能力［48］。藍細菌細胞在環(huán)境治理中也有廣泛的應(yīng)用，污染處理過程中也可以形成碳匯，有報道稱可以在污染治理的同時實現(xiàn)能源生產(chǎn)和CO2捕集［49］。

2 聚球藻的代謝潛能

2.1 生長速度潛能

生長速度是影響細胞工廠性能的關(guān)鍵因素之一［50］。相比于真核生物，原核生物作為底盤的一個顯著優(yōu)勢即在于其生長速度。以大腸桿菌和酵母菌的對比為例，一般認為大腸桿菌的倍增時間約為20 min，酵母的倍增時間約為90 min［51-52］。這種復(fù)制速率差異的原因是系統(tǒng)性的，和細胞結(jié)構(gòu)復(fù)雜度、基因組大小、DNA復(fù)制方式、細胞周期、胞內(nèi)空間分布等都有密切的關(guān)系。以大腸桿菌DNA復(fù)制方式為例，它的DNA復(fù)制是一種連續(xù)的形成嵌套的復(fù)制結(jié)構(gòu)，這和真核生物的DNA復(fù)制精確地控制在特定時期內(nèi)有根本的不同［53-54］。顯而易見這種系統(tǒng)原因所造成的速度差異，通過有限的遺傳操作很難逾越，至少以現(xiàn)在對微生物細胞的認識水平和技術(shù)手段來說，難以在有意義的時長內(nèi)予以實現(xiàn)。藍細菌作為原核生物的一種，同樣擁有原核生物的復(fù)制機制，現(xiàn)在報道的藍細菌（聚球藻）最快的倍增時間為1.5 h［55-57］，還遠遠沒有達到一般異養(yǎng)細菌的生長速度。因此僅從生長速度方面來說，藍細菌特別是聚球藻在生長速率方面還有巨大的潛能有待挖掘。也正是從這個意義上說，相比于真核微藻，藍細菌在生長速度方面擁有更大的可挖掘潛力。

關(guān)于藍細菌生長速度的限制因素已有一些很有意義的研究。Jahn等［58］通過藍細菌的鳥槍蛋白質(zhì)組研究了模式藍細菌對光合碳源限制的適應(yīng)過程，發(fā)現(xiàn)細胞能夠按照生長優(yōu)化的策略重組蛋白質(zhì)組，但卻會偏離這一策略保持蛋白質(zhì)儲備以應(yīng)對可能的環(huán)境改變，他們同時還發(fā)現(xiàn)藍細菌的生長速度主要受到光合碳源的限制。Burnap［50］針對藍細菌基于蛋白質(zhì)組約束建立了自養(yǎng)生物優(yōu)化生長模型，可為自養(yǎng)藍細菌的生長研究提供理論工具。值得注意的是最近的一些關(guān)于快速生長和大生物量藍細菌的研究，已經(jīng)初步揭示了聚球藻所蘊含的巨大生長潛能。比如新發(fā)現(xiàn)的聚球藻2973倍增時間可達1.5 h［57］，聚球藻11901倍增時間為2 h，生物量可達33 g/L，這種速度已經(jīng)非常接近酵母菌的速度，生物量甚至于不弱于異養(yǎng)生長的細菌［55-56］。這些研究清楚地表明了藍細菌，尤其是聚球藻在生長方面的巨大潛能。一方面，這些新發(fā)現(xiàn)的菌株可以用于生長速度決定機制的機理研究，為進一步挖掘藍細菌生長潛能提供基礎(chǔ)。另一方面，這些菌株可以直接作為底盤，建立合成生物學(xué)平臺，并最終發(fā)展成高效的光驅(qū)動細胞工廠。

2.2 光能利用

太陽的輻射能量散布在不同的波段，藍細菌和其他的藻類僅能利用部分波段，主要是紅光和藍光波段。據(jù)測算，藍細菌僅能利用陽光能量的3%～9%，相較于太陽能電池接近50%的光能利用率，這個利用率較低［59］。提高光能利用效率的重要手段之一是拓寬藍細菌的可利用光譜，這也是藍細菌研究的熱點之一。拓寬光譜主要有3個思路：①尋找不同光譜利用的元件進行整合，比如葉綠素F可以幫助實現(xiàn)遠紅外波段的利用［60］；②利用納米和生物的結(jié)合，利用納米材料的光電效應(yīng)，在藍細菌表面實現(xiàn)波譜轉(zhuǎn)化或者光電轉(zhuǎn)化，進而實現(xiàn)生物利用［61-62］；③利用太陽能電池板和LED的高效率，通過光-電-光的轉(zhuǎn)化，把不同波段的太陽能變成藍細菌可高效利用的650 nm波段，實現(xiàn)太陽能的高效利用［63］。光譜拓寬的研究隱含著一個重要的問題，那就是“在漫長的進化過程中藍細菌為什么沒有進化出利用所有光譜的利用能力”。到底是藍細菌的碳基生命的本質(zhì)的限制，還是地球有限波動的物理條件沒有提供足夠的進化機會？這個問題目前為止還未得到解決。但無論如何可以肯定的是，我們離真正的藍細菌光能利用效率的邊界還有很長的距離。這一點無論是從藍細菌的多樣性，還是光合系統(tǒng)本身的可操控空間來說都是如此，即使只對光利用的系統(tǒng)進行優(yōu)化也有相當(dāng)大的空間提升光效率［64-66］。利用光-電-光轉(zhuǎn)化的方式提升太陽能量利用效率的工程化條件是接近成熟的，它的障礙在于光元器件的整合設(shè)計、強光脅迫等問題的解決。同時也需要探討最適光比例、光照方式等以實現(xiàn)全鏈條的最大效率。

2.3 固碳能力

在已發(fā)現(xiàn)的所有固碳途徑中藍細菌的天然固碳途徑并不是最有效的，除了藍細菌中的固碳途徑還有5種其他生物的固碳途徑，這為利用合成生物學(xué)手段對不同途徑的整合與優(yōu)化提供了豐富的素材［67-68］。鑒于此，一方面可以在藍細菌中進行關(guān)鍵固碳酶的替換，比如可以通過酶的挖掘和人工設(shè)計獲得高效的固碳酶，然后進行替換；另一方面可以在藍細菌中引入額外的固碳途徑［69］。隨著代謝網(wǎng)絡(luò)理論的發(fā)展和固碳途徑的認識不斷深入，根據(jù)計算理論設(shè)計構(gòu)建人工的固碳途徑也已經(jīng)成為可能，已有一些研究成功設(shè)計了人工固碳途徑［67-68，70］。碳固定效率提升的另一個方面是提升CO2的可獲得性。藍細菌天然存在碳濃縮機制，通過對這些機制和元件的深入研究，可以最大程度地提升藍細菌對CO2的可獲得性［69］。值得注意的是，碳濃縮機制僅在CO2濃度低的時候起到正面的作用，在高濃度CO2的條件下，碳濃縮機制的缺失或敲低更有利于CO2的利用［71］。敲除碳濃縮機制的另外一個好處是降低了工程藍細菌在自然環(huán)境中的生存能力，從而可以減少工程藍細菌對環(huán)境的影響［72］。增強CO2的利用還可以通過培養(yǎng)基的化學(xué)吸收實現(xiàn)，比如Ataeian等［45］篩選了一個耐堿的藍細菌菌群，可以在pH為11.2的培養(yǎng)條件下快速吸收轉(zhuǎn)化CO2，大大提高了碳的吸收效率。

2.4 藍細菌底盤的多樣性

微生物的代謝潛能蘊藏在微生物的多樣性之中，多樣性越高，就越有希望找到符合各種各樣不同需求的基因資源，這是開發(fā)藍細菌細胞工廠以滿足“碳達峰”“碳中和”需求的理性所在［73］。作為藍細菌的代表菌株，聚球藻在地球生物圈中豐度和多樣性比較高，是海洋的主要初級生產(chǎn)力來源［74-75］。這就使得我們能夠方便地獲得適用于聚球藻的功能基因元件，并且方便地實現(xiàn)聚球藻細胞工廠的構(gòu)建。另外，聚球藻的多樣性說明這種底盤的強大環(huán)境適應(yīng)能力和生態(tài)競爭能力，這從細胞工廠的大規(guī)模應(yīng)用來講是一個巨大的優(yōu)勢。再次，聚球藻的適應(yīng)能力也決定了未來在各種不同環(huán)境應(yīng)用的可能性。最后，從科學(xué)上講，這個方面的研究對于地球碳循環(huán)的研究來說也具有很高的科學(xué)價值。另外一點值得關(guān)注的是聚球藻具有非常強的代謝可塑性，對其進行高鹽、高光等馴化可以獲得相應(yīng)的適應(yīng)性突變菌株［76］。鑒于上述特點以及聚球藻的基因操作技術(shù)相對來說較為成熟，作為宿主構(gòu)建細胞工廠的研究比其他藍細菌種屬都要多。不難看出，綜合來說聚球藻作為底盤進行合成生物學(xué)研究科學(xué)價值和應(yīng)用潛力都是不容忽視的。

3 聚球藻與基因編輯技術(shù)

3.1 基因編輯

上述分析表明了對系統(tǒng)化開發(fā)聚球藻底盤的重要價值。底盤開發(fā)的重要前提是高效可靠的遺傳操作技術(shù)。聚球藻基因組的高效改造和編輯，是重構(gòu)聚球藻代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、提高其代謝潛能的關(guān)鍵使能技術(shù)。傳統(tǒng)的聚球藻基因組編輯方法主要依賴于自殺質(zhì)粒攜帶的同源片段與染色體發(fā)生雙同源重組，并使用抗生素抗性基因等篩選標(biāo)記進行篩選，難以實現(xiàn)無痕編輯。因此，下一輪編輯時需要使用新的篩選標(biāo)記，限制了對聚球藻的系統(tǒng)遺傳改造。此外，由于聚球藻通常具有多拷貝的染色體，因此需要多輪的抗生素篩選分純，才可以得到純種基因型突變體［77-78］。CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein）系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于多種真核和原核生物的基因組編輯［79］。借助CRISPR/Cas系統(tǒng)的精確定位和高效DNA切割能力，可提高外源DNA編輯模板與染色體DNA的同源重組效率，簡化基因組編輯操作流程，實現(xiàn)高效無痕的遺傳改造［圖2（a）］。

2016年，Hu Yu-Chen團隊和Himadri B.Pakrasi團隊分別在兩株模式聚球藻S.elongatusPCC 7942和S.elongatusUTEX 2973中開發(fā)了基于釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)（表1）。S.elongatusPCC 7942的CRISPR/Cas9基因組編輯基于雙質(zhì)粒系統(tǒng)，由一個質(zhì)粒表達Cas9和引導(dǎo)RNA（guide RNA，gRNA），另一個質(zhì)粒提供編輯所需的同源重組片段和敲入的靶基因。Cas9和gRNA的表達均使用S.pyogenesCRISPR/Cas9系統(tǒng)的天然啟動子，在S.elongatusPCC 7942可實現(xiàn)組成型表達。作者測試了敲除glgc的同時敲入ppc和gltA，從而提高菌株固定CO2合成琥珀酸的能力，對經(jīng)過3代抗生素篩選的克隆進行驗證，基因編輯效率達到100%［80］。S.elongatusUTEX 2973的CRISPR/Cas9工 具 質(zhì) 粒pSL2546改 造 自 鏈 霉 菌（Streptomyces）的CRISPR/Cas9質(zhì)粒pCRISPomyces，由一個質(zhì)粒表達Cas9和gRNA，同時攜帶編輯模板。適用于鏈霉菌的啟動子PrpsL（XC）和Pgapdhp（EL）在S.elongatusUTEX 2973也具有功能，分別用于Cas9和gRNA的組成型表達。作者使用開發(fā)的系統(tǒng)對nblA進行了敲除，不需要對編輯后的細胞進行多次抗生素篩選傳代，即可實現(xiàn)100%的編輯效率［82］。

表1 基于CRISPR的聚球藻基因組編輯技術(shù)Tab.1 CRISPR-based genome editing technologies for Synechococcus

在構(gòu)建聚球藻的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)對聚球藻的毒性較大，導(dǎo)致工具質(zhì)粒轉(zhuǎn)化困難［84］。分析原因，一方面，Cas9蛋白具有較強細胞毒性，在其他微生物中也有體現(xiàn)［85］；另一方面，在聚球藻中Cas9蛋白的表達通常使用組成型啟動子，沒有受到嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目刂疲觿×似涠拘?。Himadri B.Pakrasi團隊在多株藍細菌中測試了來自Francisella novicida的CRISPR/Cas12a（Cpf1）系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)其細胞毒性較小，同時可高效地在模式聚球藻S.elongatusPCC 7942和S.elongatusUTEX 2973中實現(xiàn)基因組編輯［81，83］。該系統(tǒng)由一個質(zhì)粒表達Cas12a和gRNA，同時攜帶編輯模板，IPTG誘導(dǎo)型啟動子Plac和組成型啟動子PJ23119分別用于Cas12a和gRNA array的表達調(diào)控。作者測試了psbA的單點突變、eyfp的敲入和nblA的敲除，通過對經(jīng)過3～4代抗生素篩選的克隆進行驗證，發(fā)現(xiàn)編輯效率為60%～90%［83］。

3.2 堿基編輯

使用開發(fā)的CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a系統(tǒng)，可在聚球藻中實現(xiàn)無痕的基因敲除、敲入或者替換。但是，該方法基于質(zhì)粒提供的編輯模板與染色體DNA的同源重組，以及CRISPR/Cas系統(tǒng)對未發(fā)生同源重組細胞的反向篩選。受限于聚球藻的DNA轉(zhuǎn)化效率和同源重組效率，難以實現(xiàn)多個靶點的同時編輯。堿基編輯（base editing）技術(shù)最初由哈佛大學(xué)的David R.Liu團隊和神戶大學(xué)的Akihiko Kondo團隊獨立開發(fā)，其結(jié)合了CRISPR/Cas系統(tǒng)的定位功能和堿基脫氨酶的脫氨功能，在不產(chǎn)生雙鏈DNA切割，不依賴外源DNA模板的條件下，在染色體特定位點實現(xiàn)C→T的堿基轉(zhuǎn)換［86-87］。之后，研究者又陸續(xù)開發(fā)了可實現(xiàn)A→G轉(zhuǎn)換、C→A和C→G顛換的堿基編輯技術(shù)［88-90］。堿基編輯最初為治療人類遺傳疾病而設(shè)計，逐步應(yīng)用于微生物的基因組編輯中，目前已在大腸桿菌（Escherichia coli）、谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等模式微生物中得到應(yīng)用［91］。由于不需要提供外源的DNA模板、不依賴雙鏈DNA斷裂和同源重組修復(fù)，堿基編輯可用于微生物中多靶點的同時編輯，并可在Biofoundry平臺實現(xiàn)全流程的自動化編輯［92-93］。此外，堿基編輯可對靶基因的表達調(diào)控元件進行編輯，從而實現(xiàn)多至10個基因的表達調(diào)控元件的體內(nèi)建庫和進行表達調(diào)控，已經(jīng)成為重要的合成生物學(xué)使能技術(shù)［94］。因此，有必要開發(fā)適用于聚球藻等藍細菌的堿基編輯技術(shù)，實現(xiàn)多靶點的同時編輯，加速聚球藻的遺傳改造和功能基因組學(xué)研究［圖2（a）］。

圖2 使用CRISPR及衍生技術(shù)進行聚球藻基因組編輯Fig.2 Genome editing in Synechococcus using CRISPR and CRISPR-derived technologies

3.3 多基因調(diào)控

CRISPR/Cas系統(tǒng)不僅可用于基因組編輯，經(jīng)過改造還可用于基因表達調(diào)控，實現(xiàn)基因沉默和激活［79］。2016年Hu Yu-Chen團隊首先利用雙鏈DNA切割功能失活的dCas9構(gòu)建了S.elongatusPCC 7942的CRISPR干 擾 系 統(tǒng)（CRISPR interference，CRISPRi），可實現(xiàn)靶基因表達水平90%以上的弱化［95］。CRISPR/Cas12a系統(tǒng)不僅對聚球藻的細胞毒性較低，且由于Cas12a同時具有RNA切割功能，可加工gRNA array形成單個成熟的gRNA，方便同時靶向多個基因。2020年，成均館大學(xué)的Han Min Woo團隊和華盛頓大學(xué)的Himadri B.Pakrasi團隊分別在兩株模式聚球藻S.elongatusPCC 7942和S.elongatusUTEX 2973中 利用雙 鏈DNA切割功能失活的dCas12a建立了CRISPRi技術(shù)，通過使用誘導(dǎo)型啟動子控制dCas12a表達，實現(xiàn)了可控、高效的多基因表達弱化［96-97］。除CRISPRi外，CRISPR激 活（CRISPR activation，CRISPRa）系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于E.coli和產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）等細菌中［98］。但是，目前針對聚球藻的CRISPRa系統(tǒng)還有待開發(fā)。CRISPRi和CRISPRa技術(shù)具有g(shù)RNA的可追蹤性，通過建立gRNA文庫，可構(gòu)建全基因組規(guī)模的基因表達擾動文庫，高通量地進行功能基因組學(xué)研究和功能元件挖掘。目前已有針對集胞藻Synechocystissp.PCC 6803的全基因組規(guī)模CRISPRi文庫，并用于乳酸耐受和高產(chǎn)相關(guān)基因的挖掘［99］。因此，有必要針對聚球藻建立全基因組規(guī)模的CRISPRi和CRISPRa文庫，在全基因組規(guī)模上研究基因型與有益表型的關(guān)聯(lián)性。

4 聚球藻與適應(yīng)性進化

4.1 底盤進化

實驗室進化是對聚球藻進行定向改造的另一項關(guān)鍵使能技術(shù)，可以直接根據(jù)研究者需要的功能設(shè)計篩選策略，即使在對相關(guān)元件的作用機制還沒有進行詳細解析的情況下，通常也可以通過該方法獲得符合需求的突變體。實驗室中微生物適應(yīng)性進化最常用的方法是在一定的篩選壓力下將微生物連續(xù)傳代培養(yǎng)，通過微生物突變的富集獲得能夠適應(yīng)篩選條件的表型［100］。目前為止以聚球藻為對象進行適應(yīng)性進化的研究還比較有限，考慮到聚球藻和集胞藻都是研究最多的模式單細胞微藻，且二者之間有很多相似之處［101］，因此集胞藻的適應(yīng)性進化對于聚球藻的相關(guān)研究也具有很強的借鑒意義。聚球藻和集胞藻的適應(yīng)性進化，主要是為了提高它們的光合效率以及對于生物合成過程中可能遇到的脅迫條件的耐受能力。

Dann等［102］利用化學(xué)誘變劑甲磺酸甲酯MMS和紫外線誘變相結(jié)合，連續(xù)傳代培養(yǎng)后獲得了能夠耐受超過自然條件下陸上最高太陽光光強度［3000 μmol/（m2·s）］的集胞藻PCC 6803，從突變株基因組中檢測到的突變位點涉及基因表達、光合作用、細胞代謝等多種不同功能分類的基因。Yoshikawa等［103］則直接利用集胞藻PCC 6803自然突變的積累，在高光照條件下連續(xù)傳代培養(yǎng)后也獲得了耐受光強度達到7000～9000 μmol/（m2·s）的突變株，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致高光耐受的突變主要位于hik26和slr1916兩個基因上，與前述研究中檢測到的位點有所不同。

Srivastava等［104］進化聚球藻PCC 11801使其對丁醇和丁二醇的耐受濃度提高到原水平的2倍，其中丁醇耐受株還獲得了對乙醇的耐受性。進化獲得的菌株的突變主要位于脅迫響應(yīng)的翻譯起始因子和細胞代謝相關(guān)的酶類編碼基因中。在其他種類的藍細菌也開展了一些進化工作，可在聚球藻的進化中借鑒。Wang等［105］進化集胞藻PCC 6803使其對丁醇的耐受濃度提高2.5倍，并利用代謝組學(xué)方法對進化不同階段所產(chǎn)生的突變株進行了分析，發(fā)現(xiàn)如3-磷酸甘油酸、NADPH等不穩(wěn)定代謝物以及甘油、硬脂酸等穩(wěn)定代謝物在進化過程中的差異化調(diào)控。Xu等［106］進化集胞藻PCC 6803使其對鎘離子的耐受濃度提高到原來的2倍，且該突變株對鋅和鈷等重金屬離子以及高光強的耐受能力也提高了；通過對基因突變的分析發(fā)現(xiàn)其中編碼正離子或藥物泵出系統(tǒng)的基因slr0454與突變株的鎘離子耐受能力直接相關(guān)。Tillich等［107］進化獲得了熱耐受性的集胞藻PCC 6803突變株，并通過突變測序分析確定了一系列導(dǎo)致突變株產(chǎn)生耐熱表型的基因。Hu等［108］在3%氯化鈉的篩選條件下進化了集胞藻PCC 6803對高鹽濃度的耐受性，并對突變株進行了代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析，揭示了不同突變株在高鹽脅迫條件下代謝物組成以及基因表達情況的不同，從側(cè)面反映了產(chǎn)生高鹽耐受表型的不同機理。Uchiyama等［109］則進化了集胞藻對酸的耐受性，獲得能夠在pH 5.5的條件下生長的突變株。

4.2 元件進化

以上研究中都采用連續(xù)傳代培養(yǎng)的方式，且大多只依賴于聚球藻等藍細菌在生長過程中天然的突變積累實現(xiàn)建庫，由于藍細菌的生長周期普遍較長，使得適應(yīng)性進化的過程也十分漫長，通常需要花費數(shù)月甚至數(shù)年時間。而除了將聚球藻整體作為對象進行定向進化改造之外，一些關(guān)鍵元件也可以通過基因操作轉(zhuǎn)移到其他生長更快且操作更加簡便的模式微生物體系中進行進化操作。

已有研究通過在大腸桿菌中部分重建卡爾文循環(huán)，建立了大腸桿菌的生長與在該循環(huán)中起關(guān)鍵作用的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）的催化效率之間的關(guān)聯(lián)。通過這樣的構(gòu)建，可以充分利用大腸桿菌系統(tǒng)基因操作便利的優(yōu)勢，采用易錯PCR的方式對來源于聚球藻的RuBisCO進行擴增快速建立突變庫，轉(zhuǎn)化后篩選具有生長優(yōu)勢的菌株從而獲得催化性能得到改善的突變體［110-111］。除大腸桿菌之外，釀酒酵母中的非飽和脂肪酸缺陷型菌株也可以作為底盤，用于進化來源于聚球藻PCC 6301的脂肪酸去飽和酶［112］。以上研究都是通過一定的方式將待進化的藍細菌元件的功能與最常用的大腸桿菌或釀酒酵母的生長建立關(guān)聯(lián)，從而構(gòu)建了簡便的篩選策略，再利用這兩種模式生物基因操作便捷的優(yōu)勢，實現(xiàn)以藍細菌本身為底盤難以達到的快速進化。近年來在大腸桿菌等模式微生物中的連續(xù)定向進化系統(tǒng)已有了快速的發(fā)展。其中，噬菌體輔助連續(xù)進化系統(tǒng)（phage-assisted continuous evolution，PACE）通過建立待進化生物分子的功能與噬菌體侵染能力之間的關(guān)聯(lián)，并借助連續(xù)培養(yǎng)裝置來實現(xiàn)自動建庫和篩選，達到高效進化的目的（圖3）［113-114］。該系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于RNA聚合酶、氨酰tRNA合成酶、Cas蛋白、堿基編輯器等重要生物工具酶類，以及抗生素合成通路的進化［115-117］。此外，包括基于CRISPR/Cas系統(tǒng)等基因編輯工具進行建庫的方法也在不斷涌現(xiàn)，且借助自動化實驗平臺等工具可以使得適應(yīng)性進化操作更加快速高效［118］。利用這些實驗系統(tǒng)和平臺，有望大大加速聚球藻關(guān)鍵元件的進化。通過藍細菌元件的分別進化和突變體組裝以及重新組裝后的工程菌株的整體適應(yīng)性進化相結(jié)合的研究方式，可以為菌株的性能改造提供更多途徑，也將為研究者積累豐富的關(guān)于藍細菌基因功能及代謝調(diào)控的數(shù)據(jù)。

圖3 噬菌體輔助連續(xù)進化（PACE）系統(tǒng)示意圖MP—誘變質(zhì)粒；AP—輔助質(zhì)粒；SP—篩選噬菌體或其注入宿主細胞的基因組；POI—待進化的目標(biāo)蛋白Fig.3 Schematic design of phage-assisted continuous evolution(PACE)MP—mutagenesis plasmid;AP—accessory plasmid;SP—selection phage or its genome inside the infected host cell;POI—protein of interest to be evolved

5 聚球藻的多元抗逆

聚球藻底盤在規(guī)模化培養(yǎng)中，面臨來自環(huán)境（鹽度、pH、重金屬、溫度及光照等）的多種非生物脅迫，因此，鑒定、解析及構(gòu)建魯棒性底盤，使其具備抗逆性能，尤其是對多種脅迫的協(xié)同抗逆性對其規(guī)?；瘧?yīng)用十分必要（圖4）。

圖4 聚球藻在規(guī)?；囵B(yǎng)中面臨的脅迫及潛在的解決策略Fig.4 Stress and potential solutions in large-scale culture of Synechococcus sp

5.1 聚球藻逆境脅迫響應(yīng)基因的鑒定

聚球藻PCC 7942作為最為廣泛使用的模式藍細菌底盤之一，其完整基因組注釋早在2005年就已完成，已被用于合成正丁醇［119］、異丁醛［120］、乳酸［121］等多種化學(xué)品，關(guān)于聚球藻PCC 7942的抗逆研究也廣泛開展。2014年，Billis等［101］利用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)系統(tǒng)研究了聚球藻PCC 7942分別在無機碳減少、鹽度增加、pH增加和光照減少的脅迫條件下24 h后細胞的基因表達響應(yīng)。作者通過分析揭示了參與眾多脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵基因并預(yù)測了未知功能蛋白與生化途徑之間的關(guān)聯(lián)，為進一步改造底盤對脅迫的抗逆能力提供了重要靶點［101］。2017年，Kobayashi等［122］研究了聚球 藻PCC 7942中雙組分系統(tǒng)RpaB和Rre1在熱激脅迫中的響應(yīng)，通過免疫共沉淀和高密度微陣列分析等鑒定出Rre1的一系列結(jié)合位點，證實Hik34-Rre1是聚球藻PCC 7942中激活熱激響應(yīng)的關(guān)鍵信號模塊。在此基礎(chǔ)上，Yasuda等［123］又證實了RpaB可能廣泛參與從暗到光以及光強上升條件下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對于宿主的高光響應(yīng)同樣具有重要作用，這表明雙組分系統(tǒng)在多元抗逆中均有參與，可能成為未來工程改造的靶點。之前的研究都集中在單一脅迫，而在規(guī)?；瘧?yīng)用過程中，通常面臨多種脅迫，因此鑒定多元逆境響應(yīng)的元件更加重要。2020年，Guyet等［124］以海洋聚球藻WH 7803為對象，研究了其對光照、溫度及紫外脅迫中兩兩組合脅迫下（低光低溫、低光紫外、低光高溫、高光紫外、高光低溫、高光高溫）的響應(yīng)機制；研究發(fā)現(xiàn)，單一脅迫均對光系統(tǒng)造成損傷而紫外脅迫造成的損傷尤為嚴(yán)重；通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)，鑒定到了一系列在組合脅迫下特異響應(yīng)的基因，例如低溫紫外和低溫高光脅迫誘導(dǎo)下的DNA結(jié)合蛋白編碼基因dpsA、多種組合脅迫下編碼通用脅迫響應(yīng)蛋白的基因uspG等，這些基因的鑒定為未來構(gòu)建多元抗逆底盤打下了基礎(chǔ)。

5.2 新型聚球藻底盤的鑒定及解析

近年來，隨著研究的深入，不斷有更優(yōu)越的聚球藻底盤被鑒定，一方面這些菌株作為新型底盤可能更具優(yōu)勢，另一方面對這些底盤的解析可發(fā)掘高效元件用于理性改造其他聚球藻底盤。聚球藻UTEX 2973是2015年被報道的1種具備快速生長能力且耐受高溫（42℃）高光［2000 μmol/（m2·s）］的藍細菌底盤，其與聚球藻PCC 7942基因組相似度高達98%以上［56］；聚球藻UTEX 2973倍增時間最短可達1.5 h，因此有可能成為更有應(yīng)用前景的藍細菌底盤［125］。前期工作通過光合參數(shù)測定、代謝流模型及轉(zhuǎn)錄組學(xué)等解析了聚球藻UTEX 2973與聚球藻PCC 7942間的差異，發(fā)現(xiàn)聚球藻UTEX 2973中光合系統(tǒng)I含量增加了1.6倍，細胞色素b6f含量增加了1.5倍，質(zhì)體藍素含量增加了2.4倍，使得菌株具備更強的光合及固碳能力［57，125-126］。聚球藻UTEX 2973雖然與聚球藻PCC 7942高度同源，但喪失了天然吸收外源DNA的能力從而限制了基因操作的便捷性。此后，與上述兩底盤基因組相似度達83%的另一底盤——聚球藻PCC 11801被鑒定和解析。聚球藻PCC 11801可耐受超過38℃的溫度及超過400 μmol/（m2·s）的光照；在1%CO2、1000 μmol/（m2·s）條件下倍增時間可達2.8 h，更重要的是，其關(guān)鍵中間代謝物水平較高且在高CO2和高溫條件下生長速度更快，因此有可能成為戶外培養(yǎng)和最終應(yīng)用于生物煉制的有吸引力的底盤［127］。對于藍細菌的規(guī)模化培養(yǎng)將耗費大量的水資源，采用海水培養(yǎng)將節(jié)約淡水資源，因此發(fā)掘優(yōu)勢海洋藍細菌底盤十分必要。聚球藻PCC 11901是2020年被報道的1株新型海洋藍細菌底盤，其在41°C、500 μmol/（m2·s）及1% CO2條件下倍增時間為2 h，并且干重高達33 g/L，同樣有望成為新興的藍細菌底盤［55］。目前圍繞聚球藻PCC 11801及聚球藻PCC 11901的解析工作開展較少，未來對其代謝模式及基因組的發(fā)掘工作將有助于發(fā)掘耐受高溫、高光及高鹽等的模塊用于改造其他聚球藻底盤。

5.3 聚球藻底盤抗逆能力的定向改造

聚球藻UTEX 2973已具備高溫高光的耐受能力，但其耐鹽性能相對較低。為了提高底盤的耐鹽能力，Cui等先后在聚球藻UTEX 2973中通過引入外源轉(zhuǎn)運蛋白及滲透相溶性物質(zhì)的策略進行探索：通過分別表達21個外源Na+/H+相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白并在鹽脅迫下進行篩選，發(fā)現(xiàn)3個Mrp逆向轉(zhuǎn)運蛋白可顯著提高宿主的耐鹽性，其中聚球藻PCC 7002來源的Mrp蛋白可使聚球藻UTEX 2973抗鹽性提高57.7%［128］；通過在聚球藻UTEX 2973中引入滲透相溶性物質(zhì)甘油葡萄糖苷的合成途徑，底盤抗鹽性能提升了62%［129］。這些工作為提供更具環(huán)境魯棒性的聚球藻底盤打下基礎(chǔ)。考慮到聚球藻UTEX 2973與聚球藻PCC 7942間的高度同源性，利用前者優(yōu)勢模塊對后者進行改造引起廣泛關(guān)注。在解析聚球藻UTEX 2973基因組差異的基礎(chǔ)上，Lou等［130］率先在聚球藻PCC 7942中引入聚球藻UTEX 2973中的差異基因并成功鑒定到后者中的ATP合酶亞基（AtpA）的突變是造成二者對高光高溫耐受能力差異的最主要因素，通過在聚球藻PCC 7942中引入突變后的atpA可顯著提升其高溫高光耐受能力。隨后Ungerer等［81］利用基因編輯的策略逐步在聚球藻PCC 7942中引入其與聚球藻UTEX 2973的差異基因，最終獲得3個造成二者表型差異的基因。單基因或少數(shù)基因難以實現(xiàn)菌株的全局性變化，而適應(yīng)性進化通過不斷增加篩選壓力，可富集有利突變，實現(xiàn)基因組的全局調(diào)整從而使得底盤抗逆能力得到穩(wěn)定提升。在近期的工作中，Srivastava等［104］通過100代的連續(xù)進化，將聚球藻PCC 11801對正丁醇、2，3-丁二醇及乙醇的耐受能力分別提升至5 g/L、30 g/L及32 g/L，并發(fā)現(xiàn)了若干關(guān)鍵突變基因例如編碼翻譯起始因子編碼蛋白rpoB及ABC轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因等，這些基因未來也可用于其他聚球藻底盤的抗逆改造。

目前，具備多元抗逆能力的聚球藻底盤仍舊較少，如何鑒定、解析及構(gòu)建多元抗逆魯棒性底盤，可從以下幾個方面思考（圖4）：

（1）新型底盤的發(fā)掘及解析聚球藻PCC7942、聚球藻PCC7002和集胞藻PCC6803作為經(jīng)典的藍細菌菌種被廣泛用于合成生物學(xué)研究，然而作為工業(yè)底盤進行規(guī)?；瘧?yīng)用仍有所欠缺，目前對于天然的新型藍細菌菌株的鑒定已發(fā)掘了包括聚球藻UTEX 2973、聚球藻PCC 11801及聚球藻PCC 11901等更具優(yōu)勢的底盤，有望促進藍細菌的規(guī)模化應(yīng)用，未來，鑒定更多的底盤并對其進行機理解析將有助于對傳統(tǒng)底盤的改造，同時開發(fā)配套的遺傳工作工具也將助力新型底盤的開發(fā)和使用。

（2）多維定向進化定向進化雖然需要較長時間，卻是獲得魯棒性底盤的最有效方式之一，目前針對聚球藻的定向進化工作相對較少，未來可首先圍繞不同脅迫對聚球藻進行定向進化獲得耐受性底盤，隨后在獲得單一脅迫耐受底盤的基礎(chǔ)上繼續(xù)進行多維進化從而獲得多元抗逆底盤。

（3）理性設(shè)計現(xiàn)有的系統(tǒng)生物學(xué)工作已發(fā)掘了諸多與脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因，如何把這些關(guān)鍵基因有機整合對聚球藻底盤進行理性設(shè)計十分關(guān)鍵，在未來需要結(jié)合生物信息學(xué)理性分析代謝網(wǎng)絡(luò)進行關(guān)鍵基因的整合從而助力多元抗逆底盤的構(gòu)建。

6 聚球藻細胞工廠

自1979年聚球藻被發(fā)現(xiàn)以來，其生理、生化系統(tǒng)發(fā)育及分子生態(tài)學(xué)等方面取得了一系列重要進展。隨著我國可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的加速推進和CO2減排的迫切需求，綠色生物制造產(chǎn)業(yè)正在全面拓展與提升。其中將聚球藻開發(fā)成為高效光驅(qū)固碳細胞工廠，使其利用光能將CO2直接轉(zhuǎn)化為生物基化學(xué)品，在綠色生產(chǎn)的同時助力碳中和目標(biāo)的實現(xiàn)，成為極具前景的研究方向。

6.1 大宗化學(xué)品

2，3-丁二醇是極具應(yīng)用潛力的平臺化合物，從丙酮酸開始，2，3-丁二醇可以通過乙酰乳酸合成酶，乙酰乳酸脫羧酶和乙醇脫氫酶的催化合成來實現(xiàn)。乙酰乳酸合成酶催化兩個丙酮酸分子縮合成一個乙酰乳酸，然后乙酰乳酸脫羧酶使其脫羧生成乙酰丙酮，最后一步用乙醇脫氫酶將乙酰丙酮還原為2，3-丁二醇。Oliver等［131］在聚球藻PCC 7942中進行了生產(chǎn)實驗，20 d后2，3-丁二醇的產(chǎn)量達2.38 g/L。Li等［132］以聚球藻PCC 7942為底盤構(gòu)建異丁醇產(chǎn)生菌株，通過敲除糖原合成途徑中的葡萄糖-1-磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶，使52%的碳流量被重定向到異丁醇生物合成途徑，產(chǎn)量達550 mg/L。Lan等［133］在聚球藻PCC 7942中構(gòu)建產(chǎn)3-聚羥基丁酸的兩種途徑，一種是丙二酰輔酶A依賴途徑，3-聚羥基丁酸的產(chǎn)量最高達665 mg/L，另一種β-丙氨酸依賴途徑產(chǎn)量稍低，為186 mg/L。

乳酸是一種手性α-羥基酸，有兩種異構(gòu)體D型和L型，被廣泛應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥、化工、紡織、食品等行業(yè)。最近一種極具應(yīng)用前景的多聚形式——聚乳酸有望成為生物基塑料的生物可降解替代品，它的一步法合成是利用脫氫酶將細胞內(nèi)的丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸異構(gòu)體。Li等［18］將來自保加利亞桿菌ATCC11842的D-乳酸脫氫酶進行突變，輔助因子由NADH逆轉(zhuǎn)為NADPH，將該工程酶引入聚球藻PCC 7942中，構(gòu)建了從CO2生成D-乳酸的高效光驅(qū)動系統(tǒng)，將乳酸的產(chǎn)量提高了3.6倍以上。Wang等［41］以聚球藻PCC 7942為底盤過表達甘油-3-磷酸酶構(gòu)建基因工程菌YW1，甘油產(chǎn)量達1.17 g/L，實現(xiàn)了利用CO2直接進行C3平臺化學(xué)品的光合生產(chǎn)，并且在YW1菌株中擴展外源途徑，進一步引導(dǎo)碳通量產(chǎn)生二羥基丙酮和3-羥基丙酸兩種平臺化學(xué)品，證明了由藍細菌產(chǎn)生的甘油可以作為發(fā)酵原料。Roh等［134］在快速生長的聚球藻UTEX 2973中引入來源于羅爾斯通氏菌H16（Cupriavidus necatorH16）的phaCAB基因構(gòu)建產(chǎn)β-聚羥基丁酸生產(chǎn)菌株，工程菌的產(chǎn)量達420 mg/L。

6.2 高值化合物

藍細菌由于可以解決生物法制備天然產(chǎn)物所面臨的植物酶源適配性、還原力的供應(yīng)和昂貴底物的依賴等問題，因此成為植物天然產(chǎn)物生產(chǎn)的理想平臺，已經(jīng)被用來生產(chǎn)萜類和苯丙烷類等天然產(chǎn)物（表2）。Ni等［42］在光合微生物聚球藻PCC 7942中構(gòu)建了1個光自養(yǎng)合成平臺，直接將溫室氣體CO2轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇、柚皮素、雙去甲氧基姜黃素、香豆酸、咖啡酸、阿魏酸。這6種天然高值產(chǎn)物可以進一步衍生出其他珍貴的極具價值的天然產(chǎn)物。該團隊［43］還通過引入2-苯乙醇途徑和1個人工的解反饋抑制模塊，創(chuàng)建了1個代謝陷阱，將30%以上的碳源重定向到低流量的莽草酸途徑，從而直接利用CO2高效合成芳香類天然產(chǎn)物。

表2 聚球藻細胞為底盤生產(chǎn)的產(chǎn)品Tab.2 Chemical production using Synechococcus strain as chassis

異戊二烯是重要的化工原料，可通過形成聚合體合成橡膠、塑料及萜類化合物［135］。Gao等［39］將不同來源的異戊二烯合酶引入聚球藻PCC 7942，發(fā)現(xiàn)藍桉樹（Eucalyptus globulus）來源的ispS比其他來源的基因在藍細菌中可溶性表達更好；隨后，他們利用動態(tài)代謝流分析揭示MEP途徑的瓶頸，構(gòu)建了異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶（IDI）和IspS融合酶并高表達了1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因（dxs）和4-羥基-3-甲基-2-烯基二磷酸合酶基因（ispG），重組菌株可以在21 h內(nèi)光合生產(chǎn)1.26 g/L異戊二烯。

Davies等［136］在聚球藻PCC 7002中表達了留蘭香（Mentha spicata）的檸檬烯合酶基因或者巨冷杉（Abies grandis）的α-紅沒藥烯合酶基因（bis），分別可以得到4 mg/L檸檬烯和0.6 mg/L紅沒藥烯。Takahama等［137］在聚球藻PCC 7942表達了丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）中的乙烯形成酶基因（efe），光合合成了約512 μg/（L·OD·h）的乙烯。Jacobsen等［138］在聚球藻PCC 7002中表達了大腸桿菌的磷酸甘露醇脫氫酶基因（mtlD）和艾美球蟲（Eimeria tenella）的甘露醇磷酸酶基因（mlp），每天可以光合生產(chǎn)0.15 g/L甘露醇。將糖原合成途徑失活后，甘露醇的產(chǎn)量可以提高3.2倍。

6.3 光驅(qū)動細胞工廠新策略

微生物共生在多種生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，是當(dāng)前正在興起的一種新的新的合成生物學(xué)策略，在化學(xué)品的生物生產(chǎn)效率提升方面有獨特的潛力。Smith等［139］研究了光合自養(yǎng)的聚球藻PCC 7942與重氮營養(yǎng)型固氮菌共培養(yǎng)情況，提出了交互取食（cross-feeding）模型。他們用固氮菌和聚球藻構(gòu)建了一種新的共培養(yǎng)微生物體系，可在無固定碳與固定氮的條件下生長。這個共培養(yǎng)體系在無聚球藻條件下不能生長，兩種菌也無法獨自在沒有固定的碳或氮的情況下生長。這個新體系具備直接利用空氣、水、磷酸鹽、微量金屬和陽光生產(chǎn)工業(yè)產(chǎn)品的潛力，如生產(chǎn)聚羥基丁酸（PHB）和海藻酸鹽。Weiss等［140］利用上述產(chǎn)蔗糖藍細菌與異養(yǎng)鹽單胞菌（Halomonas bolviensis）共培養(yǎng)，催化低價值碳水化合物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)高價值化合物。他們實現(xiàn)了一種生物塑料前體PHB的合成。他們同時證明海藻酸鹽包裹聚球藻可提高蔗糖外排量，并增強共培養(yǎng)穩(wěn)定性，最終PHB累積量可達細胞干重的31%，產(chǎn)率可達28.3 mg/（L·d）。這種共培養(yǎng)方法達到或超過了那些傳統(tǒng)工程藍細菌單一培養(yǎng)技術(shù)。更重要的是，這種方法能夠抵抗外來微生物的污染，在不用抗生素或其他化學(xué)選擇壓力情況下，可連續(xù)生產(chǎn)超過5個月。

納米技術(shù)與合成生物學(xué)的結(jié)合是光驅(qū)動細胞工廠發(fā)展的一種新策略。這個方法能夠通過納米顆粒的加入改變藍細菌NADPH的供給，從而改善細胞工廠的性能。Velmurugan等［141］研究了金屬氧化物對集胞藻產(chǎn)乙醇的影響，發(fā)現(xiàn)金屬氧化物有可能在電子供體存在下產(chǎn)生NADPH，從而改善藍細菌的生長和乙醇產(chǎn)量。這種乙醇合成的增強可以歸因于乙醇合成途徑中NADPH可獲得性增加以及相關(guān)碳代謝途徑的重新定向。工程菌株在最優(yōu)光照強度和添加NADP與MgO條件下，可在25 d內(nèi)積累乙醇5100 mg/L，比對照高2倍。該研究表明了用金屬氧化物介導(dǎo)的藍細菌胞外NADPH再生并增加細胞工廠產(chǎn)量的可行性。

7 總結(jié)

在“碳達峰”“碳中和”的“雙碳”目標(biāo)的導(dǎo)引下，開發(fā)高效、低成本綠色環(huán)保的新技術(shù)是至關(guān)重要的保障。藍細菌細胞工廠由于自身特點在生產(chǎn)能源、制造非能大宗化學(xué)品、消除碳排放方面都具有獨特的優(yōu)勢和巨大的潛力。在當(dāng)前的“雙碳”背景下，藍細菌合成生物學(xué)面臨著新的機遇，正在迎來新一輪的發(fā)展浪潮。聚球藻作為藍細菌底盤典型代表，在多樣性、適應(yīng)性、生長代謝潛能、基因操作技術(shù)成熟度等方面都有很大的潛在優(yōu)勢。聚球藻底盤開發(fā)的挑戰(zhàn)在于其生產(chǎn)強度和抗逆能力不能滿足應(yīng)用的需求。在聚球藻的底盤化開發(fā)中，應(yīng)該瞄準(zhǔn)效率和抗逆的核心問題，在光能捕捉、碳固定、生長速率、抗逆、進化、高效使能技術(shù)等方面重點攻關(guān)尋求突破，以充分挖掘釋放聚球藻的代謝潛能。