史夢琳，周琳，王慶，趙磊，3

（1中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津 300308；2中國科學院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308；3 國家合成生物技術創(chuàng)新中心，天津 300308）

據估計，植物每年所固定的碳約占大氣中碳總量的1/5，相當于化石燃料燃燒所排碳的10倍之多，在生態(tài)碳匯中發(fā)揮重要作用［1］。我國需要積極開展碳減排關鍵技術研發(fā)和創(chuàng)新，以提高生態(tài)碳匯能力。綠色植物可通過葉綠體利用光能，把二氧化碳（CO2）和水轉化為儲存能量的有機物，同時釋放出氧氣（O2），為整個生命系統(tǒng)提供物質和能量，是增加地球碳匯的過程。如圖1所示，植物CO2代謝途徑主要涉及光合作用、光呼吸和呼吸作用。自然界條件下，植物可利用光合作用光反應生成的ATP和NADPH，通過卡爾文循環(huán)將CO2轉化為有機物。但該過程核心的酶核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）存在催化速度慢、反應復雜等諸多問題，導致天然固碳途徑效率較低。同時，由于Rubisco為雙功能酶，其可通過氧化反應造成CO2再釋放，引起高達25%的固碳損失［3-5］。另外，植物呼吸作用可將有機物氧化降解，也是釋放CO2的過程。因此，需要在上述天然CO2代謝途徑改造上取得突破，以大幅增加植物生態(tài)碳匯能力。

圖1 植物天然二氧化碳代謝相關途徑［2］Fig.1 Natural pathways of carbon dioxide metabolism in plants[2]

采用合成生物學技術等改造天然碳代謝途徑、重構新型人工碳代謝通路，有望大幅提高植物CO2固定能力。目前，科學家已在植物光合固碳途徑與Rubisco優(yōu)化、CO2富集、光呼吸和呼吸作用改造等方面取得突破?；诖?，本文分別介紹了植物光合作用、光呼吸和呼吸作用中與CO2固定、釋放相關的途徑，并指出可用于改造的潛在靶點；重點綜述了植物體內已構建的人工固碳途徑，系統(tǒng)分析評價了不同途徑的CO2固定能力和限制因素；最后，對人工設計并合成植物CO2代謝通路、基于零碳排放的新型物質生產等關鍵問題進行了探討，并對植物CO2代謝途徑的合成生物學改造發(fā)展趨勢進行了展望。

1 光合固碳改造

植物固碳過程依賴于光合系統(tǒng)，相關復合體主要包括：光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）、光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）、Cytb6f及ATP酶復合體等。該過程始于光系統(tǒng)Ⅱ對光子的吸收，植物體利用光能將水分子裂解，釋放的電子傳遞給質體醌，并在類囊體膜兩側建立跨膜質子梯度以用于產生ATP。電子可通過光合電子傳遞鏈，依賴光系統(tǒng)Ⅰ產生還原性的NADPH。光反應所產生的大部分能量和還原力，被用于卡爾文循環(huán)：在Rubisco催化作用下，CO2與核酮糖-1，5-二磷酸（RuBP）反應，產生3-磷酸甘油酸（PGA）。PGA被進一步轉化為1，3-二磷酸甘油酸和甘油醛-3-磷酸（G3P），該過程需要ATP和NADPH。之后，G3P可被催化生成RuBP、葡萄糖、蔗糖和其他碳基分子［5］。圍繞上述光合固碳過程進行改造已取得了系列進展。

1.1 光合系統(tǒng)的優(yōu)化

光合作用系統(tǒng)改造是一個新興的研究領域，通過在系統(tǒng)建模的指導下開發(fā)新的元件、途徑和調節(jié)回路，以創(chuàng)建更有效的光合系統(tǒng)。該領域研究范圍較廣，既包括天然光合系統(tǒng)的優(yōu)化和產物高效利用，也包括重建全新的乃至自然界中不存在的系統(tǒng)。

1.1.1 光能利用效率的優(yōu)化

自然光合作用已有數十億年的進化歷史，但其光能利用效率不到1%，這直接限制下游固碳能力?？梢?，光合效率尚有較大的提升空間。因此，發(fā)掘自然光合系統(tǒng)的限速步驟并對其優(yōu)化，是改善光合系統(tǒng)的主要途徑［6］。由于已有較多光系統(tǒng)組裝相關綜述文章，本部分聚焦點主要包括光系統(tǒng)天線的優(yōu)化，及提升光系統(tǒng)對波動光的響應能力等。

（1）光系統(tǒng)天線的優(yōu)化

由于所吸收光能過剩，大部分被吸收的光不能轉化為化學能，而是以熱量的形式被耗散出去（圖2）。尤其是在光照強烈的時間區(qū)段內，該現(xiàn)象更為明顯，這增強了植物在進化過程的適應能力［7］。然而，在現(xiàn)代集約化農業(yè)生產中，較少出現(xiàn)大量植物爭奪有限自然光的情況?？茖W家普遍認為光系統(tǒng)天線過于龐大［7-9］；因此，減小天線尺寸有望提高植物生物量和產量［7-8］。捕光天線調控蛋白TLA1、TLA2是萊茵衣藻葉綠素（Chl）天線大小調控的關鍵因子，其過表達株系的葉綠素天線更大，單個細胞中Chl b含量更高；反之，其敲減株系的葉綠素天線尺寸變小且Chl b含量降低，且類囊體結構松散。可見，天線大小顯著影響植物光合作用，但該研究并未統(tǒng)計生物量相關數據［10］。萊茵衣藻tla2突變體在光自養(yǎng)條件下生長良好，光合作用的量子產量與野生型相似。在高密度培養(yǎng)中，由于tla2突變株消除了對陽光的過度吸收和浪費性耗散，其生物量將高于野生型。因此，微藻tla2型突變可使單個細胞過度吸收陽光的能力最小化，有助于大幅提高整體的生產力［11］。

圖2 光合天線吸收光能示意圖Fig.2 Schematic diagram of energy absorption of photosynthetic antenna

（2）提高光系統(tǒng)對波動光的響應能力

自然狀態(tài)下，植物處于波動光生長環(huán)境中，其光合效率取決于遮光所導致的非光化學猝滅系數（NPQ）的降低速度。當處于有限光照條件時，殘余NPQ會以熱量的形式消耗掉部分可用光能，進而降低植物光合效率。由于NPQ的緩慢弛豫時間是植物光合作用限制因子，所以縮短NPQ弛豫時間是優(yōu)化光合系統(tǒng)、提升固碳能力的關鍵策略之一［6，12-13］。

qE作為NPQ的最快響應組分，其在黑暗條件5 min內即可完成弛豫［14］。qE的發(fā)生依賴PSⅡ捕光超級復合物的構象變化；其中，LHC家族蛋白PsbS對qE誘導至關重要［15-17］。過表達PsbS可增加qE容量，進而減少光抑制［18］，但不會增加生物量［19］。因此，過表達PsbS可加速NPQ誘導過程，特別是NPQ的弛豫過程。

葉黃素循環(huán)發(fā)生在類囊體中，葉黃素Vx在強光或其他脅迫條件下形成玉米黃質Zx，這是qE響應所必需的［15，20］。由強光到弱光過渡時，Zx到Vx的再轉換對NPQ完全弛豫尤其重要［14］；該反應由位于類囊體膜基質側的ZEP催化完成［21］。ZEP是一種快速翻轉蛋白，類似于PSⅡ的D1蛋白，其降解率遠高于其他大多數植物蛋白［22-23］。ZEP活性可能是通過蛋白質穩(wěn)定性調控的。當ZEP與黃質脫環(huán)氧化酶和PsbS一起過表達時，植物生物量更大［24］。因此，通過調控NPQ弛豫過程有望提高光系統(tǒng)對波動光的響應能力，提高光合固碳能力。

（3）拓寬天然光合系統(tǒng)吸光范圍

對于植物和大多數藻類，能夠被有效利用的光譜范圍主要局限于可見光，波長約在400～700 nm，這僅占太陽光譜范圍的一半左右。然而，某些藻類含有的特定色素（葉綠素d和葉綠素f）或色素蛋白（藻膽體），其吸光范圍可擴展到遠紅區(qū)域，約700～750 nm［25-26］。因此，開發(fā)藻膽體、葉綠素d或葉綠素f在高等植物中應用潛力，可擴大現(xiàn)有植物的光吸收范圍，進而增強光合效率。

1.1.2 光合固碳效率的優(yōu)化

（1）改善CO2的擴散能力

由于CO2具有擴散作用，導致C4植物葉肉細胞胞質和C3植物葉綠體的Rubisco羧化位點CO2分壓較低［27-28］。因此，改善葉片內部CO2擴散特性，是提高光合效率的有效途徑。現(xiàn)有結果證明，CO2的擴散能力隨溫度升高而升高［29-31］，且與細胞壁厚度、組成等均相關［32-33］。由于葉片CO2擴散速率測定較為困難，導致高CO2擴散材料的篩選變得極具挑戰(zhàn)，這阻礙了相關機制的研究進展。但通過蛋白質工程改善Rubisco特性，有望增加羧化效率，這是提高作物產量的關鍵策略。相關內容將在以下部分進行重點討論。

（2）Rubisco的優(yōu)化

長期以來，科學家將Rubisco作為固碳系統(tǒng)的首要優(yōu)化目標，其目的是提高底物選擇性和動力學性能［34-36］，但迄今為止尚未取得理想效果。研究發(fā)現(xiàn)：來源于陸地植物、綠藻和藍藻的Rubisco，其催化速度和底物特異性成反比。當增強Rubisco對CO2特異性以降低Rubisco加氧酶活性時，會降低CO2催化速率［37-38］。

相比之下，源于硅藻的Rubisco則具有不同的催化特征：硅藻具有CO2濃縮機制，其Rubisco羧化率接近C3植物，但其氧化速率卻非常低［39］。這表明，不同來源的Rubisco動力學數據可能會有較大差異。因此，可以通過拓寬研究范圍來確定降低Rubisco加氧酶活性的最優(yōu)替代途徑［40-41］。此外，將源于紅藻或藍藻的高特異性Rubisco轉化到作物中，要比改造天然Rubisco動力學參數更有效果。尤其是，將Rubisco優(yōu)化與碳濃縮機制改造相結合時，更有助于提高植物固碳能力［42］。然而，用紅藻Rubisco替代煙草內源Rubisco時，紅藻的Rubisco并未在煙草體內形成功能復合體，這表明共表達Rubisco伴侶蛋白的重要性［43］。而在細菌中，已實現(xiàn)Rubisco復合體的全組裝［44］，這為在植物體組裝完整Rubisco復合體提供參考。通過結合物種特異性結構與功能關系的研究［45-46］及Rubisco組裝所需關鍵因子［47-49］，可為篩選特異性強、催化效率高的Rubisco提供重要支持［45-49］。

（3）提高Rubisco附近的CO2濃度

除對Rubisco進行直接改造外，在葉綠體中增加CO2濃度也是減少Rubisco氧化反應的重要手段，如在植物體內導入藻類的CO2濃縮系統(tǒng)（CCM）［50］等。功能性CCM組分主要包括羧酶體或蛋白核結構、碳酸酐酶及無機碳轉運體等［51-55］。羧酶體是光合細菌中的微室，其外層有蛋白質殼包圍，內含碳酸酐酶、Rubisco蛋白等［55-56］。蛋白核作為一個亞細胞微室，與羧酶體具有類似的功能，存在于許多真核藻類和角苔類陸生植物中。與羧酶體不同，蛋白核外層被淀粉鞘和蛋白質層包圍［57］。

CCM部分組分已被成功導入植物體，這為在植物體內構建CCM系統(tǒng)奠定重要基礎［58-59］。研究表明，將藍藻β-羧酶體組分CcmM35與Rubisco大、小亞基整合進煙草后［42］，可形成早期羧酶體結構，并在葉綠體基質中形成大分子復合物。在本氏煙草瞬時表達多種β-羧酶體蛋白，包括CcmK2、CcmM、CcmL、CcmO和CcmN等，可形成高度有序的空室類似結構［42］。其中，CcmM的SSUL模塊可參與Rubisco蛋白聚集過程［60］。在高等植物葉綠體中組裝藍藻α-羧酶體結構，可提升細胞內碳酸氫鹽含量；其介導濃縮形成的CO2，可大量聚集在Rubisco周圍［61］，有利于羧化反應的進行。目前，已在煙草葉綠體中成功合成簡化羧酶體結構。即便其功能不完整，該轉基因煙草仍可在二氧化碳濃度升高的情況下實現(xiàn)自養(yǎng)生長。

除CCM微室自身結構外，只有Rubisco正確定位到微室中，才能確保其CCM結構完整性，而Rubisco結構的復雜性給CCM重建帶來巨大挑戰(zhàn)。在類蛋白核形成過程中，Rubisco組裝由其小亞基的α-螺旋介導，該結構可能與類蛋白核連接蛋白存在相互作用［62-63］。當替換掉萊茵衣藻Rubisco小亞基表面的兩個α-螺旋時，其催化能力不變。因此，該材料可作為底盤細胞，用于檢測新候選蛋白與類蛋白核的連接能力［64］。到目前為止，在植物葉綠體中組裝完整羧酶體和類蛋白核結構仍具有極大挑戰(zhàn)。這需要對CCM結構、組裝和功能作進一步深入解析，以確定負責組裝和正確靶向Rubisco到CCM微室的最少基因［57］。

若在植物體內重構類蛋白核結構，首先需要將散布的Rubisco形成聚集體形式。同高等植物類似，藻類Rubisco由8個小亞基和8個大亞基對稱排列在一起；但藻類中，EPYC1蛋白可將Rubisco高度聚集在蛋白核結構中［63］。計算模擬結果表明，結構松散、柔韌的EPYC1蛋白既可與單個Rubisco的多個位點結合，也可將相鄰的Rubisco連接在一起［圖3（a）］。通過這種方式，EPYC1可將Rubisco聚集在蛋白核矩陣中。但番茄等陸地植物中未發(fā)現(xiàn)EPYC1同源蛋白，這可能是其無法形成類蛋白核結構的原因之一。除EYPC1之外，RCA1、SMM7等參與Rubisco聚集體形成過程的其他關鍵因子也已基本明確［圖3（b）］［65］。

圖3 類蛋白核關鍵因子及結構示意圖［63］Fig.3 Schematic diagram of key factors and structure of pyrenoid[63]

將C4光合系統(tǒng)引入C3作物，也可增加Rubisco附近CO2供給。大多數C4植物位于熱帶和亞熱帶區(qū)域，其對高光呼吸的適應能力更強［66-68］。在C4植物葉肉細胞中，CO2在PEP羧化酶催化作用下生成蘋果酸鹽。之后，該四碳二羧酸鹽被運輸到維管束鞘細胞并完成脫羧反應［68］，這增加了Rubisco附近的CO2濃度。但C4植物中，每固定1分子CO2需要2分子額外的ATP。同時，將C4光合系統(tǒng)引入C3植物時，需要考慮光合過程中生化反應的變化，且高光合活性的維管束鞘細胞要求葉片結構也需有所改變［69-70］。由于缺乏對C4光合作用機制的了解，C3向C4轉化研究進展緩慢。但目前，已有向水稻成功轉入C4光合系統(tǒng)的報道［71］?？梢灶A見，倘若C4水稻工程實現(xiàn)，必將掀起新一輪的綠色革命。

1.2 光合產物高效利用

在設計合成新型代謝途徑時，需整體考慮光合作用與其下游產物利用之間的相互關系。不僅要最大限度地供給底物，還要解除代謝反饋抑制以維持較高光合效率。通過控制“源”與“庫”相互作用，優(yōu)化光合產物的運輸、儲存和消耗，以提高光能的整體利用率。目前在生物能源生產過程中，生物質需經過大量后續(xù)加工才可獲得液體燃料；因此可以采用合成生物策略，將碳儲存到油脂中以生產較高價值的生物產品，如三?；视王サ?。三酰基甘油酯可以很容易地轉化為生物柴油、航空燃料和潤滑油等，而這些原本只能源于化石燃料［72］。通過增加葉片或種子油脂產量，也可獲得高價值飼料或食品作物［73］。通過將碳源循環(huán)到油脂中，可提高能源作物光合效率。

除上述天然光合系統(tǒng)的改造外，采用合成生物學方法可創(chuàng)造非天然光合系統(tǒng)。利用計算機代謝模型優(yōu)化設計光合作用，能有效整合各個代謝通路的信息，達到提高光合效率的最佳目標［74］。另外，Rubisco的底物特異性和催化效率較低，是限制光合能力的主要原因。已有研究表明，可以通過設計新型CO2固定通路，繞過Rubisco催化步驟并縮短光呼吸途徑［75-76］。該內容將在“光呼吸途徑”改造部分重點討論。

1.3 光合固碳系統(tǒng)改造后的應用

在衣藻中，減小光合天線尺寸可提高其光能利用率和整體生產力［11］。高等植物中，大豆葉綠素b缺失突變體的天線減小后，其光合效率可增加30%［77］；煙草葉綠素缺失突變體的天線減少后，其莖葉的生物量提高了25%［78］。當擬南芥調控蛋白HPE1突變后，其光合天線也會減小，且光合效率和生物量也有所增加［79］?？梢姡ㄟ^優(yōu)化植物光合天線系統(tǒng)，可降低光損耗、提高光能利用率，進而其增強其固碳能力。

另外，通過縮短NPQ弛豫時間也可優(yōu)化光合系統(tǒng)，以提升固碳能力。在擬南芥中過表達PsbS可增加qE容量，進而減少光抑制［18］，但不會增加生物量［19］。但是，當ZEP與黃質脫環(huán)氧化酶和PsbS一起過表達時，不僅縮短煙草從光保護中的恢復時間，還顯著提高了煙草生長速率［24］。由于光保護機制存在于大多數開花植物中，上述研究結果可為糧食作物改良提供理論依據。

2 光呼吸途徑改造

2.1 光呼吸代謝途徑

早在1920年，德國科學家奧托?瓦布（Otto Warburg）就發(fā)現(xiàn)植物光合速率會隨著氧分壓的升高而降低，即瓦布效應。直到1955年，約翰?德柯爾（John Decker）［80］發(fā)現(xiàn)煙草葉片在光照突然停止之后，會釋放出大量CO2。他認為，這是植物在光照條件下發(fā)生的“呼吸”，即光呼吸（photo‐respiration）。之后，Zelitch和Tolbert等［81-83］經過一系列深入研究，繪制出完整的光呼吸代謝途徑。光呼吸是所有需要通過卡爾文循環(huán)來固碳的綠色細胞在低CO2、高O2和光照條件下進行的耗能、耗O2且釋放CO2的生化過程。

Rubisco作為雙功能酶，其發(fā)揮功能時可形成活性中間體。該中間體既可以與CO2發(fā)生羧化反應，也可以與O2發(fā)生氧化反應。研究證實：植物Rubisco活性位點更利于發(fā)生羧化反應，約占Rubisco總反應的75%［84］。在地球形成早期，僅有少量O2，Rubisco催化活性不受CO2和O2影響［85］，但進化過程可能導致Rubisco不能很好地區(qū)別O2和CO2。

光呼吸過程中，Rubisco催化RuBP與O2反應，產生PGA和2-磷酸乙醇酸（2-PG）。PGA是Rubisco羧化反應產物，能夠進入卡爾文循環(huán)。而2-PG則很難被再利用，還會抑制光合反應固碳酶。高等植物中，2-PG可通過葉綠體、過氧化物酶體及線粒體內的一系列反應被消耗［86］。

2.2 光呼吸生理功能

光呼吸對植物尤為重要，其被長期抑制時，植物則不能正常生長。雖然C4植物光呼吸已減弱很多，但它仍然是不可缺少的。喪失2-PG代謝能力的突變體，在正常條件下無法生長［87］，這主要由于2-PG會抑制幾種關鍵酶，如磷酸甘油醛異構酶（參與RuBP的再生）［88］、磷酸果糖激酶［89］等。通過光呼吸代謝途徑，可將2-PG轉化為PGA，進而實現(xiàn)解毒功能。其他光呼吸中間產物的積累，對植物細胞也是有毒的，如乙醇酸會影響CO2吸收［90］；乙醛酸不但能抑制Rubisco活性［91-92］，還會影響CO2同化速率［93］。光呼吸會消耗光合固碳及ATP和NADPH，在C3植物中可導致高達50%的光合效率損失［94］。因此，作為光合作用的耗能副反應，通過降低光呼吸有望提高光合效率。

2.3 光呼吸途徑的改造方式

植物光呼吸會造成固碳損失，可通過以下3種方法提高植物底盤固碳能力：①優(yōu)化Rubisco或在其周圍增加CO2濃度，以提高其羧化效率而減少RuBP氧化率［95］；②通過基因突變或過表達來改變天然光呼吸途徑，減少毒副產物并提高碳回收率［96］；③導入新型光呼吸替代途徑，以減少光呼吸損耗［97］。以下將對相關內容進行詳細介紹。

2.3.1 天然光呼吸途徑的改造

前期研究發(fā)現(xiàn)：大多數光呼吸突變體在正常條件下，生長均受到嚴重影響，甚至出現(xiàn)致死表型；但是，提高CO2濃度可使突變體表型恢復正常［98-106］。雖然，研究突變體可解析光呼吸機理，但這并不能提供降低光呼吸的有效方法。大豆和小麥的大田試驗研究表明，光合速率增加的品種，其光呼吸效率也更高。因此可能無法僅利用光呼吸自然變異來發(fā)掘光呼吸水平較低而生產力較高的植物［107］。但對煙草光呼吸自然變異突變體研究發(fā)現(xiàn)，低光呼吸植株也可有較高的光合速率和生長率。這可能與過氧化物酶體中過氧化氫酶水平的升高有關，而不是與光呼吸水平降低相關，但該表型無法穩(wěn)定遺傳［108-110］。由此看出，天然光呼吸途徑改造較為復雜，需考慮較多因素。

水稻和小麥等C3植物，能夠捕獲和再同化光呼吸所釋放的CO2［111-112］，即其可在提高CO2利用率的同時而無需減少光呼吸速率，該策略可被用于高產作物的開發(fā)。另外，通過增加光呼吸通量以減少有毒中間產物2-PG和乙醇酸等的積累，可加快碳回收速率以使PGA重新進入C3循環(huán)，最終提高RuBP再生速度。比如，當過表達線粒體甘氨酸脫羧酶復合體L蛋白和H蛋白時，可分別導致植物光合和生長速率的增加，這可能得益于光呼吸通量的增加［104，113-115］。此外，當煙草暴露于高光呼吸脅迫條件下，過表達H蛋白可減少對PSⅡ的傷害［115］?？梢姡黾庸夂粑靠墒怪参锔玫貞獙Ω吖夂粑{迫，提高作物產量［115］。不難看出，對天然光呼吸途徑進行改造以增加CO2利用率，是光呼吸改造的重要思路之一［115-116］，但具體改造靶點和策略仍待探索。

2.3.2 新型光呼吸替代途徑的構建

光呼吸改造被認為是提高植物固碳能力的有效途徑之一［117］。由于光呼吸中間產物乙醇酸對細胞有毒性作用，所以新型光呼吸替代途徑的構建大都以乙醇酸為底物。目前，已有研究表明通過設計催化步驟，可以將乙醇酸轉化為其他生物質，同時將CO2重新釋放到葉綠體中（圖4），提高CO2濃度以增加Rubisco羧化速率［106，118-119］。

圖4 以增加葉綠體中CO2濃度為目的的光呼吸通路改造［106，118-119］Fig.4 Photorespiration pathway modification aimed at increasing CO2 concentration in chloroplasts[106,118-119]

South等［120］共設計了3條光呼吸替代 途 徑［圖4（a）］：途徑1與天然光呼吸途徑類似，將約75%的乙醇酸轉化進入了卡爾文循環(huán)，而CO2則釋放到葉綠體中；在途徑2和3中，乙醇酸則被完全氧化為CO2并直接釋放至葉綠體，同時在該過程中生成還原力。上述3條途徑，均促進轉基因植物的生長并提高了其生物量。Shen等［118］在水稻中利用乙醇酸氧化酶、草酸氧化酶和過氧化氫酶設計了新型光呼吸旁路，乙醇酸也被完全氧化為CO2，轉基因植物的光合效率和產量均有所提高［圖4（b）］。上述通路均無需能量損耗，可以實現(xiàn)CO2在葉綠體的直接利用。

將大腸桿菌乙醇酸代謝途徑導入植物體內，可使光呼吸中間產物乙醇酸完全轉化為甘油酸以進入卡爾文循環(huán)。該方法中，僅消耗少量ATP且可避免產生NH3，同時在Rubisco附近富集CO2［121-123］。該途徑已在擬南芥、馬鈴薯和亞麻薺等物種中進行了測試，結果表明轉基因植物的光合效率和生物量均有所提高。研究表明僅在植物中表達乙醇酸脫氫酶即可促進植物生長，無需引入整條途徑，而其深層機制則需進一步解析［121-123］。將GCL和羥基丙酮酸異構酶在煙草過氧化物酶體中表達時，可使光呼吸途徑繞過線粒體而直接將乙醛酸轉化為甘油酸。然而，羥基丙酮酸異構酶并未被成功定位到過氧化物酶體中，且轉基因植物的生長并未發(fā)生變化［124］。在細菌中，通過3-羥基丙酸途徑，可將乙醇酸轉化為丙酮酸［76］。在植物體內，該代謝途徑能否工作？能否在不釋放CO2前提下實現(xiàn)乙醇酸再利用，以提高植物光合效率？這些問題的探索，將有助于提高植物固碳效率。

此外，在植物葉綠體中引入乙醇酸氧化酶途徑，可使乙醇酸完全脫羧，理論上會增加Rubisco周圍的CO2濃度；從而起到減少Rubisco氧化反應，增加生物量的目的［125］。的確，當在擬南芥中引入乙醇酸氧化酶途徑時，可導致其生長速率增加［125］。但與天然光呼吸途徑相比，該替代途徑會消耗更多能量［126］，并且無法將磷酸甘油酸返還到碳循環(huán)過程，這暗示其中可能存在某些尚未被發(fā)現(xiàn)的作用機理［125，127］。由于乙醇酸氧化酶催化過程會伴隨過氧化氫的產生，因此可利用藻類乙醇酸脫氫酶代替乙醇酸氧化酶的功能［128-129］。

但不可避免的是，上述途徑改造所新產生的CO2，僅有部分可得到有效固定，仍存在固碳損失；因此，探索基于零CO2釋放、乙醇酸直接向乙酰輔酶A等生物質轉換的新型代謝通路，對于減少光呼吸碳損耗意義更為重大。Trudeau等［130］已成功設計了將乙醇酸還原為乙醇醛的兩步酶反應，并通過與天然酶進一步組合獲得了零CO2釋放的光呼吸旁路。Scheffen等［131］也通過開發(fā)一種新型的羥乙酰輔酶A羧化酶，并結合羥乙酰輔酶A合成酶和羥丙基二酰輔酶A還原酶，實現(xiàn)了零CO2釋放的乙醇酸到甘油酸的轉化。另外，Bar-Even［132］也提出另外兩個可能的光呼吸旁路，來避免光呼吸中的碳損失，仍有待于進一步探索。

通過阻斷植物天然光呼吸途徑，可以測試新型光呼吸旁路的轉化效率，使通路流量達到最大化。模型分析表明，只要光呼吸產生的乙醇酸全部進入旁路，可使轉基因植物光合效率提高約16%［126］。目前，可通過靶向RNA干擾、基因編輯等方法達到阻斷光呼吸通路的目的。同時，也很有必要在農業(yè)生產條件下，實際測試光呼吸旁路的效果，以達到提高作物產量的目的［24，115］。目前，利用快速克隆技術，可將整個代謝途徑相關基因克隆到單載體上，單次轉化完成轉基因過程［133-134］，這為測試代謝通路提供了技術保障。

2.3.3 利用計算機進行光呼吸代謝通量模型計算

利用計算機結合基因組工程和合成生物學技術進行代謝通量模型計算，簡化了光呼吸通路改造設計步驟。未經檢驗的新途徑也可以通過計算模型評估，節(jié)約人力財力，優(yōu)化實驗設計。

計算機模型預測的準確性取決于代謝路徑是否詳盡。目前，光呼吸酶功能的研究結果，絕大部分源于突變體和體外酶活分析［117，135］。加強體內代謝通量分析，能夠更好地理解光呼吸代謝，特別是在田間條件下對重要農業(yè)作物的分析［116，126，136-138］。隨著對光呼吸的不斷深入了解，有助于更好地確定光呼吸代謝對中心碳代謝的其他分支及對植物次生代謝途徑的影響。例如，C3植物可通過光呼吸生成絲氨酸，光呼吸途徑通過活性氧（ROS）信號通路，參與非生物和生物脅迫響應［139-140］。此外，在CO2濃度升高的條件下，光呼吸速率的降低對氮同化有負反饋作用。因此，光呼吸對植物氨基酸合成代謝十分重要［141］。光呼吸中間體參與其他代謝途徑，但尚不清楚這是植物功能的必要條件，還是陸生植物光呼吸循環(huán)進化的結果［142］。在許多條件下，Rubisco氧化作用的減少或完全抑制有利于C3植物的生長［143-144］。

2.4 光呼吸途徑改造后的應用

雖然CCM部分組分已被成功導入植物體中，但對Rubisco直接改造后的植物尚未得到廣泛應用［58-59］。先前研究表明，引入CCM碳酸氫鹽轉運體將對光合作用產生促進作用。計算模型表明，在作物體內導入藍藻碳酸氫鹽轉運體（BicA），可使光合效率增加9%；導入所有已知碳酸氫鹽轉運體，可使光合效率提高約16%［145］。將藻類CCM組分整合表達，包括在類囊體腔內表達碳酸酐酶、CAH3或在煙草葉綠體內膜共表達碳酸鹽轉運體、LCIA等，可獲得CO2吸收提高的轉基因材料，其光合效率和生物量也有所提高［146］。在C3作物中引入C4光合系統(tǒng)可增加Rubisco附近CO2濃度，但由于該過程復雜導致研究進展較慢。雖然已有向水稻成功轉入C4光合系統(tǒng)的報道［71］，但要實現(xiàn)C4水稻大規(guī)模生產還需要做出較大努力。

天然光呼吸途徑的改造較為復雜，需考慮較多因素。而新型光呼吸替代途徑的構建，被認為是提高植物固碳能力的有效途徑之一。在煙草［120］和水稻［118］中設計新型光呼吸旁路以增加乙醇酸利用率，可使植物的生長和生物量都有顯著提高，且固碳效率也進一步提高。在擬南芥、馬鈴薯和亞麻薺等物種中導入大腸桿菌乙醇酸代謝途徑后，轉基因植物的光合效率和生物量也均有所提高［121-123］。由此可見，新型光呼吸替代途徑的構建與導入，有望在提高植物固碳能力中發(fā)揮重要作用。

3 呼吸作用改造

3.1 植物呼吸作用

植物的呼吸作用和光呼吸過程中，均消耗O2釋放CO2。光呼吸只在光下進行，但呼吸作用在光照、黑暗中均可發(fā)生，光對線粒體呼吸作用的影響還存在爭議［147］。線粒體參與有氧呼吸過程的最后步驟：在有機酸氧化驅動下，通過氧化磷酸化產生大量的ATP，釋放CO2并將O2還原為水。此外，線粒體還參與了許多其他重要的細胞生理過程，如植物碳氮代謝、光合作用、氧化應激反應等。因此，呼吸作用對于維持植物基本代謝十分重要，通過抑制呼吸作用來減少CO2排放的操作難度較大，相關研究較少。

線粒體呼吸通過各種機制與光合作用、葉綠體功能聯(lián)系在一起：線粒體功能障礙會影響植物葉綠體的生物功能［148-149］；線粒體ETC是抗壞血酸生物合成的位點［150］，也是光合作用過程中過量還原當量的氧化位點［151］；TCA循環(huán)是氮同化過程中有機酸的來源［152］；光依賴的通過線粒體呼吸的甘氨酸氧化，對二磷酸核酮糖的光呼吸再生至關重要［135］。線粒體呼吸在植物對脅迫的反應中發(fā)揮著關鍵作用，它能夠提供ATP和還原劑，產生或吸收ROS，并且是次生代謝的碳中間體的來源［151］。呼吸機制在耐鹽［153］、耐旱［154］、耐溫［155］和病毒防御［156］中發(fā)揮著關鍵作用。隨著CO2水平的升高，植物線粒體呼吸相關基因表達增強，從而導致線粒體數量的增加和呼吸速率的升高，這可能會對植物生長及全球CO2水平的響應產生影響［157］。

呼吸作用可分解光合作用形成的葡萄糖并產生ATP，為植物體提供能量。糖酵解過程中，葡萄糖被分解為丙酮酸，丙酮酸被氧化形成乙酰輔酶A，并釋放出1分子CO2。乙酰輔酶A進入三羧酸途徑后，可被氧化生成CO2，并產生可用于線粒體電子傳遞鏈的還原劑。這些還原劑和檸檬酸循環(huán)中產生的琥珀酸被氧化后，會在線粒體內膜產生質子梯度，進而驅動ATP合成。植物線粒體呼吸可以分為4個部分：①三羧酸（TCA）循環(huán)負責有機酸的氧化脫羧作用，導致NADP和FAD的還原，以及ADP底物水平磷酸化形成ATP；②經典氧化磷酸化（OXPHOS）電子傳遞鏈，耦合NADH和FADH2氧化、氧的還原，以傳遞質子并進行氧化磷酸化；③電子傳遞鏈的非能量守恒旁路，交替氧化酶（AOX）和魚藤酮不敏感的2型NAD（P）H脫氫酶；④為這些過程提供底物和輔助因子的胞質內載體和通道，可促進呼吸產物釋放到細胞其余部分。

在經典的細胞色素介導的電子傳遞鏈（ETC）外，植物線粒體還具有一種非磷酸化（非能量節(jié)約）的呼吸電子傳遞途徑，將電子從NAD（P）H傳遞到氧，該途徑在氰化物和魚藤酮（COX和CI的有效抑制劑）存在時仍具有功能。對氰化物不敏感的呼吸作用是由交替氧化酶（AOX）介導的，該分支可催化UQH2的氧化，在不發(fā)生質子轉移的情況下將O2還原為水。AOX在植物線粒體中起抗氧化作用，在大多數植物中由多個基因編碼，可分為AOX1型和AOX2型［158］。

吡啶核苷酸［NAD（P）H/NAD（P）+］和腺嘌呤核苷酸（ATP/ADP）庫與呼吸代謝密切相關，因為NAD（P）H氧化通常與ATP形成相耦合，NAD（P）H氧化和ATP形成之間的緊密耦合會導致代謝失衡，進而對碳代謝和線粒體功能產生負面影響［159-161］。AOX提供了一種減少代謝失衡的機制，因為它減弱了NAD（P）H氧化和ATP形成之間的緊密耦合。如果氧化還原劑和/或消耗碳水化合物的呼吸需求大于產生額外ATP的需求，那么增加AOX介導的呼吸作用即可滿足需求。另一方面，通過將電子流從AOX轉移到Cyt氧化酶，可以滿足ATP增加的需求，而不必增加碳氧化速率或還原力的周轉。

AOX呼吸會降低mETC產生ROS［153，162-163］和一氧化氮［164］的速率。敲除或過表達AOX可引起細胞清除ROS能力的改變［162，165-167］，并改變ROS誘導的大分子氧化修飾的數量［168-170］。應激條件影響線粒體功能，從而影響mETC生成ROS的速率［171］。反過來，這些ROS作為信號分子，將線粒體功能方面的信息傳遞給細胞的其他部分，以誘導有益的反應，涉及核基因表達的變化［171-172］。由于AOX影響線粒體ROS的生成，其活性可能影響線粒體的應激信號功能。例如煙草與病原菌Pseudomonas syringae［173］的 相 互作 用。煙 草 對P.syringaepv.maculicola的反應中，線粒體基質中的持續(xù)升高，隨后是防御基因表達的改變和超敏反應（HR）導致細胞死亡。此外，病原體P.syringaepv.phaseolicola感染AOX敲減株系會引起爆發(fā)，類似于感染P.syringaepv.maculicola的情況［173］。說明在細胞應激反應中，AOX影響線粒體ROS信號的生成。

3.2 呼吸作用改造應用

呼吸作用對植物基礎代謝尤為重要，對其進行改造的操作空間較小。表面上看，AOX呼吸是對能量和碳資源的浪費，但敲減AOX對整個植物生長產生影響，這與生長階段、環(huán)境條件和植物種類等相關。正常生長條件下，AOX改變通常不會造成明顯的生長變化［174-179］。抑制AOX可略微改善生長［180-182］，而過表達AOX會輕微降低生長［153，181-182］。另外，在脅迫條件下（如缺水、滲透脅迫、高鹽、低溫），AOX含量的變化往往顯著影響植物生長。在這些情況下，抑制AOX對生長有負 面 影 響［174，178］，而 過 表 達AOX則 有 積 極 影響［153，174-175，177-179，181，183］。除 了 對 生 長 的 影 響 外，AOX提高了植物從嚴重水分脅迫［162，184］或其他脅迫條件中恢復的能力［185-187］。此外，AOX影響生長的原因，可能源于它與光合作用之間存在相互作用。煙草在長期適度水分缺乏的條件下，AOX敲減株系的固碳率和生長速率顯著降低，而AOX過表達株系的固碳速率顯著提高［178］。這說明，AOX對光合代謝的有利影響明顯超過了呼吸產能降低所造成的生長勢損失。由此可見，對AOX呼吸途徑進行調控，可改善植物CO2固定能力。

4 未來展望

4.1 光合固碳改造

在植物體系中，通過過表達某些蛋白，可以促進光合作用和生長；而PSⅠ可以通過與相關成分偶聯(lián)，產生有價值的化合物，如氫或電。此外，整個光合復合物也可在異養(yǎng)生物中表達，構建自養(yǎng)-異養(yǎng)雜合生物。未來仍需要解決的問題包括：①提高體內光合系統(tǒng)組分與其他相關成分偶聯(lián)的效率；②拓展光合模塊，以覆蓋整個光系統(tǒng)或開發(fā)復雜天線系統(tǒng)。

單細胞真核綠藻與高等植物進化關系密切，具有葉綠體和完整的光合作用。因此，利用微生物系統(tǒng)中典型的高進化速率，通過選擇有利的遺傳變異來微調和優(yōu)化光合過程是未來工作的重要方向。將整個多蛋白復合物在遠親物種之間進行轉移，需要合成更大的光合模塊并確定大量輔助因子［44］。在未來工作中，可結合不同物種的光合模塊，設計出新的光合作用變體（圖5）。使攜帶藍藻衍生藻膽體的植物，在弱光條件下即可進行光合作用；或使藍藻利用高等植物衍生的LHC作為天線來吸收利用強光，也可將藍藻葉綠素d和f（可以吸收遠紅外和近紅外光）整合到藻類或植物的光合系統(tǒng)中，以擴展驅動光合作用的可用光譜區(qū)域［188-189］。

4.2 光呼吸途徑改造

基因組工程和合成生物學為改變光呼吸提供了新方法，結合合成生物學技術，使用系統(tǒng)工程方法來概念化、設計、構建和測試多種新型光呼吸代謝通路，有望提高作物產量（圖5）。利用計算機進行代謝通量模型計算，簡化了光呼吸通路改造設計步驟。計算模型表明，源于大腸桿菌的乙醇酸氧化途徑，有望增加高達16%的光合效率和生物量，尤其是在天然光呼吸途徑通量減少或消除的情況下［126］。此外，計算模型還可用于評估未經檢驗的新途徑，包括對光呼吸等途徑進行模擬操作，也可提供意想不到的效果。

圖5 植物碳代謝改造潛在靶點圖示（光合固碳改造；光呼吸途徑改造；：呼吸作用途徑改造）1—天然光合作用元件改造；2—外源蛋白導入以優(yōu)化光合效率；3—Rubisco優(yōu)化設計以提高其羧化能力；4—增加CO2供給能力；5—天然光呼吸途徑的改造或新型光呼吸替代途徑的構建；6，7—增加光呼吸通量或代謝中間產物再利用；8—呼吸作用途徑改造（AOX調整）Fig.5 Schematic diagram of potential targets for carbon metabolism modification in plants(Photosynthesis modification;Photorespiration modification;Respiration modification)1—Modification of natural photosynthetic elements;2—Exogenous protein are introduced to optimize photosynthetic efficiency;3—Rubisco optimization design to improve its carboxylation capacity;4—Increase CO2 supply capacity;5—Reconstruction of natural photorespiration pathway or construction of alternative pathway for new photorespiration;6,7—Increase photorespiration flux or reuse of metabolic intermediates;8—Modification of respiratory pathway(AOX adjustment)

在計算機中建立光呼吸模型，生成大型數據集及大量標準化部件庫，便于設計光呼吸途徑來提高作物產量。越來越多的基因組信息，將為探索天然光呼吸途徑的遺傳多樣性和潛在的可塑性提供幫助。為充分了解光呼吸作用的變化如何影響植物生長，還需要清楚數據來源物種?？傊?，目前優(yōu)化光呼吸的努力已初顯成效。這些結果通過進一步優(yōu)化后，最終將從模式生物轉移到目標作物，并在一系列相關的農業(yè)環(huán)境下進行評估。

4.3 呼吸作用途徑改造

植物線粒體呼吸也是碳代謝的重要一環(huán)，但是線粒體呼吸通過各種機制與光合作用和葉綠體功能復雜地聯(lián)系在一起，而且線粒體呼吸在植物對脅迫的反應中發(fā)揮著關鍵作用，一味盲目地抑制線粒體呼吸可能會抑制植物生長甚至直接導致植物死亡。因此，以線粒體呼吸為目標進行遺傳操作來提高植物固碳效率的研究遠不如光合或光呼吸的研究多，且更多聚焦于AOX的抗性功能。

4.4 植物固碳改造可能發(fā)展方向與挑戰(zhàn)

通過上述分析可以發(fā)現(xiàn)：呼吸作用對植物基礎代謝尤為重要，對其進行改造的操作空間較小。相比而言，光合作用及光呼吸路徑改造則有更大提升空間。尤其是縮短光呼吸代謝步驟、提高光呼吸代謝中間產物利用率等可操作性強，是提高植物固碳效率的重要突破點（表1）。

表1 植物固碳改造策略與效果Tab.1 Modification strategies for plant carbon sequestration and their effects

在大多數的光呼吸途徑改造中，多采用傳統(tǒng)的基因工程方法（如基因突變、單基因轉化等）。但改造效果較難準確評估，往往在實驗后期才可判斷其實驗效果。而合成生物學的快速進展，正在為光呼吸改變提供新的思路?；诤铣缮飳W思路，采用系統(tǒng)工程方法來設計、構建和測試新型光呼吸替代通路，將在較大幅度上提高改造效率。

同時，不可否認的是，現(xiàn)有固碳改造相關研究多以模式植物為對象，其成果究竟能否在大田作物和經濟作物上應用，仍待進一步探索。除了要考慮各種植物遺傳背景的不同外，氣候變化的影響也應充分考慮在內。考慮到大規(guī)模作物培養(yǎng)的條件，遠不如實驗室精細。因此，對環(huán)境條件要求寬松的研究成果，可能會有更廣闊的應用前景。

4.5 合成生物學快速發(fā)展將促進植物固碳改造

合成生物學將工程原理與分子生物學相結合，提供了設計和構建生物部件的能力。這使得標準化零件成為可能，可快速組裝構建，以便在生物系統(tǒng)中進行測試。第1套標準化的生物部件是BioBricks，主要設計用于原核生物代謝工程。Golden Gate、Golden Braid以及其他類似克隆技術可為植物合成生物學提供標準化部件［190-194］。植物合成生物學的局限性來自于代謝物與基因組的復雜且高度有序的調控，導致不可預見的未知因素較多。為優(yōu)化植物合成生物學的設計部分，需要研究不同候選基因、啟動子及啟動子調控等。使用不同的啟動子，可以防止同源依賴的基因沉默，這種沉默可能是由于多次使用一個組成型啟動子后導致的［195-197］。此外，這種預先設計可以測試一系列啟動子的強度。利用工程循環(huán)原理和機器學習，從多輪優(yōu)化中獲得的信息更加全面準確。

隨著合成生物學的快速發(fā)展，新途徑設計水平不斷提升。這可以部分解決天然固碳途徑存在的缺陷，使得人工生物固碳效率顯著提升，是當前合成生物學研究的熱點。未來通過新途徑設計改造與優(yōu)化，持續(xù)提升人工生物固碳效率。這對于解決環(huán)境、能源、糧食等重大問題，實現(xiàn)可持續(xù)綠色生物制造進程等具有重要的理論和實踐價值。