王松，吳莎，2，江亞男，胡章立，3

（1深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東省海洋藻類工程技術(shù)研究中心，廣東 深圳 518055；2深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院，廣東 深圳 518060；3南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（廣州），廣東 廣州 511458）

國家主席習(xí)近平在2021年出席領(lǐng)導(dǎo)人氣候峰會時(shí)發(fā)表了題為《共同構(gòu)建人與自然生命共同體》的重要講話，正式宣布：中國將力爭2030年前實(shí)現(xiàn)碳達(dá)峰、2060年前實(shí)現(xiàn)碳中和。這是中國基于推動構(gòu)建人類命運(yùn)共同體的責(zé)任擔(dān)當(dāng)和實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的內(nèi)在需求做出的重大戰(zhàn)略決策。中國承諾實(shí)現(xiàn)從碳達(dá)峰到碳中和的時(shí)間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于發(fā)達(dá)國家所用時(shí)間，需要中方付出艱苦努力。與其他固碳方式相比，自養(yǎng)生物利用太陽能進(jìn)行光合作用固定CO2的方式，具有低成本、環(huán)保且可持續(xù)等優(yōu)勢，受到極大的關(guān)注［1］。地球上全部綠色植物和藻類的生長都依賴光合作用進(jìn)行，而光合作用固定CO2合成有機(jī)物是地球上最重要的無機(jī)碳轉(zhuǎn)化為有機(jī)碳反應(yīng)，是全球碳循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其中浮游生物對全球碳循環(huán)具有重要影響［2］，僅硅藻就貢獻(xiàn)了海洋中40%的初級生產(chǎn)力，是海洋食物網(wǎng)的基礎(chǔ)［3］。

目前，全球每年CO2總排放量約1/2被藻類通過光合作用固定為有機(jī)物［4］。同陸地高等植物相比，微藻光合固碳具有諸多獨(dú)特優(yōu)勢：首先，與植物相比，微藻光合作用效率更高且生長速率更快［5］；其次，微藻培養(yǎng)不占用耕地和淡水資源，甚至可以利用廢水和工業(yè)煙氣培養(yǎng)［6］。微藻中碳元素含量接近50%，主要來源于固定的CO2，生產(chǎn)1 kg微藻生物質(zhì)（干重）可以固定約1.8 kg CO2［7］。更重要的是，產(chǎn)生的微藻生物質(zhì)被視為生物能源和生物化工產(chǎn)品的可持續(xù)來源，通過生物精煉的概念最大化微藻生物質(zhì)資源的價(jià)值逐漸成為世界范圍內(nèi)的研究熱點(diǎn)［8］。微藻生物質(zhì)含有多種具有藥用和營養(yǎng)價(jià)值的生物活性物質(zhì)，例如多不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、維生素等；微藻生物質(zhì)還可以用來生產(chǎn)多種生物能源作為化石能源的替代，例如生物氫氣、生物乙醇以及生物柴油等［9-10］。此外，微藻不但是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的天然餌料，同時(shí)可作為人類食品的高質(zhì)量蛋白來源，緩解糧食安全問題［11-12］。然而，微藻的規(guī)?；囵B(yǎng)和商業(yè)化應(yīng)用仍面臨實(shí)際產(chǎn)量低、培養(yǎng)成本高等挑戰(zhàn)［13-14］。微藻通過光合作用合成生物質(zhì)過程中的太陽能利用效率理論最大值為8%～10%［15-16］，在葉片溫度為30°C、CO2濃度為387 mL/m3條件下，C3和C4植物太陽能轉(zhuǎn)化率的理論最大值分別為4.6%和6%［17］。但多數(shù)情況下，實(shí)驗(yàn)室中微藻連續(xù)培養(yǎng)的實(shí)際光能利用率僅為3%左右，而規(guī)模化培養(yǎng)的轉(zhuǎn)換率甚至更低［15］。這說明微藻培養(yǎng)遠(yuǎn)未發(fā)揮其光合潛力，微藻無論是光合固碳能力還是培養(yǎng)技術(shù)的潛力仍具有巨大的優(yōu)化空間。

本文首先綜述了近幾年國內(nèi)外科研人員在改造微藻光合作用不同階段（光反應(yīng)和暗反應(yīng)階段）取得的研究進(jìn)展，并深入討論和分析了目前實(shí)施策略的限制和瓶頸問題；然后，結(jié)合高等植物光合作用優(yōu)化與改造的研究報(bào)道，探討優(yōu)良光合元件挖掘、調(diào)控光合作用的轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）和microRNA篩選以及新途徑構(gòu)建等方案進(jìn)一步提升微藻光合能力的可行性；最后，本文提出利用合成生物學(xué)方法和概念，以微藻作為光合固碳底盤生物，通過外源代謝途徑導(dǎo)入和背景代謝網(wǎng)絡(luò)改造，設(shè)計(jì)構(gòu)建微藻高效固碳工程株的技術(shù)流程。

1 微藻光合作用光反應(yīng)階段優(yōu)化

圖1是微藻光反應(yīng)階段示意圖［18-19］。同高等植物相似，微藻通過不同類型的捕光天線（捕光復(fù)合體）捕獲光能，傳導(dǎo)至光系統(tǒng)Ⅱ的反應(yīng)中心，氧化水釋放氧氣，產(chǎn)生氫離子和電子，并最終產(chǎn)生ATP和NADPH。光系統(tǒng)Ⅱ和Ⅰ之間存在電子傳遞鏈，其中包含質(zhì)體醌（plastoquinone）和細(xì)胞色素體b6f（Cyt b6f）等電子受體［20］。截短捕光天線和提高光能利用效率是目前針對微藻光反應(yīng)階段改造最常用的手段。在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，通過以上方法可以篩選得到光合作用速率和生物量積累水平升高的轉(zhuǎn)化株。

圖1 微藻光合作用光反應(yīng)階段及優(yōu)化策略［18-19］Fig.1 Strategies for modifications of light-dependent reactions in microalgal photosynthesis[18-19]

1.1 截短捕光天線

光反應(yīng)階段面臨的主要挑戰(zhàn)是在光飽和條件下，捕光速率遠(yuǎn)高于能量轉(zhuǎn)化速率造成的速率不匹配。據(jù)估計(jì)，在最大太陽光強(qiáng)度條件下，天線捕光的速率是電子傳遞過程中限速步驟（細(xì)胞色素b6f復(fù)合體氧化質(zhì)體醌醇）的10倍以上［21-23］。這導(dǎo)致很大一部分（80%以上）捕獲的光能沒有進(jìn)入光化學(xué)反應(yīng)，而是以熱能和熒光的形式浪費(fèi)，其中以熱能形式消散過多光能的過程被稱為非光化學(xué) 猝 滅（nonphotochemical quenching，NPQ）［24］。NPQ是植物和微藻進(jìn)化的一種光保護(hù)機(jī)制，以保護(hù)細(xì)胞光合器官免受過多光能造成的損傷。在水域環(huán)境中光照不足通常是微藻生長的限制條件，為了應(yīng)對光照不足，微藻進(jìn)化了強(qiáng)大的光捕獲系統(tǒng)［25］。在改造高等植物和微藻光合作用的工作中，廣泛使用的方法之一是截短光系統(tǒng)Ⅱ和Ⅰ周圍的捕光天線，其原理在于減少光能捕獲，從而緩解光能和電子轉(zhuǎn)移效率的不匹配。微藻的捕光天線由不同類型的捕光復(fù)合體構(gòu)成，因此調(diào)控捕光復(fù)合體的手段多樣，效果不一。例如，綠藻中捕光復(fù)合體主要由葉綠素a/b、類胡蘿卜素和捕光復(fù)合體 蛋 白（LHC）構(gòu) 成［26］，而 硅 藻 捕 光 復(fù) 合 體（fucoxanthin-chlorophyll-protein，F(xiàn)CP）主要由葉綠素a/c、巖藻黃素和蛋白構(gòu)成［27］；藻膽體是原核藍(lán)藻中的捕光復(fù)合體，捕光復(fù)合體位于類囊體的膜上［28-29］。

Polle等［30］通過DNA插入誘變的方式，結(jié)合葉綠素?zé)晒夂腿~綠素a/b比例兩個(gè)表征，篩選得到萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）捕光天線顯著縮小的突變體Tla1。進(jìn)一步表型分析結(jié)果顯示，Tla1與野生株相比，葉綠素和天線蛋白含量顯著降低，但單位葉綠素的光合放氧率、光飽和放氧速率以及光飽和點(diǎn)顯著高于野生株［30］。這些表型特點(diǎn)在模擬室外環(huán)境條件的培養(yǎng)過程中同樣得到保持［30］。Mussgnug等［28］利用細(xì)胞中不同類型的捕光復(fù)合體蛋白同源性較高這一特點(diǎn)，通過RNA干擾（RNAi）技術(shù)靶向捕光復(fù)合體蛋白基因的保守區(qū)域。篩選得到的萊茵衣藻突變體Stm3LR3細(xì)胞內(nèi)所有捕光復(fù)合體蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平下調(diào)，同時(shí)伴隨著葉綠體類囊體結(jié)構(gòu)變化［28］。在815 μmol/（m2·s）的光照強(qiáng)度下，Stm3LR3和對照組相比，光合量子效率提高了80%以上；即使在可以誘導(dǎo)光抑制的高光照強(qiáng)度下［1400 μmol/（m2·s）］，Stm3LR3與對照組相比仍保持了較高的光合放氧水平，顯示了其對光抑制的低敏感性［28］。萊茵衣藻中脫植基葉綠素a加氧酶（chlorophyllide a oxygenase，CAO）負(fù)責(zé)催化葉綠素a氧化生成葉綠素b［31-32］。Perrine等［33］通過RNAi技術(shù)使萊茵衣藻CAO的表達(dá)水平下調(diào)，從而降低葉綠素b含量的方式調(diào)控天線大??；對比分析結(jié)果顯示，葉綠素b含量降低的轉(zhuǎn)基因藻株光合放氧速率顯著高于野生株，并且光照強(qiáng)度越強(qiáng)，差異越顯著。

除了DNA插入誘變和遺傳改造的方法外，最近的綜述詳細(xì)總結(jié)了獲得捕光天線截短突變體的不同方法［34］。利用UV、化學(xué)誘變、CRISPR/CAS9基因編輯等方法獲得的突變體在特定環(huán)境條件下展現(xiàn)出更高的光合效率和生物量產(chǎn)率，但同時(shí)也有部分突變體并沒有展現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢［34］。雖然截短捕光天線的方案可以在一定程度上緩解捕獲光能和電子傳遞速率的不匹配以及藻細(xì)胞之間的遮擋效應(yīng)［30］，但缺點(diǎn)也同樣顯著。捕光天線具有保護(hù)光合系統(tǒng)免受光抑制的功能，截短的天線可能使微藻更容易受到高光強(qiáng)造成的光損傷。還可以進(jìn)一步推測，截短的天線導(dǎo)致用于清除自由基的類胡蘿卜素含量降低，繼而導(dǎo)致藻細(xì)胞應(yīng)對脅迫條件（高溫、高鹽甚至是敵害生物）能力的下降。因此在規(guī)?；囵B(yǎng)捕光天線截短藻株的過程中要嚴(yán)格控制光生物反應(yīng)器（photobioreactor，PBR）的入射光照條件，這極大限制了藻株的應(yīng)用范圍。然而，利用太陽光能進(jìn)行戶外培養(yǎng)的過程中，光照條件一直變化。在近期的研究中，Negi等［21］利用一種光調(diào)控的基因表達(dá)翻譯抑制因子NAB1，實(shí)現(xiàn)了根據(jù)外界光照條件動態(tài)調(diào)控捕光天線的過程，具有較大的應(yīng)用價(jià)值。研究人員重新設(shè)計(jì)了萊茵衣藻CAO基因，插入可以與NAB1結(jié)合的光響應(yīng)域；高光條件下，NAB1與CAO的mRNA結(jié)合抑制其翻譯，干擾CAO表達(dá)，從而影響葉綠素b的合成；而在低光條件下，NAB1對葉綠素b正常合成途徑的干擾降低［21］。通過這種方法得到的轉(zhuǎn)化株與對照組相比，光合放氧率、不同光照條件下的葉綠素a/b比例以及生物量積累水平均顯著提高［21］。以上研究結(jié)果證明，根據(jù)變化的光照條件動態(tài)調(diào)節(jié)天線的策略，可以更靈活地適應(yīng)光照變化的戶外環(huán)境。另外，在光照條件不佳的情況下，捕光能力的降低有可能成為生長的負(fù)影響因子，而實(shí)際上光照不足的情況在戶外規(guī)?；囵B(yǎng)過程中非常常見。

1.2 增加捕光能力和光能利用率

如上文所述，光照不足通常是依賴太陽光作為唯一光源培養(yǎng)方式的限制因子，例如跑道池培養(yǎng)。同樣，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行高密度微藻養(yǎng)殖的過程中，當(dāng)微藻密度較高時(shí)，遮擋效應(yīng)下的細(xì)胞得到的光能不足，抑制生物質(zhì)的進(jìn)一步積累［35］。因此，增加微藻的捕光能力和吸收光能的利用效率，更有利于促進(jìn)生物量積累。

微擬球藻（Nannochloropsis）作為一種極具應(yīng)用價(jià)值的經(jīng)濟(jì)藻種，屬于不等鞭毛藻門，其質(zhì)體起源于二次內(nèi)共生［36］。微擬球藻捕光天線中的光合色素主要由葉綠素a和類胡蘿卜素構(gòu)成，不含葉綠素b/c，區(qū)別于綠藻門微藻和同屬于不等鞭毛藻 門 的 硅 藻［37-38］。Koh等［38］通 過 在 微 擬 球 藻（Nannochloropsis salina）中異源表達(dá)萊茵衣藻CAO基因，首次實(shí)現(xiàn)了葉綠素b在微擬球藻中的合成；在90 μmol/（m2·s）光照條件下，轉(zhuǎn)化株和野生株相比光合作用效率和生物量顯著提高；分析結(jié)果還顯示，轉(zhuǎn)化株中與光合作用相關(guān)的蛋白含量、電子傳遞效率和量子產(chǎn)率均顯著提升。Fu等［39］提出了一種胞內(nèi)光譜重排的方法，通過在三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）中表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescence protein，eGFP），將利用率較低的高能藍(lán)光在胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為綠光，借助硅藻捕光復(fù)合體中巖藻黃素高效利用藍(lán)綠光的特點(diǎn)提高光能利用率；雖然在實(shí)驗(yàn)室低光條件下［50 μmol/（m2·s）］轉(zhuǎn)化株與野生株生長表現(xiàn)差別不大，但在高光條件下［200 μmol/（m2·s）］，表達(dá)了eGFP的三角褐指藻轉(zhuǎn)化株光合作用效率和光系統(tǒng)Ⅱ有效量子產(chǎn)量與野生株相比分別提升了30%和18%；模擬室外開放環(huán)境條件下培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化株光合作用效率和生長提升50%以上，顯示了良好的促進(jìn)生長效果。巖藻黃素主要負(fù)責(zé)吸收藍(lán)綠光，可以與葉綠素a/b的吸收光譜互補(bǔ)，但巖藻黃素的胞內(nèi)合成途徑以及與天線蛋白組裝構(gòu)成FCP復(fù)合體的機(jī)制尚不完全清晰，這阻礙了巖藻黃素在其他藻種中的異源表達(dá)［40］。

可以看出，目前針對微藻光反應(yīng)階段的調(diào)控主要通過優(yōu)化光反應(yīng)階段的捕光能力，而針對光反應(yīng)階段核心元件（光系統(tǒng)Ⅱ、光系統(tǒng)Ⅰ以及ATP合成酶等）和電子傳遞鏈的改造升級研究較少。Gimpel等［41］敲除了6個(gè)萊茵衣藻葉綠體基因組中光系統(tǒng)Ⅱ的核心基因，然后利用來源于其他藻種的光系統(tǒng)Ⅱ合成模塊完成了敲除藻株的光合作用功能互補(bǔ)；雖然只有部分光合作用活性得到恢復(fù)，但這證明通過合成生物學(xué)手段改造微藻光反應(yīng)階段核心元件的可行性。

2 微藻光合作用暗反應(yīng)階段優(yōu)化

微藻光合作用暗反應(yīng)階段（light-independent reactions），主要利用還原性戊糖磷酸途徑［（reductive pentose phosphate pathway），也 稱 為Calvin-Benson-Bassham循 環(huán)（CBB cycle）］實(shí) 現(xiàn)CO2固定。CBB循環(huán)主要包括CO2羧化、羧化產(chǎn)物還原和受體再生3個(gè)階段，共由11個(gè)酶催化完成（圖2）［42-43］。

圖2 微藻光合作用暗反應(yīng)階段及優(yōu)化策略［42-43］Fig.2 Strategies for modifications of light-independent reactions in microalgal photosynthesis[42-43]

2.1 改造核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶

在CBB循環(huán)中，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，Rubisco）負(fù)責(zé)催化1分子CO2與1分子Ribulose-1，5-bisphosphate（RuBP）反應(yīng)，生成2分子的3-磷酸甘油酸酯（3-phosphoglycerate）［44］，這被認(rèn)為是整個(gè)循環(huán)的限速步驟。Rubisco是生物圈最豐富的蛋白質(zhì)，構(gòu)成了無機(jī)碳和生命有機(jī)物的橋梁［44-46］，但同時(shí)Rubisco也被認(rèn)為是一個(gè)非常低效的催化劑，主要有以下兩個(gè)原因：（1）Rubisco對CO2和O2的底物區(qū)分性不高，導(dǎo)致催化羧化反應(yīng)的活性會受到其加氧酶活性的干擾（以O(shè)2作為底物），氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物需要通過耗能的光呼吸過程進(jìn)行回收利用。光呼吸過程同時(shí)還會造成已經(jīng)固定的CO2和NH3的丟失和浪費(fèi)，據(jù)估計(jì)，光呼吸過程可以使固碳作用降低50%［44］。（2）Rubisco催化羧化反應(yīng)的效率極低，據(jù)估計(jì)每秒每個(gè)Rubisco分子只可以催化2～4個(gè)CO2分子固定［47］。因此，在高等植物中Rubisco同樣被作為光合作用改造的首要目標(biāo)，得到了極大的關(guān)注和研究。藍(lán)藻、硅藻和綠藻中的Rubisco結(jié)構(gòu)非常類似，由8個(gè)大亞基和8個(gè)小亞基構(gòu)成［48］。綠藻Rubisco的大亞基和小亞基基因分別存在于葉綠體和核基因組中［49］，而硅藻大、小亞基編碼基因都位于葉綠體基因組中［50］。

微藻一直被視為優(yōu)良的Rubisco“供體”，利用微藻源Rubisco替代高等植物中的Rubisco被視為提高高等植物光合作用效率和生物量的潛在手段［45］。然而，由于Rubisco復(fù)雜的組裝機(jī)制，微藻源Rubisco在植物中異源表達(dá)并沒有取得令人滿意的結(jié)果［45，51］。Lin等［45］優(yōu)化了植物Rubisco改造的方法，將細(xì)長聚球藻（Synechococcus elongatusPCC7942）大、小亞基因分別與伴侶分子和羧化體蛋白結(jié)合后，轉(zhuǎn)入敲除了本體Rubisco大亞基基因的煙草中進(jìn)行異源表達(dá)；篩選得到的兩株轉(zhuǎn)化株可以正常進(jìn)行光合作用，這說明微藻Rubisco可以在煙草中正常組裝；雖然轉(zhuǎn)化株Rubisco含量和生長顯著低于野生株，但在不同CO2濃度下轉(zhuǎn)化株表現(xiàn)出更高的單位Rubisco CO2固定效率，并且CO2濃度越高差異越明顯。Orr等［52］實(shí)現(xiàn)了細(xì)長聚球藻大亞基在煙草葉綠體中的異源表達(dá)，結(jié)果表明，聚球藻大亞基可以和煙草小亞基形成雜合酶進(jìn)行光合作用，但在高濃度CO2條件下，轉(zhuǎn)化株的生長受到抑制。另外，研究發(fā)現(xiàn)磷酸糖類有可能和Rubisco的活性區(qū)域結(jié)合，抑制Rubisco活性，需要Rubisco活化酶（Rubisco activase）重新激活［53］。Wei等［54］在微擬球藻（Nannochloropsis oceanica）中推測了一個(gè)可能的Rubisco激活酶基因，該基因的轉(zhuǎn)錄水平在低濃度CO2條件下上調(diào)，在高濃度CO2（5%）條件下下調(diào)；在空氣CO2濃度條件下，Rubisco激活酶過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因藻株和野生株相比，生長率和光系統(tǒng)Ⅱ最大量子效率提高了約30%，生物量和Rubisco大亞基含量分別提高了46%和45%；然而，在高濃度CO2條件下，差異并不顯著。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Rubisco激活酶也是潛在的優(yōu)化目標(biāo)。

雖然Rubisco作為CBB循環(huán)中最主要的限速酶，但微藻中針對Rubisco的改造嘗試目前十分有限，即使在高等植物中針對Rubisco的改造效果也不理想。這主要有以下幾個(gè)原因：①Rubisco的生物發(fā)生過程復(fù)雜，蛋白折疊和組裝過程受到多個(gè)因子調(diào)控，例如分子伴侶［55］、輔助蛋白和裝配因子；②Rubisco的催化活性受到Rubisco活化酶和抑制因子的調(diào)控［56］；③Rubisco存在羧化速率與CO2底物親和性的權(quán)衡，例如藍(lán)藻Rubisco的特點(diǎn)是催化速率較快，但CO2的底物特異性較低［57］。因此，挖掘不同來源的Rubisco，再通過合成生物學(xué)手段合成、組裝成一個(gè)羧化效率高且對CO2底物特異性高的新Rubisco，可以進(jìn)一步提高微藻的固碳效率。但需要注意的是，Rubisco的活性受到一些輔助因子的調(diào)控，因此匹配的輔助因子同樣必不可少。

2.2 改造CBB循環(huán)其他關(guān)鍵酶

景天庚酮糖-1，7-二磷酸酯酶（sedoheptulose-1，7-bisphosphatase，SBPase）和果糖-1，6-二磷酸酯酶（fructose-1，6-bisphosphatase，F(xiàn)BPase）參與CBB過程中RuBP的再生，同樣被視為潛在的優(yōu)化目標(biāo)。通過提高SBPase表達(dá)水平增加光合作用效率和生物量產(chǎn)率的方法已在多種作物中被驗(yàn)證。Fang等［58］在鹽藻（Dunaliella bardawil）中異源表達(dá)來自衣藻的SBPase，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化株光合放氧速率的增加，并伴隨著甘油含量的升高。在最近的研究中，Hammel等［59］利用合成生物學(xué)模塊克隆的方法（Gibson組裝）構(gòu)建了衣藻SBP1的表達(dá)體系，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率，萊茵衣藻轉(zhuǎn)化株與野生株相比光合放氧速率顯著升高。裸藻（Euglena gracilis）可以大量積累β-1，3-葡聚糖，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，Ogawa等［60］在裸藻葉綠體中成功表達(dá)了藍(lán)藻果糖-1，6-/景天庚酮糖-1，7-二磷酸酯酶（fructose-1，6-/sedoheptulose-1，7-bisphosphatase，F(xiàn)BP/SBPase）；結(jié)果顯示，在高光［350 μmol/（m2·s）］和高濃度CO2條件下，轉(zhuǎn)基因藻株的光合放氧速率和葉綠素含量均顯著增加，最大生物量濃度高達(dá)野生株的2倍，同時(shí)伴隨著細(xì)胞體積的明顯增大。研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)了集胞藻FBPase的小球藻（Chlorella vulgaris）轉(zhuǎn)化株與對照組相比表現(xiàn)出顯著升高的生物量濃度、CO2固定效率以及光系統(tǒng)Ⅱ有效量子產(chǎn)率；此外，F(xiàn)BPase過表達(dá)雖然可以提高其他CBB相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄水平，但是酶活性并沒有顯著變化，這說明CBB還存在其他的調(diào)控機(jī)制［61］。在聚球藻（Synechococcus7002）中過表達(dá)BiBPase，同樣可以提高轉(zhuǎn)化株的生長率和光合放氧率，同時(shí)進(jìn)一步分析顯示，光合作用和碳代謝相關(guān)的基因表達(dá)水平也相應(yīng)提高，并且碳流的分配發(fā)生了調(diào)整［62］。

然而，過表達(dá)FBPase的效果并不一致。Dejtisakdi和Miller［63］利用葉綠體表達(dá)體系在萊茵衣藻葉綠體中過表達(dá)核編碼的FBPase基因，轉(zhuǎn)化株中FBPase表達(dá)量和活性分別達(dá)到野生株的4倍和1.4倍，然而在不同環(huán)境條件下的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化株同野生株相比生物量積累被顯著抑制；作者推測這可能是由于FBPase的過量表達(dá)導(dǎo)致用于碳水化合物合成的代謝產(chǎn)物甘油醛-3-磷酸（glyceraldehyde-3-phosphate，G3P）含量減少，影響了生物量積累。與Rubisco復(fù)雜的合成和組裝機(jī)制相比，針對CBB循環(huán)中其他關(guān)鍵酶單一基因的遺傳改造和優(yōu)化更容易取得理想的結(jié)果，更具操作性?？傮w上，CBB循環(huán)除了利用了一個(gè)非常低效的CO2固定酶，同時(shí)CBB循環(huán)還不耐受高溫，因此構(gòu)建一個(gè)額外的固碳途徑作為CBB循環(huán)的補(bǔ)充，可能會發(fā)揮更大的固碳作用［64］。

2.3 構(gòu)建光呼吸支路

Rubisco的氧合作用會產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物2-磷酸乙醇酸（2-phosphoglycolate，2-PG），需要通過光呼吸途徑回收利用，但光呼吸過程需要消耗ATP和NADPH，并且釋放已固定的CO2和NH3（圖3）［65］；通過光呼吸途徑將2分子2-PG轉(zhuǎn)化為1分子3-磷酸甘油酸（3-phosphoglycerate，3-PGA），整個(gè)過程由分布在葉綠體、過氧物酶體、線粒體和細(xì)胞質(zhì)的9個(gè)酶促步驟完成；據(jù)估計(jì)，光呼吸可以釋放高達(dá)1/4已固定的CO2，造成C和N元素的巨大浪費(fèi)［66-69］。但光呼吸過程從2分子2-PG中為細(xì)胞代謝回收了75%的C，對細(xì)胞代謝具有很重要的作用，因此，理論上，構(gòu)建一個(gè)新的光呼吸支路（photorespiration bypass）避免CO2和NH3的浪費(fèi)或者增加釋放CO2的回收能力，可以提高CO2的利用效率，進(jìn)而增加生物量產(chǎn)率［70］。這一方案的可行性在模式生物擬南芥（Arabidopsis thaliana）和油料作物亞麻薺（Camelina sativa）中得到了成功驗(yàn)證，新構(gòu)建的光呼吸支路可以幫助轉(zhuǎn)化株顯著提高生物量產(chǎn)率［65，68］。Shih等［70］利用細(xì)長聚球藻光呼吸過程與嗜熱自養(yǎng)生物橙色綠屈撓菌（Chloroflexus aurantiacus）的3-羥基丙酸（3-hydroxypropionate）固碳途徑具有相同的中間代謝產(chǎn)物——乙醛酸（glyoxylate）這一特點(diǎn)，通過導(dǎo)入含有6個(gè)基因的表達(dá)載體，首次在光自養(yǎng)藍(lán)藻中構(gòu)建了一條合成的光呼吸支路。與傳統(tǒng)的光呼吸途徑相比，新構(gòu)建的支路不僅不釋放NH3，而且實(shí)現(xiàn)了CO2的凈收益。雖然轉(zhuǎn)化株與野生株相比并沒有顯著的差異，但作者推測了潛在的優(yōu)化步驟，這為微藻光呼吸途徑的優(yōu)化提供了新選擇。

圖3 光呼吸過程及代表性光呼吸支路構(gòu)建方案［65］Fig.3 Photorespiratory and the construction of representative photorespiratory bypass[65]

2.4 碳濃縮機(jī)制改造

與C3植物不同，大多數(shù)微藻和C4植物具有碳濃縮機(jī)制（carbon-concentrating mechanism，CCM）以應(yīng)對水體環(huán)境中較低的CO2濃度［71］。藍(lán)藻中Rubisco被密封在羧酶體中，而真核微藻Rubisco主要存在于葉綠體蛋白核中［72］，通過CCM可以使Rubisco活性部位周圍CO2濃度達(dá)到周圍環(huán)境的1000倍以上［73］。碳酸酐酶（carbonate anhydrase，CA）是參與CCM的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)催化和CO2之間的可逆轉(zhuǎn)化［74］。微藻的CCM通常是誘導(dǎo)機(jī)制，通過對周圍CO2濃度的感知，調(diào)控CCM的表達(dá)水平［74］。微藻的規(guī)模化養(yǎng)殖通常會使用遠(yuǎn)高于空氣中的CO2濃度，可能導(dǎo)致CCM的關(guān)閉［75］。在15% CO2條 件 下，小 球 藻PY-ZU1（ChlorellaPY-ZU1）中CA幾乎不表達(dá)，因?yàn)楫?dāng)CO2濃度足夠高的條件下，CO2可以通過直接擴(kuò)散的方式滿足Rubisco對CO2的需求；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，利用1% CO2可以為小球藻提供足夠的CO2，從而不需要啟動CCM［76］。Wei等［77］通過RNA干擾技術(shù)使微擬球藻中細(xì)胞質(zhì)CA（CA2）活性降低28%～35%，在高濃度CO2（5%）條件下，轉(zhuǎn)化株生物質(zhì)濃度提高了40%；進(jìn)一步在不同規(guī)模、不同類型的反應(yīng)器中的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明，在高濃度CO2（5%）條件下轉(zhuǎn)化株的優(yōu)良性狀得到保留。過表達(dá)CCM中另一關(guān)鍵酶——碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（bicarbonate transporter）的轉(zhuǎn)化株，在不同CO2條件下也顯示出生物量積累的差異。例如在通入空氣條件下，過表達(dá)了碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的集胞藻（Synechocystissp.PCC6803）轉(zhuǎn)化株與野生株相比，生長率和生物量產(chǎn)率幾乎增加1倍，但在高濃度CO2條件下轉(zhuǎn)化株的生長受到抑制［78］。研究結(jié)果顯示，在高濃度CO2條件下，下調(diào)CCM活性可能提高微藻的固碳效率和生物量積累水平。Lin等［79］在兩種小球藻（C.vulgaris和C.sorokiniana）中異源過表達(dá)百脈根中生根瘤菌（Mesorhizobium loti）的CA。分析結(jié)果顯示，在1% CO2濃度條件下，兩株轉(zhuǎn)化株的生長較野生株均有顯著增加，而在不通入CO2的培養(yǎng)過程中，轉(zhuǎn)化株生長受到了明顯抑制［79］。以上結(jié)果的差異說明不同來源的CCM元件對CO2濃度的感知存在顯著差異。

3 研究展望

合成生物學(xué)是以工程化設(shè)計(jì)理念，對生物體進(jìn)行有目標(biāo)地設(shè)計(jì)、改造乃至重新合成。真核微藻基因工程及合成生物學(xué)已經(jīng)成為國際研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。合成生物學(xué)的快速發(fā)展，使微藻光合作用的改造、理性設(shè)計(jì)甚至是新光合途徑的構(gòu)建成為可能。本文認(rèn)為下一步研究可以從優(yōu)秀光合元件挖掘、調(diào)控元件篩選、新途徑和高效固碳工程株構(gòu)建四方面尋求突破。

3.1 挖掘新的光合作用元件

一般認(rèn)為以葉綠素a為主要捕光色素的光合作用只能利用400～700 nm的可見光，而在藍(lán)藻中發(fā)現(xiàn)的葉綠素d和葉綠素f則又向遠(yuǎn)紅外光方向進(jìn)一步拓展了光合作用可用光譜的范圍［80-81］。葉綠素d和葉綠素f的異源合成有可能進(jìn)一步拓寬微藻捕光天線的吸收光譜［82］。葉綠素f合成酶基因的鑒定及其在聚球藻（Synechococcussp.PCC 7002）中的異源表達(dá)證明了這種方案的可行性［83-84］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明異源合成的葉綠素f可以與聚球藻PSⅠ結(jié)合并增強(qiáng)PSⅠ對遠(yuǎn)紅光（>700 nm）的吸收能力［84］。在下一步實(shí)驗(yàn)中需要進(jìn)一步評估轉(zhuǎn)化株的光合作用效率和生長水平變化。在擬南芥中過表達(dá)煙草細(xì)胞色素b6f復(fù)合體硫鐵蛋白（Rieske FeS protein，PetC），可以提高轉(zhuǎn)化株光系統(tǒng)Ⅱ和Ⅰ復(fù)合體蛋白的表達(dá)水平，并且顯著提高光系統(tǒng)Ⅱ和Ⅰ的量子效率、電子傳遞速率和生物量；研究顯示，細(xì)胞色素b6f復(fù)合體在電子傳遞鏈中發(fā)揮重要功能，同時(shí)表明硫鐵蛋白也是優(yōu)化光合作用效率的潛在目標(biāo)［85］。質(zhì)體藍(lán)素是電子傳遞鏈上重要的一環(huán)，同時(shí)是一種含銅的蛋白，對維持細(xì)胞內(nèi)銅離子穩(wěn)態(tài)具有重要作用，參與細(xì)胞內(nèi)活性氧的清除［86-87］。在擬南芥中異源合成來源于鹽生植物Suaeda salsa的質(zhì)體藍(lán)素，可以使轉(zhuǎn)化株快速恢復(fù)強(qiáng)光導(dǎo)致的最大光合量子產(chǎn)率下降，同時(shí)增加抗氧化能力［87］。與此形成鮮明對比的是，微藻中關(guān)于電子傳遞鏈的研究較少，針對提高微藻電子傳遞速率的基因工程改造研究尚未見相關(guān)報(bào)道。此外，需要更加重視從適應(yīng)極端環(huán)境條件的微藻中挖掘優(yōu)秀光合元件。Chlorella ohadii進(jìn)化了出色的光保護(hù)功能使其可以在沙漠極端高光的條件下進(jìn)行光合作用；除了縮小天線，增加類胡蘿卜素含量外，C.ohadii還通過過量積累依賴ATP的鋅金屬蛋白酶（ATPdependent zinc metalloprotease，F(xiàn)tsH），快速修復(fù)被光損傷的光系統(tǒng)蛋白［88］。為了適應(yīng)南極極端的環(huán)境條件，南極綠藻（Koliella antarctica）利用兩個(gè)葉黃素循環(huán)來應(yīng)對快速變化的光照條件［89］。

在室外光照條件不停變化的環(huán)境下，NPQ是植物抵御光損傷的一種保護(hù)機(jī)制，但NPQ的誘導(dǎo)和松弛存在速率上的不對稱，稍慢的松弛速率（從猝滅態(tài)到非猝滅態(tài)）可能抑制固碳過程，這一假設(shè)得到了實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證［90］。因此，提高NPQ松弛速率被認(rèn)為是一種可以有效提高光合作用效率和生物量的方法［91］。Kromdijk等［90］通過在煙草中過表達(dá)擬南芥PsbS、紫黃素和玉米黃素加快NPQ的松弛；溫室中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化株的生物量產(chǎn)率提高15%，證明上述方法是改造光合作用、提高生物量產(chǎn)率的可行方案［90］。雖然微藻中NPQ的調(diào)控機(jī)制和參與的成分有差異，例如LHCSR和LHCX分別在綠藻和硅藻NPQ過程的調(diào)控中起重要作用，但這仍是可以借鑒的方案［92-94］。構(gòu)建快速篩選元件的平臺對提高優(yōu)良元件篩選效率具有重要意義。與之前需要產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化株來研究NPQ的相關(guān)基因不同，Leonelli等［95］開發(fā)了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，可以高效預(yù)測NPQ的相關(guān)基因，并對4個(gè)微擬球藻和海鏈藻中類胡蘿卜素合成相關(guān)的基因進(jìn)行了功能驗(yàn)證。

研究發(fā)現(xiàn)，嗜熱紅藻Galdieria partita和Cyanidium caldariumRubisco的CO2/O2相對特異性分別是菠菜Rubisco的2.4倍和2.5倍，具有顯著的羧化酶特異性［96］。Haslam等［97］總結(jié)了在相同溫度條件下（25℃）不同物種Rubisco特異性系數(shù)的變化，同樣證明海洋紅藻Rubisco CO2/O2特異性顯著高于綠藻和高等植物；硅藻Rubisco特異性與溫度呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)，當(dāng)溫度降低時(shí)，Rubisco特異性越高。Rubisco的特異性和羧化反應(yīng)速率通常呈負(fù)相關(guān)，海洋紅藻門和雜色藻門微藻中的Rubisco比高等植物、綠藻和細(xì)菌的Rubisco具有更高的特異性［98］。在利用紅藻Rubisco過程中需要注意的是，Rubisco的活性位點(diǎn)可能與磷酸糖類代謝產(chǎn)物結(jié)合抑制其活性，在這種情況下需要Rubisco激活酶重新激活Rubisco釋放抑制因子［99］。Loganathan等［100］證明紅藻Cyanidioschyzon merolae中兩個(gè)cbbX基因編碼的產(chǎn)物負(fù)責(zé)形成Rubisco激活酶。為了在固碳方面發(fā)揮更大的作用，需要篩選在高濃度CO2甚至是煙氣（CO2含量通常在10%以上）條件下，可以保持較高羧化反應(yīng)速率的Rubisco。除了植物和微藻中研究較多的Ⅰ型Rubisco，在其他非產(chǎn)氧光合微生物中還發(fā)現(xiàn)了不同類型的Rubisco［101-102］。Zhang等［101］比較了7種不同來源的Rubisco活性，發(fā)現(xiàn)巨型管蟲營養(yǎng)體內(nèi)共生細(xì)菌的Rubisco羧化效率比聚球藻（Synechococcussp.PCC7002）Rubisco高50%以上。

3.2 挖掘調(diào)控光合作用的轉(zhuǎn)錄因子和microRNA

TF具有與目標(biāo)基因啟動子順式作用元件結(jié)合的功能域，通過影響（激活或抑制）RNA聚合酶活性調(diào)控基因的表達(dá)，植物中發(fā)現(xiàn)了很多可以調(diào)控光合作用效率的TF［103］。與針對單基因改造的方法相比，利用TF的優(yōu)勢在于可以調(diào)控一系列基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子BpMYB106負(fù)責(zé)調(diào)控多個(gè)光合和氧化磷酸化相關(guān)基因的表達(dá)水平，在樺樹中過表達(dá)BpMYB106可以增強(qiáng)光合作用和生長率［104］。生物信息學(xué)手段的快速發(fā)展為篩選與光合作用相關(guān)的TF提供了機(jī)會，例如Yu等［105］通過使用TRAP和ARACNE算法，預(yù)測了擬南芥中參與調(diào)控光合作用的TF，這為下一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TF功能打下了基礎(chǔ)。TF（mEmBP-1）可以與光合作用相關(guān)基因的啟動子結(jié)合，提高光合作用相關(guān)基因的表達(dá)水平，在水稻中過表達(dá)玉米的轉(zhuǎn)錄因子mEmBP-1可以顯著提高光合作用速率（30%）和谷物產(chǎn)率（29%）；轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，mEmBP-1過表達(dá)轉(zhuǎn)化株中光合作用各個(gè)階段的相關(guān)基因同時(shí)上調(diào)［106］。在水稻中異源表達(dá)玉米GOLDEN2-LIKE（GLK）TF，不但可以增加水稻的生物量產(chǎn)率和糧食產(chǎn)量，同時(shí)可以增加轉(zhuǎn)化株中葉黃素含量，并且?guī)椭徑庠诠庹兆兓透吖鈼l件下的光抑制，增強(qiáng)光保護(hù)能力［107］。除了正向調(diào)控光合作用的TF，最近的研究同樣發(fā)現(xiàn)了和光合作用呈負(fù)相關(guān)的TF。敲除水稻中的NRP1可以提高戶外培養(yǎng)水稻的光合作用和生物量水平［108］。Tokutsu等［109］發(fā)現(xiàn)衣藻中的CONSTANS轉(zhuǎn)錄因子和核轉(zhuǎn)錄因子Ys（NF-Ys）調(diào)控衣藻的光保護(hù)機(jī)制。MicroRNA是真核生物中一類內(nèi)源的單鏈RNA，一般包含20～24個(gè)核苷酸，通過影響靶基因的mRNA調(diào)控靶基因的表達(dá)［110］。研究發(fā)現(xiàn)，在水稻中過表達(dá)一個(gè)保守的microRNA（miR408）可以顯著提高水稻的光合作用和糧食產(chǎn)量；深入的分析顯示，miR408通過下調(diào)質(zhì)體藍(lán)素家族基因的表達(dá)水平，影響質(zhì)體藍(lán)素水平和光合作用［111］。隨后的研究在多種植物中證明過表達(dá)miR408可以有效提高植物的生長和光合作用；分析顯示過表達(dá)miR408轉(zhuǎn)化株的質(zhì)體藍(lán)素和銅離子濃度、光合作用指標(biāo)及光合作用相關(guān)基因的表達(dá)水平均有顯著提高［112］。因此，在微藻中尋找光合作用相關(guān)的TF和microRNA是進(jìn)一步提高光合作用效率和生物量產(chǎn)率的潛在有效途徑。

3.3 構(gòu)建新的光合作用途徑

考慮到目前對Rubisco改造取得的成果有限，通過合成生物學(xué)手段，在微藻中構(gòu)建新的固碳途徑提升固碳效率值得嘗試。雖然CBB是自然界中最主要的固碳途徑，但并不是唯一的固碳途徑，在原核自養(yǎng)生物中還有其他5個(gè)固碳途徑：還原乙酰輔酶A途徑（reductive acetyl-coenzyme A pathway）、還原檸檬酸循環(huán)（reductive citric acid cycle）、二羧酸/4-羥基丁酸循環(huán)（dicarboxylate/4-hydroxybutyrate cycle）、3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán)（3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate cycle）和羥基丙酸雙循環(huán)（3-hydroxypropionate bi-cycle）［113-114］。Bar-Even等［115］以5000個(gè)已知的代謝酶為基礎(chǔ)，通過基于約束的建模方法提出了一條比CBB快2～3倍的合成固碳途徑。不同羧化酶的動力學(xué)特性對比發(fā)現(xiàn)，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase）具有很高的特異活性和對無機(jī)碳源的親和性，因此合成途徑選取磷酸烯醇丙酮酸羧化酶作為其中唯一的羧化酶［115］。雖然在底盤細(xì)胞中合成這條途徑并發(fā)揮固碳功能還面臨很多挑戰(zhàn)，但為新固碳途徑的構(gòu)建提供了可選方案。在集胞藻SynechocystisPCC 6803過表達(dá)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶可以在低光條件下提高轉(zhuǎn)化株生長［116］。研究認(rèn)為羥基丙酸雙循環(huán)對氧氣敏感性低，所含酶背景信息清晰，與其他固碳途徑相比更適合光合自養(yǎng)生物［70，117］。Shih等［70］以羥基丙酸雙循環(huán)為基礎(chǔ)，在藍(lán)藻中構(gòu)建了光呼吸支路，不但增加了CO2的回收能力，同時(shí)增強(qiáng)了CO2的吸收能力。如果構(gòu)建新的固碳途徑是“開源”，構(gòu)建光呼吸支路則是“節(jié)流”過程，對于固碳效率提升同樣至關(guān)重要。植物中構(gòu)建的多種光呼吸支路對于微藻光呼吸支路的構(gòu)建具有很高的借鑒價(jià)值。Kebeish等［68］通過分步轉(zhuǎn)化的方法，將E.coli乙醇酸分解途徑的5個(gè)基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，實(shí)現(xiàn)了所有酶在葉綠體中的表達(dá)，構(gòu)建了一個(gè)質(zhì)體光呼吸支路；這條完全位于質(zhì)體中的光呼吸途徑支路具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如新的代謝途徑不耗能和NADPH，也不產(chǎn)生NH3，并且在質(zhì)體中釋放CO2，更有利于CO2的回收利用；得益于此，轉(zhuǎn)化株的光呼吸顯著降低，光合作用和生物量積累顯著提高。在產(chǎn)油作物中導(dǎo)入葡糖酸脫氫酶（glycolate dehydrogenase，GDH）、乙醛酸醛連接酶（glyoxylate carboligase，GCL）和酒石半醛還原酶（tartronic semialdehyde reductase，TSR）等基因，構(gòu)建與天然途徑競爭的光呼吸支路，使種質(zhì)產(chǎn)量增加了50%以上［65］。Shen等［118］構(gòu)建了一個(gè)同時(shí)表達(dá)3個(gè)水稻本體酶的表達(dá)載體，通過Rubisco小亞基轉(zhuǎn)運(yùn)肽導(dǎo)入葉綠體中，成功構(gòu)建了一個(gè)新的葉綠體光呼吸支路；野外試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化株的地上干重和糧食產(chǎn)量均有顯著提升?？梢娡ㄟ^引入外源和內(nèi)源酶構(gòu)建能耗低、不產(chǎn)生NH3且更有利于回收CO2的光呼吸支路，同樣是提升微藻生物量產(chǎn)率的可行方案。

早在19世紀(jì)60年代，Boussingault提出假說，認(rèn)為光合作用是一個(gè)雙向過程，除了受光驅(qū)動外，同時(shí)受光合終產(chǎn)物利用效率的反饋調(diào)節(jié)［119］。而光合作用終產(chǎn)物的利用效率又在很大程度上取決于包括溫度和營養(yǎng)鹽在內(nèi)的環(huán)境因子［120］。光驅(qū)動過程保證了光能的高效率利用，而光合同化產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)保證了不同途徑碳流分配的平衡，對生物的生長和存活同樣具有重要意義［120］。越來越多的研究觀察到在高等植物和微藻中，低效的光合產(chǎn)物利用率會導(dǎo)致固碳效率和整體光合作用效率的降低，這種現(xiàn)象被稱為“匯限制”［121］。在微藻中構(gòu)建異源產(chǎn)物消耗途徑，可以有效緩解“匯限制”對光合作用的抑制作用［121］。例如Abramson等［121］首 先 誘 導(dǎo) 細(xì) 長 聚 球 藻（Synechococcus elongatusPCC 7942）在細(xì)胞質(zhì)中積累大量蔗糖，再通過異源表達(dá)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將蔗糖排出細(xì)胞，顯著提高了轉(zhuǎn)化株光合作用效率。因此，利用光合作用雙向調(diào)控的特點(diǎn)，構(gòu)建新的光合作用產(chǎn)物（例如甘油醛-3-磷酸）利用途徑，提高產(chǎn)物的消耗速率，有望進(jìn)一步提高微藻的光合作用效率。

3.4 高效固碳工程株的構(gòu)建

毫無疑問，微藻因其較高的光合作用效率，是構(gòu)建“高效固碳工程株”的理想底盤生物。但從進(jìn)化的角度，微藻的光合作用系統(tǒng)適應(yīng)水域生態(tài)中較低的CO2濃度，而為了在固碳方面發(fā)揮更大的作用，需要進(jìn)一步通過基因工程和合成生物學(xué)的方法對現(xiàn)有的光合作用系統(tǒng)進(jìn)行改造或新途徑合成，使其適應(yīng)生物反應(yīng)器中的高濃度CO2或煙氣環(huán)境。高效固碳工程株的構(gòu)建可以概括為三部分內(nèi)容：（1）固碳底盤微藻的篩選。除了利用現(xiàn)有藻種庫保藏和野外分離的藻種外，可以通過誘變（理化誘變或隨機(jī)插入突變）的方式篩選CO2低敏感或不同CO2濃度環(huán)境下具有高固碳效率的藻種或突變株。（2）研究固碳特性的調(diào)控機(jī)制。對野生株與突變株進(jìn)行CO2脅迫的鈣信號成像、轉(zhuǎn)錄組和microRNA組學(xué)等分析，挖掘篩選控制微藻高效固碳的相關(guān)功能基因，調(diào)控microRNA、TF及微藻感受與響應(yīng)CO2的信號通路。（3）微藻固碳關(guān)鍵代謝通路的設(shè)計(jì)改造。通過擴(kuò)展光合有效輻射范圍、減少激發(fā)能的非光化學(xué)耗散、操縱NPQ并增加對氧化應(yīng)激的抵抗力（表達(dá)調(diào)控基因）等途徑，對微藻光照能量收集復(fù)合體的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行改造優(yōu)化。對微藻CBB循環(huán)和CCM相關(guān)酶進(jìn)行改造或利用人工microRNA或TF對兩個(gè)關(guān)鍵途徑的代謝通路進(jìn)行表觀調(diào)控，針對兩個(gè)關(guān)鍵代謝途徑的特定節(jié)點(diǎn)設(shè)計(jì)構(gòu)建調(diào)控開關(guān)等，重構(gòu)額外的CO2固定代謝途徑、光呼吸支路和終產(chǎn)物消耗途徑，提高微藻固碳效率。

4 總結(jié)

綜上所述，通過截短捕光天線、增加捕光能力和光能利用率、改造CBB循環(huán)和CCM以及構(gòu)建光呼吸支路等手段對微藻光合系統(tǒng)的改造和優(yōu)化，已經(jīng)取得了諸多重要的開創(chuàng)性進(jìn)展。但整體進(jìn)度落后于高等植物特別是經(jīng)濟(jì)作物光合作用路徑的改造和優(yōu)化，導(dǎo)致微藻固碳的潛能未充分發(fā)揮。通過優(yōu)良光合元件、調(diào)控因子的挖掘以及新途徑的構(gòu)建，可以有效解除瓶頸步驟的限制，實(shí)現(xiàn)光、暗反應(yīng)之間的能量平衡。光合作用除了受光調(diào)控外，還受終產(chǎn)物消耗效率的調(diào)控，這說明需要同時(shí)開展在細(xì)胞水平上針對光合作用相關(guān)代謝途徑的改造。隨著合成生物學(xué)的快速發(fā)展，為以微藻作為光合固碳底盤生物，設(shè)計(jì)構(gòu)建高效固碳微藻工程株奠定了基礎(chǔ)。利用合成生物方法和概念可以擺脫物種的限制，設(shè)計(jì)或合成光能利用率和固碳效率更高、抵抗光損傷以及產(chǎn)生更少活性氧的光合作用系統(tǒng)［114］。本文提出通過固碳底盤微藻的篩選、固碳特性的調(diào)控機(jī)制研究以及微藻固碳關(guān)鍵代謝通路的設(shè)計(jì)改造的方案，構(gòu)建適應(yīng)不同CO2濃度的工程株。微藻固定空氣中的CO2一方面能夠有效降低碳排放，加速我國節(jié)能減排目標(biāo)的早日實(shí)現(xiàn)；另一方面能夠大幅度降低微藻生產(chǎn)成本，獲得的微藻生物質(zhì)可以作為多種高附加值生物活性物質(zhì)的可持續(xù)來源。因此，微藻高效固碳工程株的設(shè)計(jì)構(gòu)建不但可以幫助應(yīng)對溫室氣體含量的升高，同時(shí)對緩解日漸緊張的能源和糧食危機(jī)具有重要意義。