由紫暄，李鋒，宋浩

（1天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2天津大學(xué)合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心和系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072；3天津大學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心合成生物學(xué)研究平臺(tái)，天津 300072）

電能細(xì)胞廣泛分布于細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌中，目前已分離篩選出上百種具有電活性的微生物［1］，包括向外界環(huán)境釋放電子的“產(chǎn)電細(xì)胞”，以及從外界環(huán)境獲取電子的“噬電細(xì)胞”［2］。產(chǎn)電細(xì)胞將有機(jī)物降解并釋放電子，實(shí)現(xiàn)化學(xué)能到電能的轉(zhuǎn)化；噬電細(xì)胞利用電能，將低能量密度底物還原為高值化學(xué)品，實(shí)現(xiàn)化學(xué)能到電能的轉(zhuǎn)化［3-4］。以電能細(xì)胞為核心的微生物電化學(xué)系統(tǒng)作為重要的微生物電催化技術(shù)，為解決環(huán)境生態(tài)修復(fù)、“雙碳”減排、綠色可持續(xù)化學(xué)品合成等國家重大需求，提供了極具發(fā)展?jié)摿Φ慕鉀Q方案［5］，例如用于生物降解有機(jī)廢物和收集生物電的微生物燃料電池（MFC）［6-7］、從有機(jī)廢物中生產(chǎn)氫氣的微生物電解電池（MEC）［8］、海水淡化的微生物脫鹽電池（MDC）［9］、以電極作為電子匯或化學(xué)品生產(chǎn)源的非平衡電發(fā)酵［10-12］，以及通過電還原CO2生產(chǎn)高附加值生物燃料的微生物電合成（MES）［13-15］等。此外，電能細(xì)胞還可以應(yīng)用于生物醫(yī)藥和有機(jī)催化領(lǐng)域，例如基于電能細(xì)胞靶向性遞送藥物以殺傷腫瘤細(xì)胞治療癌癥［16］，利用電能細(xì)胞特異性控制自由基聚合促進(jìn)有機(jī)高分子催化［17］，利用電能細(xì)胞進(jìn)行生物合成金屬納米顆粒、高效降解偶氮染料等［18-19］。以上均是通過電能細(xì)胞提取、轉(zhuǎn)化儲(chǔ)存于有機(jī)物中的電子，并傳遞給外界環(huán)境中的電子受體，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)化學(xué)能到電能的雙向轉(zhuǎn)化。

當(dāng)前，合成生物學(xué)改造的電能細(xì)胞在電能輸出、產(chǎn)物合成等方面已顯示出數(shù)量級(jí)的突破。然而，目前以電能細(xì)胞為核心催化劑的微生物電化學(xué)系統(tǒng)在實(shí)際環(huán)境處理與電能回收、化學(xué)品合成等方面的廣泛應(yīng)用仍存在較大瓶頸，其根本原因是電能細(xì)胞雙向電子傳遞能力弱、物質(zhì)-能量轉(zhuǎn)化效率低。因此，通過模塊化、系統(tǒng)化的合成生物學(xué)策略，構(gòu)建一個(gè)電子傳遞效率高、物質(zhì)-能量轉(zhuǎn)換代謝強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣的電能細(xì)胞是未來該領(lǐng)域的重點(diǎn)研究方向和目標(biāo)。相較于早期的綜述大多聚焦于產(chǎn)電微生物篩選、胞外電子傳遞效率強(qiáng)化、生物電極材料修飾等研究工作［20-22］，本文著眼于近5年產(chǎn)電細(xì)胞和噬電細(xì)胞合成生物學(xué)改造兩方面的最新研究進(jìn)展，通過拆解分析雙向電子傳遞機(jī)制，分類匯總了電能細(xì)胞的合成生物學(xué)改造策略，即：①強(qiáng)化產(chǎn)電細(xì)胞的胞內(nèi)電子生成、胞外傳遞效率，具體為拓寬底物譜、增強(qiáng)還原力轉(zhuǎn)化、提高胞外傳遞能力、促進(jìn)電極生物膜群體形成；②強(qiáng)化噬電細(xì)胞的胞外電子攝取-還原力轉(zhuǎn)化-產(chǎn)物合成效率，包括促進(jìn)噬電細(xì)胞電子攝取和還原力轉(zhuǎn)化，調(diào)控細(xì)胞代謝路徑電合成化學(xué)品和生物燃料。此外還討論了這些策略的適用性和局限性，并展望了未來最具前景的研究發(fā)展方向。

1 電能細(xì)胞的雙向電子傳遞機(jī)制

1.1 產(chǎn)電細(xì)胞電子傳遞機(jī)制

胞外電子傳遞（extracellular electron transfer，EET）是產(chǎn)電細(xì)胞將吸收的有機(jī)營養(yǎng)物經(jīng)中心碳代謝循環(huán)釋放電子，并傳遞給FAD、NAD+、NADP+以還原為FADH2、NADH、NADPH儲(chǔ)存。通常產(chǎn)電細(xì)胞分解代謝產(chǎn)生的還原力大多以NADH形式存在，因此NADH通常被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)主要的可釋放電子池。儲(chǔ)存于電子池中的電子在NADH脫氫酶的作用下匯入內(nèi)膜上的醌池中，隨后經(jīng)膜上導(dǎo)電元件跨越絕緣的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，以多種方式傳遞到胞外電子受體。該過程涉及系統(tǒng)發(fā)育的多種細(xì)胞成分，迄今為止，有兩種電子轉(zhuǎn)移機(jī)制已被廣泛認(rèn)可：①直接接觸式電子傳遞，即產(chǎn)電細(xì)胞通過外膜細(xì)胞色素或?qū)щ娂{米線直接與電極接觸傳遞電子［23-24］；②間接接觸式電子傳遞，即產(chǎn)電細(xì)胞通過可溶性電子傳遞載體（如黃素類、吩嗪類、醌類等）間接地與電極之間傳遞電子［25］（圖1）。

圖1 雙向電子傳遞機(jī)制由細(xì)胞色素或納米線介導(dǎo)的直接電子傳遞機(jī)制（左）；由電子傳遞載體介導(dǎo)的間接電子傳遞機(jī)制（右）Fig.1 Bi-directional electron transfer mechanism(Left)Direct electron transfer via cytochromes and conductive nanowires;(Right)Electron shuttles mediated electron transfer

（1）細(xì)胞色素介導(dǎo)的直接電子傳遞細(xì)胞色素蛋白是電能細(xì)胞表面的主要導(dǎo)電元件，因其位置特殊、功能明確，形成了最重要的直接電子傳遞方式［26］。底物氧化釋放的電子，經(jīng)過電子傳遞鏈中色素蛋白的氧化還原電位從低至高的順序，傳遞至胞外電子受體［27］。目前已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種色素蛋白，其中分子機(jī)制研究最為清晰的是，模式電活性微生物希瓦氏菌Shewanella oneidensis的金屬還原MtrCAB途徑和地桿菌Geobacter sulfurreducens的Pcc途徑。在金屬還原MtrCAB電子傳遞途徑中，胞內(nèi)NADH氧化釋放的電子，經(jīng)甲基萘醌池轉(zhuǎn)移到內(nèi)膜細(xì)胞色素CymA，隨后通過周質(zhì)空間細(xì)胞色素FccA和STC傳遞至外膜細(xì)胞色素復(fù)合體MtrCAB。最新結(jié)構(gòu)學(xué)揭示，外膜MtrCAB色素蛋白多聚體由外膜十血紅素細(xì)胞色素MtrC、周質(zhì)十血紅素細(xì)胞色素MtrA和嵌入外膜中的β-桶MtrB組成［27-28］。MtrB位于細(xì)胞外膜內(nèi)負(fù)責(zé)連接MtrA和MtrC，使電子由周質(zhì)空間傳遞至胞外［29-30］。此外，S.oneidensisMR-1基因組包含1個(gè)MtrC同源物（MtrF）、3個(gè)MtrB同源物（MtrE、DmsF、SO4359）和3個(gè)MtrA同 源 物（MtrD、DmsE、SO4360），在MtrCAB缺失的情況下，上述同源物為MR-1的胞外電子傳遞提供部分補(bǔ)償路徑［31-32］。G.sulfurreducens的Pcc電 子 傳遞 路 徑 與MtrCAB相似，包含內(nèi)膜色素蛋白ImcH、CbcL，周質(zhì)空間色素蛋白PpcA-E，外膜色素OmaB、OmaC、OmcB、OmcC等［33-34］。目 前 已 報(bào) 道 的Geobacter的色素蛋白有超過110種，并含有多個(gè)同源物，這使得地桿菌具有多條“膜電子通道”［35］，相比于S.oneidensis，具有更大的跨膜電子通量和更高的電子傳遞效率。雖然，c型細(xì)胞色素蛋白在EET過程中發(fā)揮主要作用，但是當(dāng)氧化還原活性蛋白和電極表面之間的距離大于1.4 nm，電子傳遞速率隨距離的增加而呈指數(shù)式下降［36］。這表明由細(xì)胞色素蛋白介導(dǎo)的直接接觸式電子傳遞途徑，只能發(fā)生在生物膜中內(nèi)層靠近電極處的微生物，而位于生物膜外側(cè)的細(xì)胞只能通過導(dǎo)電納米線或電子傳遞載體進(jìn)行遠(yuǎn)距離電子傳遞。

（2）導(dǎo)電納米線介導(dǎo)的直接電子傳遞 微生物導(dǎo)電納米線，最初由Lovley等于2005年在G.sulfurreducens細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)［37］，可在細(xì)胞表面形成數(shù)十微米長的導(dǎo)電菌毛（electrically conductive pili，e-Pili）介導(dǎo)電子的遠(yuǎn)距離傳導(dǎo)［38-39］。隨后，研究者們［40-42］證實(shí)SynechocystisPCC6803、Peloomaculum thermopropionicum、Lysinibacillus variansGY32等也 可以產(chǎn)生數(shù)十微米長、直徑100 nm的導(dǎo)電納米線結(jié)構(gòu)，這意味著導(dǎo)電納米線并非Geobacter獨(dú)有的，在細(xì)菌中可能是一種常見的遠(yuǎn)距離電子傳遞途徑。此前，在S.oneidensis一直被認(rèn)為含有與Geobacter同樣的導(dǎo)電納米線，但實(shí)驗(yàn)證明，S.oneidensis的“導(dǎo)電納米線”僅是由于外膜的延伸，是一個(gè)擴(kuò)展的周質(zhì)空間，其上含有高密度的多血紅素，可為遠(yuǎn)距離EET提供有效途徑［43］。目前關(guān)于電子在導(dǎo)電納米線中的傳遞機(jī)制仍有爭(zhēng)論。一種觀點(diǎn)認(rèn)為，e-Pili主要由菌毛蛋白PilA單體組裝而成，富含芳香氨基酸［44-46］，芳香氨基酸殘基形成的π-π鍵軌道相互重疊，電子在電子云中自由穿梭，以離域的形式沿著菌毛傳遞［47-49］；而另一種觀點(diǎn)認(rèn)為，從電活性細(xì)胞中分離出的導(dǎo)電細(xì)絲，并非四型菌毛（TypeⅣpili，TFP），而是聚合的細(xì)胞色素OmcS或OmcZ，其內(nèi)部的血紅素結(jié)構(gòu)無縫堆疊形成微米級(jí)的細(xì)絲，為電子流提供連續(xù)路徑［50］。最近，Gu等［51］通 過 冷凍 電 鏡 揭 示，G.sulfurreducens將pilA-N與pilA-C結(jié)合可形成異二聚體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)作為導(dǎo)電納米線組裝基座定位于周質(zhì)空間內(nèi)，輔助OmcS或OmcZ等色素蛋白完成組裝并延伸至胞外電子受體上。而當(dāng)OmcS、OmcZ等細(xì)胞色素缺失時(shí)，pilA可由周質(zhì)空間延伸出胞外，但由于其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定僅有較低的電導(dǎo)率。通常，pilA僅在胞內(nèi)發(fā)揮組裝器的作用。因此，OmcS和OmcZ等導(dǎo)電色素蛋白納米線可能是G.sulfurreducens直接電子傳遞的主要貢獻(xiàn)者，但基于e-Pili的導(dǎo)電納米線結(jié)構(gòu)，無論是在地桿菌中作為色素納米線延伸組裝基座，亦或是作為其他電能細(xì)胞的胞外電子傳遞通道，均有不可忽視的研究價(jià)值。

（3）電子傳遞載體介導(dǎo)的間接電子傳遞電能細(xì)胞可利用自身分泌的或環(huán)境中存在的電子傳遞載體（黃素類［52］、吩嗪類［53］、醌類［54］）介導(dǎo)間接電子傳遞。目前，針對(duì)電子傳遞載體介導(dǎo)電能細(xì)胞間接電子傳遞機(jī)制的研究，主要集中在Shewanella分泌的黃素類化合物和Pseudomonas分泌的吩嗪類化合物。最初認(rèn)為這些氧化還原中間體，通過游離形式穿梭于電能細(xì)胞和電子受體之間，通過“雙電子氧化還原反應(yīng)”介導(dǎo)細(xì)胞電子傳遞［52］。然而，最近的研究發(fā)現(xiàn)，可溶性氧化還原分子化合物還可以作為外膜細(xì)胞色素蛋白的輔因子，與外膜色素蛋白結(jié)合形成半醌等物質(zhì)，以“單電子氧化還原反應(yīng)”方式進(jìn)行電子傳遞，其速率是細(xì)胞色素蛋白直接導(dǎo)電速率的103～105倍［55-58］。對(duì)Shewanella外膜色素蛋白與黃素類化合物的作用關(guān)系進(jìn)一步研究揭示，細(xì)胞色素蛋白與黃素的結(jié)合是一個(gè)可逆過程，細(xì)胞色素高保守區(qū)域CXXCH基序中的半胱氨酸巰基氧化形成的二硫鍵，是調(diào)控該可逆過程的核心部位。該核心區(qū)受外界微環(huán)境直接影響［59］，當(dāng)厭氧時(shí)，二硫鍵處于還原狀態(tài)，促進(jìn)黃素與色素蛋白的結(jié)合，形成單電子介導(dǎo)機(jī)制；而有氧條件下，氧化態(tài)的二硫鍵并不利于結(jié)合黃素分子，使其以雙電子機(jī)制介導(dǎo)電子傳遞。此外，在S.oneidensisMR-1中發(fā)現(xiàn)了一種新的電子傳遞載體-ACNQ（2-amino-3-carboxy-1，4-naphthoquinone）。ACNQ作為電子傳遞載體不僅利于細(xì)胞外電子傳遞，且不會(huì)改變甲基萘醌的生成以及EET相關(guān)的細(xì)胞色素c表達(dá)［60］。Pseudomonas能夠自身合成分泌吩嗪類化合物（例如，吩嗪-1-羧酸、吩嗪-1-羧酰胺和綠膿菌素）作為電子傳遞載體［61-62］。Verstraete等［53］揭示吩嗪類化合物能極大促進(jìn)P.aeruginosa的胞外電子傳遞速率，而當(dāng)吩嗪分泌不足時(shí)，突變菌株的功率輸出降低近95%。除Shewanella、Pseudomonas這類典型的革蘭氏陰性菌外，Light等［63］揭示在革蘭氏陽性菌李斯特氏菌Listeria monocytogenes中也可通過基于黃素的EET過程，并且該研究團(tuán)隊(duì)確定了一個(gè)負(fù)責(zé)EET的8個(gè)基因位點(diǎn)。該位點(diǎn)編碼一種特定的NADH脫氫酶，通過將電子引導(dǎo)至膜定位的醌池，將EET與有氧呼吸分離。其他基因則編碼促進(jìn)細(xì)胞外色素蛋白的組裝，結(jié)合游離黃素分子穿梭，介導(dǎo)胞外電子轉(zhuǎn)移。鑒于電子傳遞載體在微生物電化學(xué)系統(tǒng)中的高效作用，近些年，通過合成生物學(xué)方法重新設(shè)計(jì)基因調(diào)控線路強(qiáng)化電能細(xì)胞合成分泌電子傳遞載體，提高微生物與電極間的電子傳遞效率成為廣泛的研究熱點(diǎn)。

1.2 噬電細(xì)胞電子傳遞機(jī)制

噬電細(xì)胞因能夠從胞外攝取電子轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)還原力來催化還原CO2、N2等高氧化態(tài)物質(zhì)合成高附加值化學(xué)品得到了廣泛關(guān)注［64-65］。例如，噬電細(xì)胞能夠從陰極吸收電子，分別將CO2還原為CH4、高級(jí)醇、脂肪酸、萜烯類、可降解塑料，將N2還原為NH3等高附加值化合物，從而擴(kuò)展了微生物電化學(xué)系統(tǒng)的實(shí)際應(yīng)用［66-67］。然而，這些微生物的細(xì)胞內(nèi)電子轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制仍未被深度探索。目前的研究表明，噬電細(xì)胞可以通過細(xì)胞色素蛋白（直接電子轉(zhuǎn)移）或通過氧化還原電子載體（間接電子轉(zhuǎn)移）與電極表面建立電子傳遞（圖1）［68］。

（1）直接電子攝取細(xì)胞色素蛋白作為電能細(xì)胞表面的主要導(dǎo)電元件，可支持細(xì)胞進(jìn)行雙向電子傳遞。在S.oneidensisMR-1中，其電子攝取過程包括跨膜電子傳遞和周質(zhì)電子轉(zhuǎn)移［69］。Mtr途徑是負(fù)責(zé)電子跨膜傳遞的關(guān)鍵通道，當(dāng)產(chǎn)生向內(nèi)的電子通量時(shí)，電子隨即通過MtrCAB復(fù)合體穿過外膜到達(dá)周質(zhì)空間，隨后位于周質(zhì)中的細(xì)胞色素MtrA作為電子載體可直接將電子傳遞至內(nèi)膜上的色素蛋白CymA，該過程不需要周質(zhì)細(xì)胞色素FccA（延胡索酸還原酶）參與。而隨后CymA和甲基萘醌池之間的相互作用允許電子重新進(jìn)入周質(zhì)空間并傳遞至周質(zhì)色素蛋白FccA以還原延胡索酸［70］。與S.oneidensis通過相同路徑介導(dǎo)雙向電子傳遞不同，基于基因表達(dá)差異的分析，G.sulfurreducens的內(nèi)向EET途徑與外向EET機(jī)制有很大差異。編碼細(xì)胞色素蛋白的基因GSU3274、GSU1906、GSU0216可能是影響G.sulfurreducens進(jìn)行向內(nèi)電子傳遞的主要原因［71］。其中，基因GSU3274編碼的單血紅素c型細(xì)胞色素PccH，由于其具有最低的還原電位，可賦予G.sulfurreducens從電極接受電子的能力。在PccH缺失的情況下，電子向內(nèi)傳遞過程完全受到抑制，但對(duì)向外EET過程并不產(chǎn)生影響。由于PccH位于周質(zhì)中，并不能直接將電子從電極捕獲，因此電子轉(zhuǎn)移的跨膜過程可能是由外膜上其他未知的氧化還原蛋白介導(dǎo)的，而PccH與其他蛋白質(zhì)（例如，PpcA、PpcB和PpcE）的生理相互作用尚未被解析，核磁共振光譜尚未發(fā)現(xiàn)PpcD和PccH之間存在相互作用［72］。此外，光合細(xì)菌沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonas palustrisTIE-1的電子攝取路徑與S.oneidensis類似。R.palustris可利用光作為能源，利用Fe(Ⅱ)作為電子源進(jìn)行生長代謝，其基因組包含一個(gè)pio基因簇，包括pioA（mtrA同源物）、pioB（mtrB同源物）和pioC（編碼具有高氧化還原電位的鐵硫蛋白的基因）。其中色素蛋白PioA和PioB位于細(xì)胞外膜負(fù)責(zé)氧化Fe(Ⅱ)，將釋放的電子穿過外膜轉(zhuǎn)移到周質(zhì)色素蛋白PioC，隨后電子經(jīng)PioC傳遞到細(xì)胞內(nèi)膜上的光反應(yīng)中心。同樣在鐵氧化菌Sideroxydans lithotrophicusES-1，其基因組包含一個(gè)mto基因簇，包括cymA、mtoA（mtrA同源物）、mtoB（mtrB同源物）和mtoD（編碼單血紅素c型細(xì)胞色素基因）。其中細(xì)胞色素MtoA位于外膜負(fù)責(zé)直接氧化Fe(Ⅱ)，產(chǎn)生電子并傳遞給周質(zhì)細(xì)胞色素MtoD，在MtoD的作用下將電子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)膜上的CymA中發(fā)揮作用。根據(jù)目前研究推測(cè)，MtoA、MtoB、MtoD和CymA形成了一條電子傳遞鏈，將Fe(Ⅱ)的細(xì)胞外氧化與S.lithotrophicus胞內(nèi)醌還原結(jié)合起來。目前針對(duì)細(xì)胞色素介導(dǎo)的電子攝取機(jī)制，仍處于探索、推測(cè)階段。未來基于合成生物學(xué)的研究發(fā)展，有望發(fā)現(xiàn)更多參與該過程的關(guān)鍵輔因子，從而進(jìn)一步揭示噬電細(xì)胞電子攝取機(jī)制。

（2）間接電子攝取電子傳遞載體是增強(qiáng)電極-微生物間接相互作用的重要成分，能夠顯著提升C1化合物的微生物電合成效率。在產(chǎn)乙酸菌、產(chǎn)甲烷菌中，通常由H2介導(dǎo)間接電子傳遞過程。在該過程中，需要陰極電位必須低于標(biāo)準(zhǔn)氫電極（standard hydrogen electrode，SHE）的590 mV，才能完成微生物電催化過程［68］。當(dāng)陰極電位（相對(duì)于SHE）低于1500 mV，則甲酸鹽可由CO2和H+電催化后生成，該策略已被應(yīng)用于將電子通過甲酸鹽從陰極傳遞到羅爾斯通氏菌Ralstonia eutropha以進(jìn)行生物燃料的電合成［73］。而在Shewanella中，其自身分泌的氧化還原活性黃素，包括核黃素和黃素單核苷酸，可作為內(nèi)源性電子傳遞載體，通過其氧化態(tài)和還原態(tài)循環(huán)加速雙向間接電子傳遞過程［74］。此外，電子傳遞載體醌類衍生物，如對(duì)苯二酚（hydroquinone，HQ）和2-羥基-1，4-萘醌（2-hydroxy-1，4-naphthoquinone，HNQ），能夠在檸檬酸桿菌（Citrobacter amalonaticus）和卵形孢子菌（Sporomusa ovata）共培養(yǎng)的條件下，調(diào)節(jié)細(xì)胞的間接電子攝取，促進(jìn)高值化學(xué)品的合成［75］。電子傳遞載體介導(dǎo)的高效電子攝取路徑，在電能細(xì)胞中展現(xiàn)出不同的偏好性和依賴性。而目前發(fā)現(xiàn)的幾十種電子傳遞載體，在噬電細(xì)胞中的作用機(jī)制并未被完全解析，因此通過合成生物學(xué)策略，進(jìn)一步揭示電子傳遞載體介導(dǎo)的噬電過程是未來重要的研究方向。

2 產(chǎn)電細(xì)胞合成生物學(xué)改造

以產(chǎn)電細(xì)胞為核心催化劑的微生物電化學(xué)系統(tǒng)，通過細(xì)胞攝取有機(jī)底物，轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)還原力，經(jīng)跨膜傳遞系統(tǒng)將電子傳遞至胞外電子受體，完成細(xì)胞放電過程。然而，由于該過程中，細(xì)胞代謝損耗導(dǎo)致電子生成通量低，絕緣的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)導(dǎo)致電子傳遞效率低，嚴(yán)重制約了有機(jī)物中化學(xué)能到電能的轉(zhuǎn)化。本章節(jié)匯總了近年來運(yùn)用合成生物學(xué)策略（表1）：①強(qiáng)化胞內(nèi)電子生成，通過提高細(xì)胞底物利用效率、擴(kuò)充胞內(nèi)可釋放電子池，獲得具有還原力再生速率高、底物代謝能力強(qiáng)的工程菌；②提高胞外電子傳遞效率，通過加速胞外電子傳遞速率、強(qiáng)化電活性生物膜形成能力，獲得具有高功率密度輸出、電流密度輸出的工程菌，系統(tǒng)性增強(qiáng)產(chǎn)電細(xì)胞的化學(xué)能到電能的高效轉(zhuǎn)化。

表1 產(chǎn)電細(xì)胞的合成生物學(xué)改造匯總Tab.1 Summary of engineering exoelectrogens by synthetic biology

2.1 底物利用效率的合成生物學(xué)強(qiáng)化

細(xì)胞的代謝通量和電子生產(chǎn)與物質(zhì)代謝能力密切相關(guān)。在自然狀態(tài)下，部分產(chǎn)電細(xì)胞由于缺乏天然底物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或代謝相關(guān)的酶類，導(dǎo)致細(xì)胞可攝取底物的效率低且范圍窄，這嚴(yán)重限制了產(chǎn)電細(xì)胞自身的能量轉(zhuǎn)換效率以及大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。因此，通過合成生物學(xué)策略拓寬電活性細(xì)胞的可利用底物范圍、物質(zhì)代謝效率以及電子生成能力是產(chǎn)電細(xì)胞工程改造的重要方向之一。

2.1.1 強(qiáng)化底物代謝速率

產(chǎn)電細(xì)胞通常具有底物攝取速率慢、胞內(nèi)電子通量低等問題，這成為制約產(chǎn)電細(xì)胞底物能量代謝的關(guān)鍵瓶頸。為此，研究人員針對(duì)電活性細(xì)胞底物代謝與電子生成間的關(guān)系，主要從增強(qiáng)底物攝取調(diào)節(jié)因子（關(guān)鍵酶等）、強(qiáng)化質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)、調(diào)節(jié)細(xì)胞膜通透性等3個(gè)方面展開細(xì)致研究。Kasai等［103］通過在S.oneidensis中研究編碼乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因lldP和乳酸脫氫酶基因dld的轉(zhuǎn)錄機(jī)制，首次揭示了胞內(nèi)調(diào)節(jié)乳酸利用的關(guān)鍵因子——環(huán)磷酸腺苷受體蛋白（cAMP receptor protein，CRP），證明CRP通過直接與lldP的上游區(qū)域結(jié)合來正向調(diào)節(jié)lldP和dld基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)S.oneidensisMR-1中的分解代謝過程和呼吸途徑。隨后，該課題組［76］在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了一個(gè)過表達(dá)編碼腺苷酸環(huán)化酶基因cyaC的MR-1突變體，使胞內(nèi)cAMP濃度較野生型提高5倍以上，輸出電流提高約2倍，參與EET過程和厭氧碳分解代謝的相關(guān)基因同時(shí)上調(diào)表達(dá)［圖2（a）］，進(jìn)一步說明CRP作為一種全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子具有提高細(xì)胞乳酸分解代謝和電化學(xué)活性的功能。除了挖掘胞內(nèi)代謝的關(guān)鍵因子的功能作用、強(qiáng)化微生物細(xì)胞本源的底物攝取相關(guān)的功能基因外，近年來研究人員也開發(fā)出許多新策略以探究微生物生理代謝，為設(shè)計(jì)高代謝活性產(chǎn)電細(xì)胞提供新思路。例如，微生物細(xì)胞也可以使用復(fù)雜的光系統(tǒng)或者光依賴的質(zhì)子泵改變膜電位以調(diào)控細(xì)胞生長。視紫紅質(zhì)作為一種光依賴性質(zhì)子泵，具有增強(qiáng)質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)、提高胞內(nèi)代謝能力的功能。研究人員將其引入S.oneidensisMR-1后顯示，視紫紅質(zhì)的功能表達(dá)使細(xì)胞膜電位發(fā)生變化，電流產(chǎn)生顯著增加，該過程主要是由于強(qiáng)化視紫紅質(zhì)的表達(dá)增加了質(zhì)子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，使細(xì)胞兩側(cè)產(chǎn)生了更高的質(zhì)子梯度，進(jìn)而提高了細(xì)胞攝取乳酸的速率，促進(jìn)了S.oneidensis的電子傳遞效率［77］［圖2（b）］。此外，針對(duì)產(chǎn)電細(xì)胞底物攝取轉(zhuǎn)化速率慢等問題，最近的一項(xiàng)研究結(jié)果表明，根據(jù)電子產(chǎn)生動(dòng)力學(xué)分析，電子產(chǎn)生量很大程度上取決于碳源的性質(zhì)，而甲酸鹽因其代謝路徑簡單，受酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)影響較小，電子產(chǎn)生速率較其他碳源（乳酸、丙酮酸等）快2.5倍，被認(rèn)為是一種更為有效的碳源［104］，因此，未來的研究工作可以考慮進(jìn)一步強(qiáng)化甲酸利用，提高產(chǎn)電細(xì)胞高效底物攝取和轉(zhuǎn)化速率。

2.1.2 拓寬底物利用范圍

目前發(fā)現(xiàn)的電活性微生物大多使用乳酸、甲酸等有機(jī)酸作為電子供體，因缺乏其他底物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或是代謝相關(guān)的酶類，而不能利用工業(yè)廢水或生物質(zhì)水解物中更為普遍、豐富且廉價(jià)的有機(jī)底物，如葡萄糖、甘油、木糖等。因此，如何改造電活性細(xì)胞擴(kuò)大其底物利用譜，通過微生物電催化系統(tǒng)將其轉(zhuǎn)化為更有價(jià)值的綠色能源成為研究熱點(diǎn)。在Shewanella菌株中，經(jīng)基因組比較分析發(fā)現(xiàn)，因其缺少糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶（葡萄糖激酶等），而優(yōu)先代謝二碳或三碳化合物作為碳源。Howrad等［105］將S.oneidensisMR-1置于富含葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化，經(jīng)過長時(shí)間誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)馴化后的Shewanella獲得了代謝葡萄糖的能力?；赟hewanella具備代謝葡萄糖的潛能，Choi等［78］在S.oneidensisMR-1中引入了來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和葡萄糖激酶，構(gòu)建了能夠利用葡萄糖的工程菌MR-1。該工程菌能夠在厭氧條件下以葡萄糖作為唯一碳/電子源生長，并且在MFC上運(yùn)行了大約100 h后產(chǎn)生0.085 mA最大電流。然而，與乳酸代謝相比，以葡萄糖為底物的工程菌代謝速率低，需要更多的時(shí)間來釋放電子。因此，為了進(jìn)一步提高葡萄糖攝取效率，將來自大腸桿菌Escherichia coli的葡萄糖代謝系統(tǒng)引入MR-1中，在+0.4 V電位下細(xì)胞能快速氧化葡萄糖并產(chǎn)生電流［106］。然而，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)揭示，從葡萄糖中獲得的最大電流密度（77.3 μA/cm2）比從乳酸中獲得的最大電流密度（140 μA/cm2）低55%，這表明葡萄糖的代謝效率仍然是電能細(xì)胞產(chǎn)電的限制因素。以上結(jié)果表明，傳統(tǒng)的機(jī)械篩選、重組應(yīng)用的手段雖能改造細(xì)胞并改善物質(zhì)代謝能力，但具有明顯的低效性和局限性，并非是最有效篩選和改造基因的方法。近年來，許多新穎的合成生物學(xué)基因編輯方法不斷出現(xiàn)，為高效、快速地進(jìn)行細(xì)胞工程改造提供平臺(tái)。Yu等［107］開發(fā)了一款易于操作的堿基編輯系統(tǒng)pCBEso，該系統(tǒng)將Cas9切口酶［Cas9n（D10A）］和胞苷脫氨酶rAPOBEC1融合，可以在堿基編輯框內(nèi)輕松高效地實(shí)現(xiàn)C至T的轉(zhuǎn)換，而無需雙鏈斷裂或修復(fù)模板。隨后，研究人員使用該工具確定了S.oneidensisMR-1中涉及N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）或葡萄糖代謝的關(guān)鍵基因［圖2（c）］，進(jìn)一步構(gòu)建了具有擴(kuò)展碳源利用譜的工程菌株。結(jié)果顯示當(dāng)葡萄糖或GlcNAc作為唯一碳源時(shí)，其對(duì)多種有機(jī)污染物（偶氮染料和有機(jī)砷化合物）具有明顯高于野生型的降解率。這項(xiàng)研究證實(shí)，基于合成生物學(xué)的工程改造可用于擴(kuò)展電活性微生物細(xì)胞底物譜，為未來高效環(huán)境修復(fù)菌株的構(gòu)建提供新思路。

圖2 強(qiáng)化產(chǎn)電細(xì)胞底物利用能力Fig.2 Enhancement of the substrates utilization capacity of electrogenic cells

除了增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收利用外，研究人員通過工程改造、自適應(yīng)進(jìn)化等策略廣泛開發(fā)了產(chǎn)電細(xì)胞對(duì)于其他普遍、廉價(jià)有機(jī)物（甘油、木糖、乙酸）的攝取能力。例如，在S.oneidensis中將來自E.coli甘油代謝模塊的glpF（甘油誘導(dǎo)酶）、glpK（甘油激酶）、glpD（3-磷酸甘油脫氫酶）、tpiA（磷酸丙糖異構(gòu)酶）基因以及來自Z.mobilis乙醇代謝模塊的pdc（丙酮酸脫羧酶）、adh（乙醇脫氫酶）基因組合后，打通了S.oneidensis甘油攝取和乙醇代謝，同時(shí)敲除細(xì)胞本身的乙酸代謝模塊中的磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶Pta［圖2（d）］，將過剩的胞內(nèi)還原力以電子形式釋放到胞外電極上，成功實(shí)現(xiàn)了甘油向乙醇的高效轉(zhuǎn)化［108］。Sekar等［109］采用自適應(yīng)性進(jìn)化策略，在S.oneidensis中激活了原本沉默的木糖分解代謝途徑。Li等［79］通過模塊化組裝策略，將來自中間假絲酵母（Candida intermedia）和丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，以及來自E.coli的異構(gòu)酶途徑和木糖發(fā)酵酵母（Scheffersomyces stipites）的木糖代謝途徑組合［圖2（e）］，使得工程菌能夠在木糖為唯一碳源和電子供體的環(huán)境中產(chǎn)生最大功率密度2.1 mW/m2。另一方面，乙酸廣泛存在于工業(yè)廢水和木質(zhì)纖維素降解物中，1 mol乙酸完全降解可釋放8 mol電子，被認(rèn)為是一種有前途的碳源和電子供體。然而，厭氧條件下S.oneidensis僅優(yōu)先使用乳酸作為碳源和電子供體，而幾乎不能代謝乙酸。為了使細(xì)胞能夠利用乙酸鹽作為唯一碳源和電子供體，研究人員通過異源表達(dá)來自G.sulfurreducens中編碼乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的基因ato1和ato2，同時(shí)強(qiáng)化S.oneidensis內(nèi)源的檸檬酸合酶基因gltA［圖2（f）］，成功實(shí)現(xiàn)S.oneidensis在厭氧和好氧條件下均能利用乙酸作為碳源，并產(chǎn)生最大功率密度8.3 mW/m2［80］。綜合上述研究方法及結(jié)果顯示，通過自適應(yīng)性進(jìn)化結(jié)合合成生物學(xué)理性設(shè)計(jì)，可不斷拓寬電能微生物的可利用底物范圍，對(duì)進(jìn)一步擴(kuò)展電能細(xì)胞在工業(yè)、環(huán)境等方面的實(shí)際應(yīng)用具有重要意義。

2.2 胞內(nèi)可釋放電子池的合成生物學(xué)強(qiáng)化

電能細(xì)胞胞內(nèi)NADH/NAD+的比例和胞內(nèi)電子池容量大小是影響實(shí)際電子通量的決定性因素。然而，野生型產(chǎn)電細(xì)胞普遍存在還原力合成效率有限和轉(zhuǎn)化再生速率低等問題，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)代謝和能量轉(zhuǎn)化效率不足，嚴(yán)重制約了產(chǎn)電細(xì)胞胞內(nèi)電子生成通量和胞外電子傳遞效率。為此，研究人員采用合成生物學(xué)策略將理性設(shè)計(jì)和模塊化工程相結(jié)合，擴(kuò)充胞內(nèi)可釋放電子池，加快胞內(nèi)還原力再生和轉(zhuǎn)化速率，系統(tǒng)性提高胞內(nèi)電子生成能力。

2.2.1 強(qiáng)化胞內(nèi)還原力生成

NADH作為細(xì)胞內(nèi)主要的電子存儲(chǔ)池，其含量是決定胞內(nèi)電子通量大小的根本因素。NADH/NAD+的比例直接受到胞內(nèi)輔因子合成及胞內(nèi)氧化還原過程的影響。為此，研究人員通過強(qiáng)化合成酶基因表達(dá)、開展多代謝途徑耦合、挖掘可替代路徑等策略，系統(tǒng)地優(yōu)化細(xì)胞內(nèi)NADH的生成水平。例如，Yong等［81］通過 強(qiáng)化P.aeruginosa中NAD+合成酶基因nadE的表達(dá)，使得細(xì)胞內(nèi)電子池總量明顯增加，并且協(xié)同促進(jìn)了胞外電子傳遞載體綠膿菌素的合成和分泌。為了強(qiáng)化胞內(nèi)還原力生成水平，擴(kuò)充細(xì)胞內(nèi)電子池NAD（H/+）的總量，Li等［82］采用合成生物學(xué)模塊化工程策略，對(duì)NAD+的3條合成途徑進(jìn)行了理性設(shè)計(jì)和優(yōu)化，將從頭合成途徑、補(bǔ)救合成途徑和通用合成路徑耦合，從3個(gè)模塊的12個(gè)基因中系統(tǒng)選擇了5個(gè)NAD+生物合成的關(guān)鍵基因ycel（雙功能轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）、pncB（煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）、nadM（NMN腺苷轉(zhuǎn)移酶）、nadD*（NaMN腺苷酸轉(zhuǎn)移酶）、nadE*（NAD+合成酶），通過組合5個(gè)基因以增強(qiáng)NAD+的合成能力［圖3（a）］。與野生型S.oneidensis相比，工程菌株胞內(nèi)電子池NAD（H/+）增加2.1倍，最大功率密度提高4.4倍。這些結(jié)果表明，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)NAD（H/+）合成使更多可用電子轉(zhuǎn)移到EET途徑中，從而提高細(xì)胞內(nèi)電子通量和產(chǎn)電性能。最近，Ding等［86］新建立了從分支酸開始的新喹啉酸途徑（稱為C3N途徑），為NAD+生物合成提供了替代途徑。與NAD+從頭生物合成相比，這種新的合成途徑可以利用分支酸作為煙酰胺的前體，有效規(guī)避了對(duì)NAD+從頭生物合成的限制性因素，并且僅由C3N途徑產(chǎn)生的NAD（H/+）濃度增加了9.7倍。毫無疑問，上述研究均表明通過模塊化工程策略或是開拓新型代謝路徑，皆是增強(qiáng)胞內(nèi)電子通量的有效手段。未來的研究可以進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞內(nèi)的代謝流進(jìn)行探究和揭示，以提供更加理性的合成生物學(xué)設(shè)計(jì)思路，不斷增強(qiáng)胞內(nèi)可釋放電子池，擴(kuò)寬還原力合成新路徑，為電能細(xì)胞的大規(guī)模實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

圖3 強(qiáng)化胞內(nèi)可釋放電子池Fig.3 Strengthening of intracellular releasable electron pools

2.2.2 提高胞內(nèi)還原力轉(zhuǎn)化

儲(chǔ)存在胞內(nèi)還原力中的電子，在脫氫酶的作用下，匯入醌池實(shí)現(xiàn)還原力到電子的轉(zhuǎn)化。作為細(xì)胞內(nèi)主要的電子源，NADH的轉(zhuǎn)化效率直接影響細(xì)胞外電子傳遞效率。為了使胞內(nèi)合成代謝更多地流向利于NADH再生的方向，研究人員主要通過篩選、增強(qiáng)、優(yōu)化NADH合成路徑中的關(guān)鍵基因，多路徑提高胞內(nèi)還原力轉(zhuǎn)化效率。Li等［83］通過強(qiáng)化S.oneidensis中糖酵解、C1代謝、丙酮酸發(fā)酵和TCA循環(huán)途徑加強(qiáng)NADH再生能力和還原力轉(zhuǎn)化效率，經(jīng)過上述4種途徑的篩選，最終確定了由gapA2（NAD+依賴性甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、pflB（丙酮酸甲酸裂解酶）、fdh*（NAD+依賴性甲酸脫氫酶）和mdh（NAD+依賴性蘋果酸脫氫酶）等基因編碼的關(guān)鍵NADH依賴性酶，顯著參與了還原力的再生和轉(zhuǎn)化過程［圖3（b）］。通過組合表達(dá)4個(gè)關(guān)鍵基因后，工程菌內(nèi)NAD（H/+）的比例提高4.3倍，電子轉(zhuǎn)移速率明顯加快，其輸出功率密度較野生型提高3倍。此外，為了提高細(xì)胞整體電子通量，增強(qiáng)NADH氧化也是一個(gè)重要策略。Vamshi Krishna等［85］發(fā)現(xiàn)表達(dá)NDH-2基因（位于E.coli內(nèi)膜的非質(zhì)子泵NADH脫氫酶）可使更多的電子通過氧化呼吸鏈流入EET途徑，而不受細(xì)胞膜高質(zhì)子動(dòng)力的影響。NDH-2酶的過表達(dá)導(dǎo)致整體電子通量顯著增加，與野生菌株（0.52 μA）相比，工程菌電流增加了9倍（4.7 μA）。進(jìn)一步的研究表明，NDH-2的表達(dá)不僅增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)NADH的氧化，降低了電荷轉(zhuǎn)移電阻，同時(shí)也促進(jìn)了電極生物膜的形成［圖3（c）］。類似地，Shewanella loihicaPV-4中發(fā)現(xiàn)的具有較強(qiáng)催化活性NADH脫氫酶NADⅡ，在S.oneidensisMR-1異源表達(dá)后，極大增強(qiáng)了MR-1的還原力到電子的轉(zhuǎn)化速率，其最大功率密度達(dá)到2277.4 mW/m2，較同等條件下野生型MR-1提高2倍［110］。上述結(jié)果證明這種調(diào)控細(xì)胞內(nèi)還原當(dāng)量的工程策略是調(diào)控提高電活性細(xì)胞電子傳遞效率的有效方法，為未來進(jìn)一步增加細(xì)胞內(nèi)電子池的容量和轉(zhuǎn)化效率提供了新的方向。

2.3 胞外電子傳遞的合成生物學(xué)強(qiáng)化

產(chǎn)電細(xì)胞的胞外電子傳遞效率是影響生物電催化系統(tǒng)的核心因素，近年來針對(duì)這一關(guān)鍵影響因素，研究人員采用合成生物學(xué)策略，分別從優(yōu)化色素蛋白元件、構(gòu)建導(dǎo)電納米線系統(tǒng)、促進(jìn)電子載體合成及分泌、調(diào)控電活性生物膜形成等4個(gè)方面，進(jìn)行多角度、全方位的提高微生物胞外電子傳遞效率和微生物電化學(xué)系統(tǒng)的產(chǎn)電性能。

2.3.1 優(yōu)化色素蛋白系統(tǒng)介導(dǎo)的電子傳遞

細(xì)胞色素蛋白是電子跨越絕緣細(xì)胞膜的通道，連接了胞內(nèi)電子生成系統(tǒng)與胞外電子傳遞系統(tǒng)。色素系統(tǒng)從空間上具體分為外膜細(xì)胞色素、周質(zhì)空間細(xì)胞色素和內(nèi)膜細(xì)胞色素復(fù)合物。近年來，研究人員分別針對(duì)外膜、內(nèi)膜及周質(zhì)空間中的細(xì)胞色素蛋白進(jìn)行了異源表達(dá)、篩選優(yōu)化、模塊組裝等，顯著增強(qiáng)了產(chǎn)電細(xì)胞以色素蛋白介導(dǎo)的直接電子傳遞效率。例如，Ajo-Franklin組［87］最先將S.oneidensisMR-1的外膜色素蛋白MtrCAB復(fù)合體重組到大腸桿菌中［圖4（a）］，相較于野生型菌株，工程菌的金屬離子還原速率提高8倍。但工程化的E.coli色素蛋白表達(dá)量有限，且表現(xiàn)出明顯的生長抑制作用。因此，該課題組［111］建立1個(gè)由可調(diào)誘導(dǎo)系統(tǒng)和組成型啟動(dòng)子構(gòu)成的菌株文庫，篩選獲得MtrC和MtrA表達(dá)水平較原工程菌提高2.2倍，且細(xì)胞生長得到明顯改善的菌株。最新研究揭示E.coli細(xì)胞色素c成熟（cytochrome c maturation，Ccm）系統(tǒng)與S.oneidensis細(xì)胞色素c的兼容性較差，限制了工程E.coli的電化學(xué)性能。為此，研究人員設(shè)計(jì)構(gòu)建了E.coli和S.oneidensis的Ccm融合表達(dá)系統(tǒng)，使得融合表達(dá)Ccm的E.coli色素蛋白CymA表達(dá)量增加60%，總電流增加了121%，單細(xì)胞的電子通量提高至12.3 fA［88］［圖4（b）］。

圖4 優(yōu)化色素蛋白介導(dǎo)的直接電子傳遞Fig.4 Optimization of cytochrome mediated direct electron transfer

另一方面，內(nèi)膜c型細(xì)胞色素CymA將細(xì)胞代謝獲得的電子傳遞給末端周質(zhì)還原酶，是電子傳遞鏈中至關(guān)重要的一步。當(dāng)cymA突變時(shí)，電流生成量減少約80%；反之，過表達(dá)cymA可提高最大輸出功率至0.13 mW（野生型為0.11 mW）［90］［圖4（c）］。同樣，優(yōu)化周質(zhì)色素蛋白網(wǎng)絡(luò)也是增強(qiáng)EET的關(guān)鍵策略。周質(zhì)空間中分布著多種c型細(xì)胞色素，構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的電子傳遞網(wǎng)絡(luò)。為了降低周質(zhì)中電子傳遞網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，消除周質(zhì)空間中潛在的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，Gescher等［112］敲除周質(zhì)色素基因nrfA、ccpA、napB和napA，并在相應(yīng)敲除位點(diǎn)表達(dá)色素蛋白CctA。結(jié)果顯示細(xì)胞外電子轉(zhuǎn)移率隨著cctA基因拷貝數(shù)的增加而逐漸增加，電流密度增加了23%。這表明降低周質(zhì)細(xì)胞色素網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性可以改變細(xì)胞外氧化還原電位并加速電子轉(zhuǎn)移。最新研究顯示，周質(zhì)色素CctA的過表達(dá)可以加速從CymA到MtrCAB的電子轉(zhuǎn)移［圖4（d）］。相比之下，周質(zhì)中過多的色素蛋白NapB、FccA和TsdB則嚴(yán)重?fù)p害EET效率，使之降低50%以上，這表明冗雜的周質(zhì)色素環(huán)境可能導(dǎo)致電子傳遞效率損失。基于這一發(fā)現(xiàn)，研究人員最終通過同時(shí)突變周質(zhì)色素蛋白基因napB、fccA和tsdB并過表達(dá)cctA構(gòu)建了高效電活性菌株，使得最高功率密度達(dá)到436.5 mW/m2，較野生型提高約3.62倍［91］。這一系列工作表明，微生物自然進(jìn)化出的電子傳輸途徑可能并非是最優(yōu)路徑，通過人工干預(yù)理性設(shè)計(jì)重建電子傳輸途徑是解決當(dāng)前生物電化學(xué)系統(tǒng)中電子傳輸能力低的問題的有效方法。

2.3.2 強(qiáng)化導(dǎo)電納米線介導(dǎo)的電子傳遞

產(chǎn)電細(xì)胞除了能夠通過細(xì)胞外膜表面的細(xì)胞色素蛋白進(jìn)行直接電子傳遞外，也能通過基于導(dǎo)電菌毛e-Pili或細(xì)胞色素形成的導(dǎo)電納米線進(jìn)行傳遞［113］。然而，由于菌株間的差異性和生長條件的不同，細(xì)胞色素納米線的表達(dá)豐度具有高度可變性，并且由于自身天然形成的精密排列結(jié)構(gòu)，而導(dǎo)致實(shí)際工程改造存在困難［113-114］。相比之下，導(dǎo)電菌毛納米線因其組成結(jié)構(gòu)簡單、機(jī)制研究相對(duì)清晰而極具工程化前景。因此，近年來針對(duì)導(dǎo)電納米線的研究工作主要集中在調(diào)控菌毛單體蛋白（pilA）芳香族氨基酸含量、挖掘pili組裝機(jī)制調(diào)控分泌系統(tǒng)、設(shè)計(jì)多肽結(jié)構(gòu)修飾菌毛單體等方面，系統(tǒng)性強(qiáng)化菌毛導(dǎo)電率和拓寬納米線的應(yīng)用范圍。例如，通過結(jié)構(gòu)解析、計(jì)算模擬確定氨基酸靶點(diǎn)，進(jìn)行定向突變篩選的策略方法，研究人員將色氨酸摻入菌毛中使得單個(gè)細(xì)絲的電導(dǎo)率提高超過80倍，通過在E.coli基因組中重新編碼設(shè)計(jì)，對(duì)非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸炔丙基氧基苯丙氨酸進(jìn)行基因編碼修飾，使菌毛作為功能支架，用于精確、特異性結(jié)合金納米顆粒，形成有序的有機(jī)-無機(jī)雜化生物材料［圖5（a）］，使其導(dǎo)電性提高了170倍［115］。除了改變結(jié)構(gòu)增加菌毛電導(dǎo)率外，促進(jìn)菌毛合成組裝近年來受到更多關(guān)注。例如，Liu等［116］首次在G.sulfurreducens中鑒定出一種菌毛合成的伴侶蛋白（short pilin chaperone，Spc），Spc可以通過靜電相互作用與pilA結(jié)合形成穩(wěn)定的Spc-pilA復(fù)合體以支持菌毛蛋白組裝［圖5（b）］。這一研究表明，菌毛的組裝分泌是一個(gè)復(fù)雜過程，僅強(qiáng)化pilA自身的表達(dá)似乎無法完全實(shí)現(xiàn)菌毛的高效合成。由于Geobacter培養(yǎng)需要嚴(yán)格厭氧的環(huán)境，遺傳操作和大規(guī)模培養(yǎng)難度高，為了獲得大量導(dǎo)電菌毛拓展 新 的 應(yīng) 用，Lovley等［117-118］采 用E.coli作 為底盤菌，在敲除自身菌毛蛋白的基礎(chǔ)上，重構(gòu)四型菌毛合成系統(tǒng)GspilA，從而獲得了與G.sulfurreducens中表達(dá)相同的導(dǎo)電菌毛結(jié)構(gòu)（直徑3 nm）和電導(dǎo)率，該方法為常規(guī)培養(yǎng)條件下大規(guī)模制造新型e-Pili提供了新的途徑［圖5（c）］。除了設(shè)計(jì)菌毛結(jié)構(gòu)以提升電活性細(xì)胞導(dǎo)電性外，采用多肽修飾菌毛單體結(jié)構(gòu)可以增加菌毛的黏附力，促進(jìn)電活性生物膜的形成和新型生物材 料 的 開 發(fā)。Ueki等［119］設(shè) 計(jì) 短 肽 標(biāo) 簽 與G.sulfurreducens菌毛的羧基端融合，在不影響其導(dǎo)電率的前提下，可產(chǎn)生特異性黏附力的導(dǎo)電納米線結(jié)構(gòu)。合成的基因片段包含pilA-6His和pilAHA，從而產(chǎn)生具有“His-tag”和肽“HA-tag”的導(dǎo)電菌毛［圖5（d）］，這些肽標(biāo)簽暴露于細(xì)胞外表面可以與金屬和相應(yīng)抗體結(jié)合，在開發(fā)新材料和裝置方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。基于上述多樣的研究設(shè)計(jì)可以看出，基于導(dǎo)電納米線構(gòu)建高電活性微生物細(xì)胞的方法為新型的微生物電催化提供了新的思路，而納米線的多樣化修飾也是將細(xì)胞黏附到特定表面、增強(qiáng)與胞外基質(zhì)的相互作用以生產(chǎn)柔性導(dǎo)電產(chǎn)品的新途徑。

圖5 強(qiáng)化導(dǎo)電納米線介導(dǎo)的電子傳遞Fig.5 Enhancement of electron transport mediated by conductive nanowires

2.3.3 強(qiáng)化胞外電子載體介導(dǎo)的電子傳遞

由于細(xì)胞膜中存在的空間阻礙作用，產(chǎn)電細(xì)胞除了通過直接接觸式電子傳遞外，還可利用電子傳遞介體（黃素類、吩嗪類）介導(dǎo)間接電子傳遞過程［120］。近年來，研究人員通過強(qiáng)化電子載體合成路徑，提高電子載體分泌能力，解決了因電子載體合成不足而導(dǎo)致的電活性效率低下的問題。以S.oneidensis為例，因其內(nèi)源性核黃素表達(dá)量極低，Yang等［74］在S.oneidensisMR-1中異源表達(dá)來自枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis中編碼核黃素合成的核心基因簇（ribADEHC）［圖6（a）］，使工程菌合成的黃素濃度相較野生型增加25.7倍，雙向電子轉(zhuǎn)移率分別增加了約13.2倍（電子向外傳遞）和15.5倍（電子向內(nèi)傳遞）。結(jié)果表明，強(qiáng)化電子傳遞載體的生物合成是提高胞外電子傳遞效率的直接有效策略。然而，胞內(nèi)過多的氧化還原活性分子累積會(huì)引起細(xì)胞毒性，進(jìn)而影響細(xì)胞生長代謝。為此，Yong等［121］異源表達(dá)來自P.aeruginosa孔蛋白OprF，可顯著增加細(xì)胞膜通透性，使菌株更有效地分泌利用核黃素，從而提高系統(tǒng)的電子輸出性能。在此基礎(chǔ)上，Lin等［92］通過篩選最適的啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步優(yōu)化核黃素合成，結(jié)合外膜孔蛋白強(qiáng)化核黃素分泌路徑，促進(jìn)細(xì)胞黃素的生物合成和轉(zhuǎn)運(yùn)速率，構(gòu)建S.oneidensis三維生物膜結(jié)構(gòu)［圖6（b）］，極大提高了陽極細(xì)胞附著量，使得系統(tǒng)內(nèi)最大輸出功率密度較野生型提高約18.8倍，達(dá)到2.63 W/m2。最近的研究顯示，S.oneidensisMR-1自分泌的黃素不僅作為電子載體，還可作為氧化還原輔因子與外膜細(xì)胞色素蛋白結(jié)合［57］，顯著提高胞外電子傳遞效率。而通過共同強(qiáng)化S.oneidensis的黃素生物合成基因簇（ribDCBAE）和色素蛋白生物合成基因簇（mtrCAB）［圖6（c）］，使電極上的生物附著量顯著提高，電流輸出密度增加了110%［122］。此外，P.aeruginosa主要通過自身合成分泌的吩嗪-1-酰胺、吩嗪-1-羧酸、綠膿菌素等氧化還原介質(zhì)與電極進(jìn)行間接電子傳遞［123］。Feng等［89］通過在E.coli中引入P.aeruginosa的PCA合成途徑（phzA1B1C1D1E1F1G1），工程菌分泌的PCA濃度明顯增強(qiáng)，使MFC功率密度提高10倍，達(dá)到181.1 mW/m2。最近，F(xiàn)an等［93］開發(fā)iEditing快速基因組編輯工具將PCA合成基因簇和G.sulfurreducens的直接電子轉(zhuǎn)移鏈ombB-omaB-omcB-omcS，整合至S.oneidensis基因組中［圖6（d）］，顯著強(qiáng)化了細(xì)胞直接和間接電子傳遞效率，其PCA合成和細(xì)胞色素c表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，產(chǎn)生最高電流密度達(dá)310.2 mA/m2，是野生型的1.84倍。未來針對(duì)電子載體的研究除了可以繼續(xù)通過多樣化的基因線路途經(jīng)動(dòng)態(tài)調(diào)控電子傳遞載體的表達(dá)和分泌，同時(shí)應(yīng)關(guān)注電子載體在生物膜中的活性效率，運(yùn)用化學(xué)方法或生物學(xué)方法將電子載體固定在生物膜內(nèi)部，減少電子傳遞載體擴(kuò)散，而降低電子傳遞損失，進(jìn)一步為微生物電催化在微生物燃料電池、生物修復(fù)、生物電合成、納米材料生產(chǎn)等方面的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

圖6 強(qiáng)化胞外電子載體介導(dǎo)的電子傳遞Fig.6 Enhancement of shuttlemediated electron transport

2.4 電活性生物膜的合成生物學(xué)強(qiáng)化

電活性生物膜主要是通過胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）與電活性細(xì)胞交聯(lián)形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。其中，生物膜基質(zhì)成分包括胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）、胞外多聚糖、胞外蛋白等［124-125］，含量約占生物膜有機(jī)物總量的90%以上［126］。同時(shí)，這些EPS成分還受到細(xì)胞內(nèi)部調(diào)控元件的多維調(diào)控，在生物膜形成模式、成分組成、厚度穩(wěn)定和代謝效率等多方面，進(jìn)行時(shí)間和空間上的調(diào)控。本節(jié)綜述了生物膜中EPS成分以及多種調(diào)控因子的研究進(jìn)展。

2.4.1 調(diào)控胞外結(jié)構(gòu)成分

（1）eDNA eDNA是EPS主要成分之一，由微生物通過自身分泌或裂解等方式釋放到胞外的核酸分子。大量研究表明eDNA在穩(wěn)定生物膜電荷、提供生物膜結(jié)構(gòu)剛性、保護(hù)細(xì)胞免受宿主防御反應(yīng)等方面起到至關(guān)重要的作用［127］。Furst等［128］利用eDNA具有黏附性的特點(diǎn)，通過借助DNA本身具有堿基配對(duì)原則，將S.oneidensis細(xì)胞有序且可調(diào)控地附著到電極表面，利用DNA本身可作為連接細(xì)胞和電極的高速電子通道輔助介導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，使得微生物電化學(xué)系統(tǒng)可重復(fù)地產(chǎn)生高水平的電流。除了作為生物黏合劑外，eDNA也是細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-非生物界面相互作用的主要介質(zhì)，eDNA能夠與吩嗪結(jié)合使其保留在生物膜中，促進(jìn)P.aeruginosa生物膜內(nèi)部電子轉(zhuǎn)移效率［129］。總體來說，針對(duì)電能細(xì)胞電子傳遞效率低，生物膜結(jié)構(gòu)松散、不穩(wěn)定等問題，工程細(xì)胞eDNA可能是一種潛在的優(yōu)化策略。

（2）胞外多糖胞外多糖是EPS基質(zhì)中的主要組成部分，與生物膜電導(dǎo)率和穩(wěn)定性密切相關(guān)。為了促進(jìn)多糖合成，Zhuang等［99］在G.sulfurreducens中，過表達(dá)基因GSU1501（多糖生物合成基因），使細(xì)胞外多糖分泌提高了25.5%，促進(jìn)了具有更高厚度和活性的生物膜形成，同時(shí)提高了細(xì)胞外c型細(xì)胞色素的含量。與對(duì)照菌株相比，該突變體表現(xiàn)出更高的Fe(Ⅲ)氧化物還原能力和電流產(chǎn)生能力。除了上述啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)基因等傳統(tǒng)方法外，最新研究聚焦開發(fā)新型合成基因線路，通過實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的調(diào)控基因表達(dá)提升不同條件下的胞外多糖產(chǎn)量。Zhang等［130］利用CRISPRi/dCas9開發(fā)了調(diào)節(jié)胞外多糖合成的基因線路，通過使用遺傳光開關(guān)抑制wcaf基因，調(diào)控大腸桿菌生物膜厚度?？傮w來說，胞外多糖可能是穩(wěn)定電活性生物膜結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素。未來除了在繼續(xù)探索多糖與胞外基質(zhì)間的相互作用外，還可以繼續(xù)開發(fā)多樣化的基因調(diào)控線路，開發(fā)控制和維持生物膜穩(wěn)定性的策略，為電活性生物膜在環(huán)境處理和生化合成相關(guān)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

（3）胞外蛋白在生物膜胞外基質(zhì)中存在有大量蛋白質(zhì)成分，主要分為促進(jìn)生物膜形成的黏性蛋白（CdrA、AggA、BfpA等）和起穩(wěn)定作用的結(jié)構(gòu)蛋白（鞭毛、curli、菌毛等）。研究人員發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的高度聚集狀態(tài)與凝集素AggA的分泌有關(guān)，AggA的突變會(huì)導(dǎo)致生物膜超聚集特性的喪失［131］。而在P.aeruginosa中，CdrA作為一種主要的細(xì)胞外黏附素，可通過與多糖分子交聯(lián)來增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的強(qiáng)度，將細(xì)胞錨定在基質(zhì)中［132］。

除了發(fā)揮細(xì)胞間黏附功能的黏性蛋白外，生物膜基質(zhì)中還存在有大量起結(jié)構(gòu)支撐作用的結(jié)構(gòu)蛋白（curli和鞭毛）。curli是許多腸桿菌科產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白成分［133］。Yong等［134］將融合了金屬結(jié)合域的curli雜化蛋白均勻表達(dá)于細(xì)胞表面，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞與不銹鋼電極的高效結(jié)合，使陽極輸出功率提高了約420倍。另一種胞外結(jié)構(gòu)蛋白——鞭毛，也同樣在電活性生物膜的形成過程（特別是初始黏附以及后期分散再形成新的生物膜過程）和電子傳遞過程中發(fā)揮重要作用［135］。Liu等［136］證明鞭毛促進(jìn)了工程菌更厚的生物膜的形成，并作為生物膜基質(zhì)支架以有序的方式容納更多的細(xì)胞外細(xì)胞色素，從而增加了生物膜內(nèi)的電子擴(kuò)散速率。該研究也進(jìn)一步證明鞭毛除了作為負(fù)責(zé)運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞器外，還是促進(jìn)細(xì)胞不同環(huán)境生態(tài)位中定植的重要因素，促進(jìn)細(xì)胞在電極表面黏附以及細(xì)菌群落形成。上述研究結(jié)果表明，通過調(diào)控黏附蛋白和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)可以調(diào)節(jié)生物膜的空間結(jié)構(gòu)，以及調(diào)控生物膜中物質(zhì)和電子的空間傳輸。

2.4.2 增強(qiáng)胞內(nèi)調(diào)控因子

（1）細(xì)菌群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）QS是細(xì)菌細(xì)胞之間通過感受自誘導(dǎo)物來調(diào)控細(xì)菌群體行為的現(xiàn)象。典型的QS系統(tǒng)包括一個(gè)N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acyl-homoserine lactones，AHLs）型合酶和一個(gè)信號(hào)感應(yīng)LuxR受體，當(dāng)AHLs在細(xì)胞內(nèi)不斷累積后與受體蛋白LuxR結(jié)合，激活或抑制靶基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控生物膜形成進(jìn)程［137］。因此，AHLs信號(hào)是調(diào)控QS系統(tǒng)、影響電活性生物膜形成的重要因素。Jing等［138］發(fā)現(xiàn)外源性添加或內(nèi)源性分泌AHLs可以縮短生物膜形成時(shí)間和增強(qiáng)生物膜電化學(xué)活性。其中內(nèi)源性AHLs可以通過上調(diào)EPS合成的關(guān)鍵基因來提高胞外蛋白的相對(duì)豐度，而外源性AHLs通過促進(jìn)酰胺Ⅱ的形成和強(qiáng)化羰基和酰胺之間的H鍵形成以促進(jìn)生物膜形成。Li等［139］利用QS系統(tǒng)的遺傳組件構(gòu)建了群體檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長與代謝解耦，該系統(tǒng)將主要代謝通量從初始細(xì)菌生長轉(zhuǎn)移到隨后的胞外電子傳遞增強(qiáng)階段，使菌株電子傳遞速率增強(qiáng)了4.8倍［圖7（a）］，甲基橙和六價(jià)鉻的還原效率分別提高了18.8倍和5.5倍，在環(huán)境污染治理領(lǐng)域展現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力。上述的合成生物學(xué)改造結(jié)果表明，基于QS系統(tǒng)的遺傳調(diào)節(jié)工程改造不僅有助于改造微生物的電化學(xué)活性和代謝活性，同時(shí)能提高生物膜中的電極生物量和活死細(xì)胞比例，進(jìn)而更有利于增強(qiáng)微生物電催化系統(tǒng)的生產(chǎn)。未來進(jìn)一步探索QS系統(tǒng)特異性背后的分子機(jī)制，將深化我們對(duì)自然群落中的通信網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)知，更有利于開發(fā)高效操縱自然群落的新型細(xì)胞通信工具。

圖7 強(qiáng)化胞內(nèi)調(diào)控元件介導(dǎo)的電活性生物膜形成Fig.7 Enhanced intracellular regulatory element to promote electroactive biofilm formation

（2）環(huán)狀二核苷酸環(huán)狀二核苷酸是一種在微生物細(xì)胞中調(diào)控多種生物學(xué)過程且高度通用的信號(hào)分子，目前研究發(fā)現(xiàn)了多種信號(hào)分子，主要有c-di-AMP、c-di-GMP、cAMP-GMP等。其中，c-di-GMP被認(rèn)為廣泛參與細(xì)菌生物膜形成過程，通過濃度變化調(diào)節(jié)細(xì)胞附著和分離狀態(tài)進(jìn)而控制生物膜的形態(tài)［140］。最近發(fā)現(xiàn)的bolA基因是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可以平衡c-di-GMP濃度以促進(jìn)生物膜形成［141-142］。Moreira等［143］揭示了bolA和c-di-GMP信號(hào)分子之間的直接聯(lián)系，并發(fā)現(xiàn)它們同時(shí)參與了生物膜形成的調(diào)節(jié)。這兩個(gè)因素通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)相互平衡來切換生物膜的形成和運(yùn)動(dòng)模式。然而，通過機(jī)械地引入組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來啟動(dòng)基因的表達(dá)，會(huì)出現(xiàn)不可避免的啟動(dòng)時(shí)間延遲，難以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)操縱細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP水平。相比之下，光遺傳學(xué)方法是快速、無創(chuàng)和可靶向操作細(xì)胞的理想工具，相較傳統(tǒng)工程改造具有較高的時(shí)空分辨率。Hu等［144］在E.coli中利用光敏色素c-di-GMP合成酶BphS和發(fā)色團(tuán)膽綠素合成酶BphO構(gòu)建新型邏輯門。其中BphS包含光感受器域（可與發(fā)色團(tuán)膽綠素結(jié)合）和DGC輸出域（促進(jìn)c-di-GMP合成）［圖7（b）］，當(dāng)體系中含有IPTG時(shí)，紅外光開啟c-di-GMP合成進(jìn)而促進(jìn)生物膜形成，使系統(tǒng)內(nèi)電能輸出能力進(jìn)一步提高。隨后，研究人員通過該系統(tǒng)調(diào)控生物膜形成，以催化吲哚轉(zhuǎn)化為色氨酸，使色氨酸產(chǎn)量增加30%［145］。由于c-di-GMP信號(hào)通路調(diào)節(jié)的細(xì)菌行為存在多功能輸出可能，未來的研究可以探索新型遺傳工具的開發(fā)以解決現(xiàn)有的問題或補(bǔ)充現(xiàn)有技術(shù)。

（3）全局調(diào)控因子在微生物細(xì)胞中存在多種全局代謝調(diào)控的因子，這些調(diào)節(jié)因子可以靶向細(xì)胞多個(gè)代謝調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝生理、菌落形態(tài)以及電子傳遞過程。RpoS調(diào)節(jié)子是目前研究最深入的全局調(diào)節(jié)因子，作為一種典型的σ因子在細(xì)胞生長穩(wěn)定期發(fā)揮作用。Yu等［100］通過敲除RpoS，獲得的P.aeruginosa工程菌可形成致密而穩(wěn)定的生物膜，且輸出電流較野生型提高50%，達(dá) 到4.2 μA/cm2。此 外，cAMP-CRP復(fù) 合 體 在S.oneidensis中表現(xiàn)出可調(diào)節(jié)多種分解代謝和調(diào)控EET相關(guān)基因的表達(dá)［圖7（c）］，Cheng等［98］通過在S.oneidensis中引入來自土壤細(xì)菌Beggiatoasp.PS的腺苷酸環(huán)化酶的外源基因，顯著提高了胞內(nèi)的cAMP水平，積累的cAMP-CRP復(fù)合物正向調(diào)節(jié)編碼c型細(xì)胞色素和黃素生物合成相關(guān)基因表達(dá)水平，使Cr(Ⅵ)還原速率提高3倍。同樣，Luo等［101］將Deinococcus radiodurans中編碼極端抗輻射性的全局調(diào)節(jié)器IrrE引入到P.aeruginosa中，結(jié)果顯示，基因irrE可賦予細(xì)胞更高的電子傳遞載體的合成和分泌，并且顯著影響了底物利用效率，改善了細(xì)胞生長狀態(tài)和對(duì)各種環(huán)境壓力的耐受性。定量RT-PCR分析表明，全局調(diào)節(jié)器IrrE能夠開啟參與不同代謝和信號(hào)通路的基因表達(dá)，包括生物膜形成、QS系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、葡萄糖代謝和一系列應(yīng)激反應(yīng)［圖7（d）］，結(jié)果顯示工程菌株功率密度提高了70%。為了進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞對(duì)外源全局調(diào)節(jié)器IrrE的適應(yīng)性，該課題組［102］通過易錯(cuò)PCR構(gòu)建了IrrE突變文庫，篩選出具有更高電活性和更優(yōu)環(huán)境抗逆性的突變菌株。綜合上述研究結(jié)果顯示，通過優(yōu)化設(shè)計(jì)全局調(diào)節(jié)因子來靶向胞內(nèi)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而強(qiáng)化微生物電活性是一種簡便有效的方法，在實(shí)際應(yīng)用中存在巨大潛力。

3 噬電細(xì)胞合成生物學(xué)改造

在全球變暖和溫室氣體積累的環(huán)境下，噬電細(xì)胞天然的電催化特性能夠有效減少CO2排放、強(qiáng)化CO2捕獲和轉(zhuǎn)化，為雙碳減排提供了新的策略［146］。以噬電細(xì)胞為生物催化劑的微生物電合成系統(tǒng)，通過從胞外電極上獲取電子并轉(zhuǎn)化為自身還原力，來催化CO2、N2等合成高附加值化學(xué)品，該過程包括胞外電子跨膜傳遞，胞內(nèi)還原力轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物定向合成［147］。然而，由于該過程中電子跨膜傳遞速率慢、胞內(nèi)還原力轉(zhuǎn)化效率低、胞內(nèi)能量流（即還原力NADPH和ATP）驅(qū)動(dòng)高值化學(xué)品合成的定向性差等瓶頸，嚴(yán)重制約了電能到化學(xué)能的高效轉(zhuǎn)化。因此，本章節(jié)匯總了近年來研究人員運(yùn)用合成生物學(xué)策略（表2）：①強(qiáng)化噬電細(xì)胞電子攝取和轉(zhuǎn)化效率，獲得具有電能轉(zhuǎn)化效率高、胞內(nèi)合成代謝速率快的噬電工程菌；②挖掘噬電細(xì)胞高值化學(xué)品合成最優(yōu)路徑，構(gòu)建產(chǎn)物生成量大、定向性強(qiáng)的微生物細(xì)胞工廠，實(shí)現(xiàn)電能驅(qū)動(dòng)的化學(xué)品高效定向生物合成。

表2 噬電細(xì)胞的合成生物學(xué)改造匯總Tab.2 Summary of engineering electrotrophs by synthetic biology

3.1 工程強(qiáng)化噬電細(xì)胞電子攝取和轉(zhuǎn)化

噬電微生物細(xì)胞可通過直接或間接的方式攝取電子，而基于電子載體的間接傳遞方式，因其需要更高的電勢(shì)差，以及天然的細(xì)胞毒性，極大地限制了其廣泛應(yīng)用。相比之下，通過細(xì)胞色素介導(dǎo)的電子傳遞路徑可直接向微生物提供電子，更具可持續(xù)性和能源效益。為此，研究人員通過構(gòu)建基于細(xì)胞色素直接噬電的電子傳遞路徑，克服電子攝取屏障等方法強(qiáng)化噬電細(xì)胞電子傳遞效率。例如，Dong等［150］設(shè)計(jì)了一種基于細(xì)胞色素蛋白OmcS的直接噬電的跨膜噬電途徑，在具有N2固定活性的工程化細(xì)長聚球藻（Synechococcus elongatusPCC 7942）中，表達(dá)來自于Geobacter的外膜細(xì)胞色素蛋白OmcS，使得工程化后的細(xì)胞表現(xiàn)出高效的跨膜噬電能力，其NH3產(chǎn)率較原始工程菌提高約13倍［圖8（a）］。同樣，Wu等［149］通過在E.coli中異源表達(dá)S.oneidensis的細(xì)胞色素蛋白MtrCAB、FccA、CymA，構(gòu)建基于MtrCAB-FccACymA色素蛋白復(fù)合體的細(xì)胞噬電路徑，使得E.coli能夠噬取胞外電子并轉(zhuǎn)化為自身還原力，構(gòu)建了一個(gè)具有琥珀酸生產(chǎn)功能的電活性細(xì)胞工廠，琥珀酸產(chǎn)量較親本提高1.6倍［圖8（b）］。雖然引入Mtr途徑后能夠改善細(xì)胞琥珀酸生產(chǎn)效率，但由于對(duì)細(xì)胞噬電的電子傳遞機(jī)制的理解有限，其工程改造效率并沒有實(shí)現(xiàn)數(shù)量級(jí)突破。因此，為進(jìn)一步揭示電子攝取機(jī)制，F(xiàn)eng等［157］報(bào)道將來自S.oneidensisMR-1的MtrCAB途徑蛋白整合到表達(dá)ccmABCDEFGH的E.coli中。通過電化學(xué)壓力的選擇，進(jìn)化出具有良好電損傷抵抗力的菌株。進(jìn)一步探究內(nèi)向電子傳遞機(jī)理時(shí)，發(fā)現(xiàn)敲除napC（編碼內(nèi)膜c型細(xì)胞色素）和menA（甲基萘醌合成關(guān)鍵酶）后，幾乎不產(chǎn)生琥珀酸，從而證明甲基萘醌是內(nèi)向EET的關(guān)鍵成分［圖8（c）］。除了利用細(xì)胞色素構(gòu)建向內(nèi)電子傳遞路徑外，研究人員發(fā)現(xiàn)通過結(jié)合光合質(zhì)子泵亦能輔助細(xì)胞克服電子攝取屏障，催化胞內(nèi)還原力轉(zhuǎn)化。例如，Tefft等［148］基于S.oneidensis天然的Mtr途徑和NADH脫氫酶，通過異源表達(dá)光驅(qū)動(dòng)質(zhì)子泵蛋白視紫紅質(zhì)以產(chǎn)生質(zhì)子動(dòng)力，反向驅(qū)動(dòng)NADH脫氫酶來催化細(xì)胞內(nèi)的還原力生成。在光驅(qū)動(dòng)質(zhì)子泵的作用下，電極電子經(jīng)Mtr蛋白復(fù)合體轉(zhuǎn)移至內(nèi)膜醌池，并在NADH脫氫酶作用下將電子從醌池轉(zhuǎn)移至NAD+。隨后通過強(qiáng)化丁二醇脫氫酶表達(dá)，并敲除氫化酶基因hyaB、hydA，使代謝流向2，3-丁二醇的合成途徑，并且產(chǎn)量最終達(dá)到0.06 mmol/L［圖8（d）］。這種能量轉(zhuǎn)換技術(shù)在不添加電子介體的情況下為化學(xué)合成提供了足夠的還原當(dāng)量，進(jìn)一步增加了實(shí)際生產(chǎn)中的可行性。上述結(jié)果表明，通過合成生物學(xué)策略，將外電極作為電子源驅(qū)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)部異源還原反應(yīng)，使得電能以有機(jī)物的形式儲(chǔ)存于細(xì)胞中，為未來微生物電合成技術(shù)走向現(xiàn)實(shí)應(yīng)用奠定重要基礎(chǔ)。

圖8 噬電細(xì)胞電子攝取和轉(zhuǎn)化Fig.8 Inward electron transfer pathway construction in electrotrophs

3.2 工程噬電細(xì)胞代謝路徑電合成化學(xué)品和生物燃料

噬電細(xì)胞作為核心催化劑的微生物電合成系統(tǒng)，提供了一種在生物電化學(xué)體系中由C1化合物以電力驅(qū)動(dòng)合成有機(jī)化合物的技術(shù)。微生物電合成系統(tǒng)作為催化平臺(tái)，為CO2等一碳底物的增值提供還原動(dòng)力，以催化產(chǎn)生醇、酸等高附加值化學(xué)品。為進(jìn)一步推動(dòng)CO2固定和轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)雙碳減排、構(gòu)建清潔低碳能源體系的目標(biāo)，近年來研究人員通過構(gòu)建異源代謝合成路徑、強(qiáng)化胞內(nèi)還原力轉(zhuǎn)化、提高電子噬取效率等策略系統(tǒng)性提高CO2固定化效率，以及微生物電合成高值化學(xué)品（高級(jí)醇、萜類化合物、番茄紅素等）的能力。例如，為了將太陽能轉(zhuǎn)化的電能更好地儲(chǔ)存，Li等［73］通過將外源電能與生物CO2固定和燃料生產(chǎn)結(jié)合，在Ralstonia eutrophaH16中引入異丁醇合成路徑中關(guān)鍵基因（alsS、ilvC、ilvD、kivd、yqhD），并敲除支路聚羥基丁酸酯合成基因簇（phaCAB），通過同時(shí)驅(qū)動(dòng)電催化甲酸鹽的生產(chǎn)耦合甲酸鹽代謝轉(zhuǎn)化為高級(jí)醇路徑，使代謝流向異丁醇和3-甲基-1-丁醇合成路徑［圖9（a）］。最終工程化的R.eutrophaH16能夠以電能和CO2作為唯一能源和碳源，產(chǎn)生超過140 mg/L的生物燃料，開啟了將CO2電力驅(qū)動(dòng)生物轉(zhuǎn)化為各種化學(xué)品的可能性。同樣，為了將太陽能驅(qū)動(dòng)水分解產(chǎn)生的H2和O2轉(zhuǎn)化為生物燃料，Torella等［151］開發(fā)了一款可擴(kuò)展的集成生物電化學(xué)系統(tǒng)，將R.eutropha維持在高電位培養(yǎng)，以促進(jìn)細(xì)胞生長且不產(chǎn)生ROS毒性。隨后通過敲除基因phaC、phaB，以破壞聚3-羥基丁酸酯合成，并強(qiáng)化異丙醇合成路徑基因phaA（酮硫解酶）、ctf（乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶）、adc（乙酰乙酸脫羧酶）、adh（乙醇脫氫酶）表達(dá)，使代謝流向R.eutropha的異丙醇合成路徑［圖9（b）］，其異丙醇的最大生物電化學(xué)效率達(dá)3.9%，產(chǎn)量達(dá)到216 mg/L。此外，為了提高生物燃料生產(chǎn)的能量轉(zhuǎn)換效率，研究人員開發(fā)了人工光合系統(tǒng)，利用光生電子為胞內(nèi)代謝反應(yīng)提供還原力驅(qū)動(dòng)。例如，正丁醇因其具有較高的能量、較低的揮發(fā)性和親水性被認(rèn)為是一種優(yōu)質(zhì)的生物燃料。Bai等［156］將正丁醇生物合成途徑（phaABJ、ter、adhE2）引入到光合自養(yǎng)生物沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustrisTIE-1），通過代謝工程和新型混合生物電化學(xué)平臺(tái)結(jié)合，分別在野生菌TIE-1、敲除固氮途徑、乙酰輔酶A的菌株中實(shí)現(xiàn)了正丁醇生產(chǎn)，表明R.palustris可以使用不同的碳源（有機(jī)酸、CO2）、電子源［H2、Fe(Ⅱ)、電極］和氮源（NH+4、N2）來生產(chǎn)正丁醇。其中缺乏固氮途徑的突變體丁醇產(chǎn)量最高達(dá)到0.91 mg/L，其電能轉(zhuǎn)換效率達(dá)到131.13%。

圖9 微生物電合成化學(xué)品和生物燃料Fig.9 Microbial electrosynthesis of chemicals and biofuels

除了催化生產(chǎn)生物燃料外，利用微生物電合成技術(shù)催化高附加值化學(xué)品合成也成為近年來的研究熱點(diǎn)。以工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域的重要萜類化合物——α-葎草烯為例，為了提高α-葎草烯在微生物電合成中的生產(chǎn)效率。研究人員首先在R.eutropha異源構(gòu)建甲羥戊酸途徑，同時(shí)強(qiáng)化法尼基焦磷酸合酶（ERG20），IPP異構(gòu)酶（fni）和α-葎草烯合酶（ZSSI）表達(dá)，使工程菌在自養(yǎng)條件下，最大α-葎草烯合成量達(dá)到6.3 mg/L。隨后，研究人員［153］進(jìn)一步確定了工程菌株在電自養(yǎng)條件下α-葎草烯的生產(chǎn)效率，通過接入外源電極促進(jìn)水分解產(chǎn)生H2，為細(xì)胞提供還原力，同時(shí)向系統(tǒng)內(nèi)通入CO2以供給細(xì)胞碳源，最終電自養(yǎng)條件下工程菌R.eutropha可生產(chǎn)10.8 mg/L的α-葎草烯，較自養(yǎng)條件提高近2倍。另一方面，為了減少溫室氣體排放，提高CO2捕獲效率以促進(jìn)微生物電合成高值化學(xué)品的生產(chǎn)。Chen等［152］構(gòu) 建 了 甲 酸 脫 氫 酶（formate dehydrogenase，F(xiàn)DH）輔助的MES系統(tǒng)，F(xiàn)DH在陰極室催化CO2還原為甲酸，而甲酸鹽可作為電子載體將來自陰極的電子傳遞至R.eutropha。為了提高該過程CO2轉(zhuǎn)化效率，添加電子傳遞載體中性紅（neutral red，NR）以促進(jìn)FDH的輔助因子NADH的細(xì)胞外再生，并負(fù)責(zé)將電子從陰極間接傳遞至R.eutropha，強(qiáng)化細(xì)胞內(nèi)還原力的水平，進(jìn)一步提升微生物電合成的效率。同時(shí)，Calvin-Benson-Bassham（CBB）循環(huán)作為R.eutropha主要固碳途徑，其1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）在該過程中起到關(guān)鍵作用。為此，研究人員通過異源表達(dá)來自S.elongatusPCC7942的關(guān)鍵酶Rubisco，從而強(qiáng)化R.eutrophaCBB循環(huán)固定CO2的能力［圖9（c）］。最終通過該酶輔助電合成系統(tǒng)，使得聚3-羥基丁酸酯（poly-3-hydroxybutyrate，PHB）的產(chǎn)量達(dá)到485 mg/L。此外，Zhang等［155］將微生物電合成引入真核生物釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），以解決因還原力NAD(P)H供應(yīng)不足而限制類固醇羥基化過程。細(xì)胞色素P450單加氧酶是催化該過程的關(guān)鍵酶，而細(xì)胞內(nèi)還原當(dāng)量NAD(P)H供應(yīng)不足通常被認(rèn)為是影響該酶催化的關(guān)鍵因素。為此，研究人員通過構(gòu)建P450生物電催化系統(tǒng)，添加電子傳遞載體NR以促進(jìn)電極向S.cerevisiae供給電子，提高胞內(nèi)再生還原當(dāng)量并調(diào)控羥基化過程，同時(shí)過表達(dá)氧化甾醇7α-羥化酶，使脫氫表雄酮（DHEA）能夠羥基化為7α-OHDHEA，基于此生物電催化系統(tǒng)使得最終7α-OHDHEA的產(chǎn)率提高到288.6 mg/L，較原系統(tǒng)提高2.4倍，法拉第效率顯著提高至57.9%。為了拓寬微生物電合成的多樣化高值化學(xué)品，Wu等［154］在R.eutropha中建立了番茄紅素從頭合成路徑，異源表達(dá)了來自Erwinia herbicola的生物合成途徑CrtEBI2，通過與無機(jī)催化水電解相結(jié)合，使工程菌株能夠利用H2作為還原力，CO2作為唯一碳源生產(chǎn)番茄紅素［圖9（d）］。由于產(chǎn)生的番茄紅素可顯著降低活性氧對(duì)細(xì)胞的損傷作用，進(jìn)一步提高了微生物和無機(jī)催化間的生物相容性。最終，利用該系統(tǒng)能夠從燃煤電廠的實(shí)際廢氣中生產(chǎn)出1.73 mg/L的番茄紅素，該方法為將工業(yè)廢氣中的CO2高效轉(zhuǎn)化為高值化學(xué)品建立了一條可持續(xù)的路線。上述研究表明，使用基因工程策略來調(diào)整電活性微生物的細(xì)胞內(nèi)代謝途徑，結(jié)合微生物電合成系統(tǒng)平臺(tái)，可成為未來提供可持續(xù)能源、生物燃料以及高附加值化學(xué)品的強(qiáng)大技術(shù)。

4 電能細(xì)胞的應(yīng)用展望

近年來，能源短缺和環(huán)境生態(tài)問題成為全球面臨的挑戰(zhàn)，在此背景下，電能細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的微生物電化學(xué)系統(tǒng)在新能源開發(fā)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、有機(jī)催化、生物醫(yī)療等多方面展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。隨著研究人員對(duì)電能細(xì)胞的生理代謝過程、電子傳遞機(jī)制的深入探索，未來其能量轉(zhuǎn)化效率有望實(shí)現(xiàn)跨數(shù)量級(jí)突破，這將進(jìn)一步加快以電能細(xì)胞為核心微生物電化學(xué)系統(tǒng)在生物制造和生物催化領(lǐng)域的進(jìn)展，為可持續(xù)性生產(chǎn)綠色能源提供新思路。

合成生物學(xué)是生物學(xué)、化學(xué)和工程學(xué)的匯聚型新興學(xué)科，它將生物學(xué)的研究性質(zhì)與工程設(shè)計(jì)原則相結(jié)合，在指導(dǎo)微生物細(xì)胞改造上表現(xiàn)出多種顯著的技術(shù)優(yōu)勢(shì)性和便捷性。電能細(xì)胞獨(dú)特的電子傳遞能力對(duì)眾多領(lǐng)域都有顯著的促進(jìn)作用，雖然以電能細(xì)胞為催化劑的生物電催化系統(tǒng)已經(jīng)取得了顯著成果，但仍然面臨著巨大挑戰(zhàn)，如界面電子傳輸能力有限、生物催化系統(tǒng)穩(wěn)定性差、化學(xué)品合成速率低等。因此，通過融合合成生物學(xué)方法、化學(xué)方法、材料工程、計(jì)算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科來解決上述問題似乎更有前景。目前，由于缺乏基因編輯工具和工程化策略，針對(duì)電能細(xì)胞的機(jī)制解析和工程改造仍有局限。未來的研究方向可以從以下幾個(gè)方面作進(jìn)一步思考：

（1）開發(fā)新型調(diào)控元件針對(duì)電能細(xì)胞的代謝調(diào)控的未來發(fā)展，挖掘和發(fā)現(xiàn)更多的細(xì)胞調(diào)控元件應(yīng)該是未來研究的重點(diǎn)方向，細(xì)菌群落內(nèi)代謝功能的變化在很大程度上取決于組成細(xì)胞中調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)和生化網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性以及由此產(chǎn)生的合作行為。此外，由于基因表達(dá)激活不可避免的時(shí)間延遲，以及化學(xué)信號(hào)分子在溶液中有限的擴(kuò)散速率。相比之下，利用光遺傳學(xué)方法，開發(fā)新型調(diào)控元件，是快速、無創(chuàng)和可靶向操作細(xì)胞的有效工具，將合成生物學(xué)啟發(fā)的工程方法與新工具的開發(fā)相結(jié)合，進(jìn)一步拓展電能細(xì)胞在微生物燃料電池、生物修復(fù)、生物電合成、納米材料生產(chǎn)等方面的應(yīng)用。

（2）開展多學(xué)科交叉策略隨著科技的革新，合成生物學(xué)研究不再是傳統(tǒng)簡單的基因工程操作技術(shù)，更多是與化學(xué)方法，材料工程相結(jié)合形成的跨學(xué)科交叉整合。特別是在電能細(xì)胞的設(shè)計(jì)與構(gòu)建中，傳統(tǒng)的設(shè)計(jì)往往是通過強(qiáng)化氧化還原輔因子以減少電荷遷移距離或強(qiáng)化電子傳遞載體合成以促進(jìn)電子傳遞，然而這些方法普遍存在影響胞內(nèi)代謝，阻礙細(xì)胞生長以及界面電子轉(zhuǎn)移效率低等問題?；诓牧瞎こ涕_發(fā)的多種導(dǎo)電材料（例如石墨烯、聚吡咯、金屬納米顆粒等），能夠輔助產(chǎn)電細(xì)胞有效降低界面電阻，減少能量損耗，引導(dǎo)微生物進(jìn)化，構(gòu)建人工雜合電活性生物膜優(yōu)勢(shì)群體，使得細(xì)胞能量轉(zhuǎn)化效率大幅度提升。同樣針對(duì)于噬電細(xì)胞的電子攝取能力弱、還原力供給不足等問題，許多光捕獲材料（例如CdS、InP、PFP、PDI等）顯示出明顯優(yōu)勢(shì)，因其具有可調(diào)節(jié)的光帶隙、良好的生物相容性、高效的電子轉(zhuǎn)運(yùn)能力，是構(gòu)建半導(dǎo)體-微生物雜合體以驅(qū)動(dòng)微生物電合成實(shí)現(xiàn)光電子到化學(xué)能高效轉(zhuǎn)換的絕佳工具，在CO2固定、高值化學(xué)品合成中顯示出巨大的潛力。

（3）推動(dòng)多元化實(shí)際應(yīng)用現(xiàn)階段微生物電化學(xué)系統(tǒng)仍處于實(shí)驗(yàn)室發(fā)展階段，面對(duì)實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)的高電能供給仍有較大的差距。然而，單純擴(kuò)大微生物電化學(xué)系統(tǒng)體積、增大電極面積，反而會(huì)使系統(tǒng)內(nèi)阻急劇上升，增加內(nèi)部損耗，從而限制其電化學(xué)性能。以微生物燃料電池為例，相比于單體電池結(jié)構(gòu)利用微生物燃料電池堆棧技術(shù)，通過串并聯(lián)連接多個(gè)單體電池組成微生物燃料電池堆，則表現(xiàn)出更高的輸出電流和較低的能耗損失。因此，通過對(duì)微生物電化學(xué)反應(yīng)過程中的熱力學(xué)、動(dòng)力學(xué)計(jì)算，縮減反應(yīng)過程中的能量損耗，設(shè)計(jì)優(yōu)化反應(yīng)器結(jié)構(gòu)，有望實(shí)現(xiàn)驅(qū)動(dòng)多設(shè)備運(yùn)行。同時(shí)，隨著合成生物學(xué)技術(shù)的開發(fā)，可進(jìn)一步推動(dòng)電能細(xì)胞在供電、傳感、合成等實(shí)際應(yīng)用。特別是在最新的碳達(dá)峰、碳中和的需求背景下，微生物電化學(xué)系統(tǒng)有望利用合成生物學(xué)技術(shù)，強(qiáng)化電能細(xì)胞CO2捕獲能力，高效催化高附加值化學(xué)品生產(chǎn)，最大限度地減少人類社會(huì)生產(chǎn)活動(dòng)的CO2排放量，為低碳循環(huán)經(jīng)濟(jì)提供新的可能性。