莊小禹，邊新宇，劉 舒，劉志強(qiáng)，宋鳳瑞

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心，上海 201303；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，長(zhǎng)春質(zhì)譜中心&吉林省中藥化學(xué)與質(zhì)譜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130022)

蛋白質(zhì)為動(dòng)態(tài)實(shí)體，要全面了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，以及蛋白質(zhì)與配體相互作用對(duì)其空間構(gòu)象的影響，需要能夠及時(shí)捕捉其構(gòu)象轉(zhuǎn)變，這對(duì)許多“經(jīng)典”的高分辨結(jié)構(gòu)生物學(xué)工具(如X射線晶體學(xué)、核磁共振和電子顯微鏡等)提出挑戰(zhàn)。這些方法雖然各具優(yōu)點(diǎn)，但通常只能提供樣品的總體信息，難以對(duì)復(fù)雜體系中各類蛋白質(zhì)構(gòu)象或蛋白質(zhì)聚集前體進(jìn)行研究，且無(wú)法直接獲取關(guān)于蛋白質(zhì)及其復(fù)合物相對(duì)分子質(zhì)量及蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合計(jì)量比方面的信息。離子淌度譜(ion mobility spectrometry, IMS)[1]可以分離質(zhì)量相同而形狀不同的離子，與準(zhǔn)生理?xiàng)l件下分析和研究生物大分子高級(jí)結(jié)構(gòu)、相互作用和動(dòng)力學(xué)的非變性質(zhì)譜(native mass spectrometry, native MS)聯(lián)用，不僅可以表征單體蛋白的動(dòng)態(tài)構(gòu)象，還能夠?qū)Φ鞍讖?fù)合體功能、結(jié)構(gòu)和組裝形式，以及蛋白-配體相互作用進(jìn)行研究。近年來(lái)，由于非變性離子淌度質(zhì)譜(native ion mobility-mass spectrometry, native IM-MS)可以高靈敏、快速地分析蛋白質(zhì)混合物中的構(gòu)象變化，已逐漸成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的有力工具，并被應(yīng)用于蛋白質(zhì)構(gòu)象、蛋白質(zhì)-配體相互作用、蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、聚集的動(dòng)力學(xué)研究等領(lǐng)域[2-6]，為傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究提供了豐富的互補(bǔ)信息。

1 離子淌度質(zhì)譜的基本原理及特點(diǎn)

離子淌度譜(IMS)又稱離子遷移譜，是根據(jù)氣相離子在電場(chǎng)和氣流形成的漂移區(qū)內(nèi)遷移率不同而分離離子的方法。傳統(tǒng)IMS測(cè)定的是離子在漂移管中的漂移時(shí)間(drift time,tD)，不僅取決于離子的質(zhì)量、帶電荷數(shù)，還與其大小和形狀相關(guān)。氣相離子進(jìn)入漂移管后，在電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)過(guò)程中與惰性漂移氣體(通常為氦氣、氬氣或氮?dú)?不斷發(fā)生碰撞。通常體積較大的離子比體積較小的離子與漂移管中氣體發(fā)生碰撞的機(jī)會(huì)更多，因此遷移得更慢。由于碰撞次數(shù)與離子的表面積成正比，IMS測(cè)定的漂移時(shí)間可用于確定離子旋轉(zhuǎn)時(shí)的平均碰撞截面積(collision cross section, CCS)，其反映了離子的形狀和大小。在蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)研究中，離子的碰撞截面積可以直接反映蛋白質(zhì)的三維形狀和復(fù)合物堆疊方式。

目前，已有多種離子淌度技術(shù)被開發(fā)并應(yīng)用[7-9]，較為常見的有漂移時(shí)間離子淌度譜(drift-time ion mobility spectrometry, DTIMS)、行波離子淌度譜(travelling-wave ion mobility spectrometry, TWIMS)、捕集離子淌度譜(trapped ion mobility spectrometry, TIMS)、高場(chǎng)非對(duì)稱離子淌度譜(field-asymmetric ion mobility spectrometry, FAIMS)，示于圖1。按照電場(chǎng)強(qiáng)度劃分，上述前3種可稱為低場(chǎng)離子淌度，最后一種為高場(chǎng)離子淌度。使用低場(chǎng)離子淌度的優(yōu)勢(shì)是可以確定離子遷移率與CCS之間的關(guān)系，因此可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的漂移時(shí)間推導(dǎo)離子的碰撞截面積，這對(duì)于研究未知結(jié)構(gòu)的蛋白單體和復(fù)合物尤為重要。

除上述幾種離子淌度技術(shù)，目前正在開發(fā)或已投入使用的還有回旋離子淌度、串聯(lián)離子淌度、超長(zhǎng)路徑-無(wú)損離子淌度。這些新技術(shù)都使離子淌度向著高分辨、高靈敏的方向發(fā)展。

2 離子淌度質(zhì)譜可獲取的數(shù)據(jù)及信息形式

2.1 漂移時(shí)間

離子的漂移時(shí)間是離子淌度譜直接獲取的數(shù)據(jù)形式，反映了離子的碰撞截面積大小?；陔x子的漂移時(shí)間分離離子，為傳統(tǒng)質(zhì)譜增加了一個(gè)分離維度，獲得包含離子質(zhì)荷比 (m/z)、離子豐度和漂移時(shí)間的三維信息譜圖。因此，IM-MS不僅可以提供結(jié)構(gòu)信息，還可通過(guò)將數(shù)據(jù)分布到第三維來(lái)分離重疊峰，從而分析組成高度相似的異質(zhì)或多分散復(fù)合物。

2.2 漂移時(shí)間分布

漂移時(shí)間分布(arrival time distribution, ATD)峰半高處的漂移時(shí)間寬度可以反映蛋白質(zhì)和復(fù)合物的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性，尖而窄的峰表示單一構(gòu)象，而較寬的峰則表明共存多種狀態(tài)的構(gòu)象，溶液中蛋白質(zhì)組裝體的構(gòu)象多樣性。因此，可以通過(guò)ATD確定蛋白質(zhì)相互作用和/或底物結(jié)合對(duì)所分析蛋白質(zhì)構(gòu)象分布的影響。

圖1 4種離子淌度技術(shù)的基本結(jié)構(gòu)與原理[7]Fig.1 Principle and structure of four main types of ion mobility instruments[7]

2.3 碰撞截面積

通過(guò)測(cè)定每個(gè)電荷狀態(tài)下的ATD，可以直接或間接計(jì)算CCS。CCS也被稱為旋轉(zhuǎn)平均碰撞截面積，代表離子與漂移氣體碰撞的有效截面積，類似于投影面積。CCS可用于反映離子的結(jié)構(gòu)特征。實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的CCS是分析離子構(gòu)型的重要評(píng)分指標(biāo)，可以與其他由已知或推測(cè)結(jié)構(gòu)計(jì)算的CCS進(jìn)行對(duì)比[10]。

2.4 碰撞誘導(dǎo)去折疊

通過(guò)對(duì)氣相離子的碰撞活化作用，可以豐富IM-MS實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)量。當(dāng)需要區(qū)分結(jié)構(gòu)上具有細(xì)微差異的蛋白質(zhì)，以及研究蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性時(shí)，可以通過(guò)碰撞誘導(dǎo)去折疊(CIU)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。在CIU實(shí)驗(yàn)中，逐步升高碰撞能量(collision energy, CE)使蛋白離子活化，并由于庫(kù)侖斥力的作用誘導(dǎo)蛋白構(gòu)型發(fā)生變化或部分展開，之后經(jīng)過(guò)淌度分離和質(zhì)譜檢測(cè)，能夠區(qū)分同一質(zhì)荷比下緊湊和伸展的蛋白構(gòu)象，使用CCS即可判別和量化構(gòu)象變化[11]。通過(guò)CIU指紋圖譜可以更清晰直觀地觀察蛋白活化時(shí)的構(gòu)象變化，不僅可以識(shí)別配體或蛋白伴侶鍵合對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響，還可以區(qū)分源于蛋白多樣性(如可變剪接、基因復(fù)制、翻譯后修飾)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體。

3 非變性離子淌度質(zhì)譜在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用

3.1 鑒定單體蛋白折疊結(jié)構(gòu)

蛋白表面的不穩(wěn)定修飾可以通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)控蛋白表面的化學(xué)微環(huán)境而影響蛋白的局域結(jié)構(gòu)，從而可能介導(dǎo)目標(biāo)蛋白的特定功能，但一直缺乏合適的結(jié)構(gòu)化學(xué)分析手段。Li等[12]利用非變性離子淌度方法，使用非靶向全離子去折疊(AIU)和碎裂(AIF)的方式，高通量無(wú)損操控蛋白的氣相結(jié)構(gòu)，快速有效剖析糖基化中唾液酸化修飾對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白化學(xué)、構(gòu)象、拓?fù)浞€(wěn)定性的影響。將開發(fā)的AIU技術(shù)用于對(duì)差異唾液酸化修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白進(jìn)行構(gòu)象穩(wěn)定性分析，雖然在所有的唾液酸化糖蛋白中都存在多次構(gòu)象轉(zhuǎn)變，但在相同的活化能范圍內(nèi)，這些轉(zhuǎn)鐵蛋白會(huì)經(jīng)歷不同的去折疊軌跡。因此，根據(jù)不同的3D展開軌跡圖可以很好地分辨3種轉(zhuǎn)鐵蛋白。

在生物制藥領(lǐng)域，離子淌度質(zhì)譜可在單克隆抗體(mAb)和抗體偶聯(lián)藥物(ADC)等藥用蛋白的生產(chǎn)過(guò)程中提供完整蛋白的修飾信息和其他特征[13]。如人免疫球蛋白G2(IgG2)具有多種二硫鍵差異導(dǎo)致的異構(gòu)體形式，這些異構(gòu)體具有不同的功能、活性。Bagal 等[14]利用離子淌度質(zhì)譜解析了這些異構(gòu)體，并通過(guò)分析去糖基化以及二硫鍵相關(guān)位點(diǎn)突變的各種變體，證實(shí)了二硫鍵是引起這些異構(gòu)體結(jié)構(gòu)差異的關(guān)鍵因素。ADC藥物通常存在因小分子藥物與抗體偶聯(lián)位置不同而產(chǎn)生的位置異構(gòu)體。變性實(shí)驗(yàn)條件會(huì)破壞ADC子域之間的非共價(jià)相互作用，因此半胱氨酰連接的ADC難以通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析抗體比率(DAR)值。Marcoux等[15]將非變性離子淌度譜結(jié)合高分辨質(zhì)譜應(yīng)用于ADC分析，并給出了指導(dǎo)性建議，包括從去糖基化ADC的非變性離子淌度譜獲得藥物的平均偶聯(lián)量和通過(guò)計(jì)算CCS得到的微小結(jié)構(gòu)變化來(lái)區(qū)分載藥量的差異。對(duì)于一些結(jié)構(gòu)差異太細(xì)微，不能通過(guò)直接比較碰撞截面積(或漂移時(shí)間)區(qū)分的蛋白質(zhì)，通過(guò)對(duì)氣相離子的碰撞活化作用，可以豐富離子淌度質(zhì)譜的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，示于圖2。Tian等[16]在對(duì)ADC的離子淌度譜分析中引入了CIU方法，成功區(qū)分了CCS十分相近的IgGk亞型1～4的mAb。

3.2 應(yīng)用于蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、聚集及與配體相互作用的研究

蛋白質(zhì)或多肽特定的空間構(gòu)象對(duì)于其發(fā)揮正常的生物功能至關(guān)重要，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的改變會(huì)引發(fā)蛋白質(zhì)或多肽的錯(cuò)誤折疊及聚集，形成淀粉樣原纖維，并最終導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生[17]，如肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)、阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)及朊蛋白病等神經(jīng)退行性疾病和糖尿病(DM)等，這些疾病又稱蛋白構(gòu)象病[18]。而銅鋅超氧化物歧化酶(SOD1)、β淀粉樣蛋白(Aβ)、突觸核蛋白、朊病毒蛋白、人胰淀素(hIAPP)的錯(cuò)誤折疊及聚集，分別與ALS、AD、PD、瘋牛病及糖尿病等疾病相關(guān)。但由于淀粉樣原纖維形成過(guò)程的中間體具有分散性、多態(tài)性和瞬時(shí)態(tài)的特性，分析和識(shí)別這些短暫存在的低聚態(tài)中間體一直是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。

蛋白質(zhì)通常在原纖維形成之前發(fā)生去折疊和錯(cuò)誤折疊，因此表征蛋白質(zhì)的構(gòu)象特點(diǎn)是研究淀粉樣纖維形成的關(guān)鍵問題[19]。IM-MS能夠?qū)⒛骋环N蛋白單體共存的多種構(gòu)型(質(zhì)荷比相同，物理尺寸或形狀略有差異)分離開。Zhuang等[20]利用IM-MS及其串聯(lián)質(zhì)譜的方法研究了不同溶液體系對(duì)SOD1構(gòu)象的影響，以及SOD1二聚體在氣相中的構(gòu)型變化和分解過(guò)程，發(fā)現(xiàn)在非變性離子淌度質(zhì)譜條件下，SOD1二聚體可以保持完整和緊湊構(gòu)型，在氣相中經(jīng)碰撞活化后構(gòu)型會(huì)逐漸由緊湊變得伸展，同時(shí)伴隨二聚體解離成單體。該實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)到3種構(gòu)型的二聚體(緊湊、部分伸展、伸展)及2種構(gòu)型的單體(緊湊和伸展)，根據(jù)CCS及離子淌度串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，確定了SOD1二聚體離子在氣相中的3種分解和去折疊途徑，示于圖3。

圖2 離子淌度質(zhì)譜法測(cè)定去糖基化曲妥珠單抗emtansine的藥物-抗體比[15]Fig.2 Determination of the drug-to-antibody ratio (DAR) of deglycosylated trastuzumab emtansined by IM-MS[15]

圖3 SOD1二聚體離子[Di]11+(m/z 2 858)的解離及去折疊途徑[20]Fig.3 Dissociation and unfolding pathways of SOD1 dimer ion [Di]11+ (m/z 2 858)[20]

此外，由于淀粉樣蛋白形成的早期階段具有高度異質(zhì)性，多種且快速相互轉(zhuǎn)化的物種共存于溶液中，除研究有聚集傾向的蛋白質(zhì)單體，識(shí)別和表征短暫存在的低聚態(tài)中間體是分析淀粉樣原纖維形成途徑時(shí)的難點(diǎn)。非變性離子淌度質(zhì)譜既可以保留非共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物，又可以高靈敏度監(jiān)測(cè)復(fù)雜混合樣品中低濃度的物種，分離不同的寡聚物而不影響整體平衡，并且能夠提供淀粉樣蛋白組裝方式的信息以及確認(rèn)有毒低聚體的種類[21]。Illes-Toth等[22]利用IM-MS發(fā)現(xiàn)了能夠誘導(dǎo)體內(nèi)聚集的α-突觸核蛋白寡聚體的不同構(gòu)象，雖然低階低聚物相對(duì)非結(jié)構(gòu)化，且主要以線性排列方式結(jié)合，但高階低聚物(如五聚體和六聚體)會(huì)形成環(huán)狀組裝體。作者推測(cè)這種緊湊的寡聚體可能會(huì)促進(jìn)其他非結(jié)構(gòu)化蛋白質(zhì)的朊病毒樣細(xì)胞傳播。Leney等[23]比較了β-微球蛋白與它的1個(gè)D鏈單點(diǎn)突變體H51A在體外形成纖維過(guò)程的差異，發(fā)現(xiàn)H51A會(huì)更快地形成高聚體，然而二者所形成低聚體的CCS沒有明顯差異。近年來(lái)，Bowers課題組一直致力于利用離子淌度質(zhì)譜研究疾病相關(guān)的淀粉樣蛋白/多肽的聚集過(guò)程，如β淀粉樣蛋白(Aβ)、突觸核蛋白、朊病毒蛋白、人胰淀素樣多肽(hIAPP)[24-30]。他們利用IM-MS研究了tau蛋白的PHF核心結(jié)構(gòu)域，證明溶液條件決定了tau蛋白單體和寡聚體的蛋白內(nèi)和蛋白間相互作用，因此該結(jié)構(gòu)域在tau蛋白的聚集中起決定性作用。通過(guò)IM-MS表征tau蛋白的可溶性低聚物，在聚集過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了多達(dá)八聚體的可溶性低聚物，這些低聚物會(huì)逐漸向不溶性原纖維轉(zhuǎn)移。此外，他們探索了Aβ40和Aβ42的寡聚狀態(tài)和組裝動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)Aβ40主要形成單體和二聚體，同源四聚體豐度較低。因此，推測(cè)原纖維是由二聚體形成的四聚體產(chǎn)生的，而缺乏高階結(jié)構(gòu)限制了Aβ40原纖維的生長(zhǎng)。相反，Aβ42形成展開的四聚體，并進(jìn)一步結(jié)合二聚體形成六聚體，2個(gè)六聚體相互作用形成有毒的十二聚體[29]。雖然人胰淀素樣多肽(hIAPP)與鼠胰淀素樣多肽(rIAPP)只有6個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差異，但rIAPP卻不具有聚集傾向。通過(guò)離子淌度質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)，帶有相同電荷數(shù)的hIAPP單體具有緊實(shí)構(gòu)象(漂移時(shí)間較短)和伸展構(gòu)象(漂移時(shí)間較長(zhǎng))，比rIAPP單體多了1個(gè)更伸展的構(gòu)象[30]。分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示，hIAPP單體的伸展構(gòu)象由β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)組成，而rIAPP更緊湊的構(gòu)象為α-螺旋結(jié)構(gòu)，這與hIAPP纖維形成起始于β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)中間體的結(jié)論接近。

對(duì)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊疾病的治療策略研究是在明確蛋白錯(cuò)誤折疊、聚集機(jī)制的基礎(chǔ)之上，通過(guò)穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，減少、阻止其寡聚體的形成或促進(jìn)其纖維化，以形成毒性很小或無(wú)毒的無(wú)定形聚集體等方法來(lái)抑制或消除淀粉樣蛋白的細(xì)胞毒性。Nshanian等[31]利用IM-MS探索了一種鑷子分子CLR01抑制tau蛋白聚集的機(jī)制，研究顯示，tau蛋白與抑制劑結(jié)合的化學(xué)計(jì)量比為1∶1。在CLR01存在的情況下，tau蛋白明顯向緊湊構(gòu)象轉(zhuǎn)變，并且當(dāng)tau蛋白被磷酸化時(shí)效果更加突出，tau蛋白的這種結(jié)構(gòu)重塑抑制了具有聚集能的蛋白質(zhì)構(gòu)象異構(gòu)體的形成。

大量研究發(fā)現(xiàn)，各種天然產(chǎn)物可以對(duì)淀粉樣蛋白的聚集產(chǎn)生顯著影響，從而降低聚集誘導(dǎo)的毒性。Zhao等[32]基于離子淌度質(zhì)譜的碰撞誘導(dǎo)去折疊指紋圖譜，證明表沒食子IU茶素沒食子酸酯(EGCG)能夠穩(wěn)定SOD1二聚體的結(jié)構(gòu)，減緩其去折疊；結(jié)合光譜及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證明EGCG能夠抑制脫金屬輔基SOD1(apo-SOD1)的體外聚集，減少聚集過(guò)程中疏水區(qū)暴露及β層含量的增加，并減少細(xì)胞損傷。離子淌度質(zhì)譜也被用于區(qū)分天然小分子配體異構(gòu)體，以及SOD1與黃酮異構(gòu)體相互作用的研究[33-34]。Zhuang等[33]利用電噴霧-離子淌度質(zhì)譜結(jié)合光譜方法研究SOD1與黃酮化合物及其異構(gòu)體之間的非共價(jià)相互作用，發(fā)現(xiàn)SOD1與黃酮配體結(jié)合后其二聚體構(gòu)型的穩(wěn)定性得以提升，并根據(jù)分子對(duì)接方法推測(cè)二聚體界面處是黃酮配體主要的結(jié)合位點(diǎn)，證實(shí)橙皮苷、柚皮苷等黃酮苷類成分具有較好的抑制apo-SOD1體外聚集的能力。此外，該課題組[34]還利用離子淌度質(zhì)譜研究了白藜蘆醇及其衍生物提升SOD1二聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用，示于圖4。

SOD1的錯(cuò)誤折疊和神經(jīng)毒性聚集可由突變、金屬缺陷和翻譯后修飾引起[35]。Bian等[36]

圖4 利用native IM-MS研究虎杖苷與SOD1的相互作用[34]Fig.4 Research of interactions between SOD1 and polydatin by native IM-MS[34]

利用非變性離子淌度質(zhì)譜揭示了鋅缺乏SOD1的氧化損傷風(fēng)險(xiǎn)。銅離子在氧化前期被釋放，這可能是其結(jié)合位點(diǎn)被氧化的結(jié)果。另一方面，缺鋅SOD1比脫輔基SOD1具有更快的解離傾向。碰撞誘導(dǎo)去折疊表明，缺鋅SOD1氧化后更易轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆煺箻?gòu)象。黃豆黃苷能抑制鋅缺乏SOD1的氧化，并抑制氧化鋅缺乏SOD1構(gòu)象的轉(zhuǎn)變及聚集，示于圖5。

體外研究表明[37-39]，EGCG可以改變多種淀粉樣蛋白的聚集途徑，并將已形成的聚集體解聚，形成無(wú)毒性的無(wú)定形聚集體。Bleiholder等[39]基于IM-MS方法研究了Aβ淀粉樣纖維的形成及其與抑制劑EGCG的相互作用，發(fā)現(xiàn)EGCG可有效抑制β構(gòu)象的寡聚體形成，并將淀粉樣纖維轉(zhuǎn)變?yōu)榫o湊的顆粒狀沉淀。Young等[40]證明了IM-MS在篩選和表征Aβ抑制劑方面的能力，確定了小分子與淀粉樣蛋白前體(hIAPP)和Aβ-40結(jié)合的抑制劑，表征了相互作用的蛋白質(zhì)種類(單體或寡聚體)并闡明聚集抑制機(jī)制，包括抑制劑結(jié)合的性質(zhì)(特異性、非特異性或膠體)、抑制模式-單體結(jié)合、單體構(gòu)象平衡的轉(zhuǎn)變、低聚物的分解等。作者提出IM-MS是一種有前途的高通量篩選工具，并通過(guò)IM-MS發(fā)現(xiàn)了一種新的hIAPP自組裝抑制劑。Pang等[41]利用電噴霧離子淌度質(zhì)譜結(jié)合多種分析方法，分別從hIAPP的構(gòu)象變化、聚集動(dòng)力學(xué)的影響、聚集中疏水區(qū)域的暴露等多方面考察了紫草酸對(duì)hIAPP聚集的抑制作用。發(fā)現(xiàn)紫草酸與hIAPP結(jié)合形成的復(fù)合物可以改變hIAPP單體緊實(shí)構(gòu)象和伸展構(gòu)象的相對(duì)豐度，從而維持hIAPP構(gòu)象的穩(wěn)定性，并證明紫草酸能夠有效抑制hIAPP聚集，減少纖維生成。

圖5 利用DTT/H2O2氧化(a,b)和還原(c,d)ApoSOD1(P1)和ApoSOD1(P1)的IM熱圖，以及P1(e)、P2(f)單體的離子淌度譜圖[36]Fig.5 IM heat maps of oxidized (a, b) and reducted (c, d) ApoSOD1 (P1) and ApoSOD1 (P1),IM spectra of +8 charged P1(e) and P2(f) monomer induced by DTT or H2O2[36]

越來(lái)越多的研究表明[42-45]，某些疾病相關(guān)蛋白質(zhì)聚集過(guò)程中形成的可溶性寡聚體具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，可能是致病的重要原因，而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的降低與寡聚體的形成密切相關(guān)。因此，針對(duì)疾病相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、錯(cuò)誤折疊及寡聚體形成與干預(yù)措施進(jìn)行深入研究顯得尤為重要。利用靈敏、快捷、特異性強(qiáng)的非變性離子淌度質(zhì)譜方法，結(jié)合多重串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(如碰撞誘導(dǎo)解離(CID)以及電子轉(zhuǎn)移解離(ETD))，以及光譜、計(jì)算機(jī)模擬及細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等技術(shù)，針對(duì)上述疾病相關(guān)蛋白及多肽的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、錯(cuò)誤折疊及聚集抑制劑的篩選進(jìn)行深入研究，既有助于闡明蛋白構(gòu)象病的發(fā)病機(jī)制，也有利于臨床的靶向治療及相關(guān)創(chuàng)新藥物的研發(fā)。雖然篩選得到的具有穩(wěn)定蛋白構(gòu)象、抑制蛋白聚集的天然小分子配體最終應(yīng)用于臨床有待考察，但仍為尋找治療蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊疾病的臨床藥物提供了新途徑[46]。

4 結(jié)語(yǔ)

非變性離子淌度質(zhì)譜已逐漸成為一種為傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)提供互補(bǔ)信息的重要研究手段。雖然非變性離子淌度質(zhì)譜缺少揭示原子水平的分辨率，但分析蛋白質(zhì)異質(zhì)復(fù)合物及蛋白質(zhì)-配體相互作用的能力比其他方法更具獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。此外，使用離子淌度質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)檢測(cè)具有快速、靈敏的特點(diǎn)，尤其是近年來(lái)將其與native top-down方法進(jìn)行整合，以及與多種解離方式結(jié)合，使非變性離子淌度質(zhì)譜可以提供更豐富的結(jié)構(gòu)信息。隨著高分辨、靈敏便捷的新一代離子淌度質(zhì)譜技術(shù)的不斷開發(fā)和完善，以及與多樣化質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)一步整合，非變性離子淌度質(zhì)譜技術(shù)在疾病相關(guān)的生物大分子結(jié)構(gòu)及相互作用分析方面將擁有更加廣闊的應(yīng)用前景。