胡 軍，陳 蕓，陳洪淵，徐靜娟

(1.南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，生命分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2.南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211166)

以蛋白質(zhì)為代表的生物大分子是生命體內(nèi)各種生理功能的主要執(zhí)行者，其功能的實(shí)現(xiàn)和動(dòng)態(tài)調(diào)控通常取決于其三維結(jié)構(gòu)及與多種分子間的弱相互作用過程[1]。因此，對蛋白質(zhì)及其復(fù)合物結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)解析和復(fù)雜作用網(wǎng)絡(luò)的揭示，既是理解構(gòu)效關(guān)系的基礎(chǔ)，也是認(rèn)知各種生命活動(dòng)過程，乃至是攻克一系列重大疾病的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究通常利用X射線晶體學(xué)(X-raycrystallography)、核磁共振(NMR)和冷凍電鏡(cryo-EM)技術(shù)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)等生物大分子的三維結(jié)構(gòu)測定[2]。與之相比，質(zhì)譜(MS)雖不能提供原子級分辨的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)，但能方便、快捷地解析復(fù)雜基質(zhì)條件下蛋白質(zhì)與其他分子(如代謝物、脂質(zhì)、輔因子、藥物分子等)間的弱相互作用，是上述幾種表征方法的極佳互補(bǔ)，已成為當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究不可或缺的重要技術(shù)手段[3]。近年來，該領(lǐng)域的迅速發(fā)展也催生出一門新興學(xué)科—?dú)庀嘟Y(jié)構(gòu)生物學(xué)(gas-phase structural biology)[4]。

電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)是氣相結(jié)構(gòu)生物學(xué)的技術(shù)基礎(chǔ)，其應(yīng)用于蛋白復(fù)合物的研究始于20世紀(jì)90年代。作為一種軟電離方式，電噴霧電離(ESI)能將蛋白質(zhì)等生物大分子從溶液中完整地轉(zhuǎn)移至氣相環(huán)境，但經(jīng)由非共價(jià)弱相互作用結(jié)合在一起的蛋白復(fù)合物在離子化過程中能否維持結(jié)構(gòu)不變在當(dāng)時(shí)仍頗有爭議[5]。Chait等[6]最早展示了完整血紅蛋白(hemoglobin)的ESI-MS分析結(jié)果，表明血紅素(heme)和珠蛋白(globin)之間的非共價(jià)弱相互作用確實(shí)能在ESI過程中得以保持。之后，研究人員對ESI技術(shù)和質(zhì)譜儀硬件進(jìn)行了持續(xù)的優(yōu)化和改進(jìn)，研發(fā)出多種既能與質(zhì)譜兼容，又能在離子化過程中較好地維持蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的立體結(jié)構(gòu)和相互作用信息的溶液體系，并逐漸形成了非變性質(zhì)譜(native MS)的概念[7]。Native MS一詞最早于2004年見諸文獻(xiàn)[8]報(bào)道，其中native的內(nèi)涵可以從與非變性凝膠電泳(native PAGE)的類比中得到部分闡釋。簡而言之，native MS致力于使用ESI-MS技術(shù)解析非變性緩沖溶液中非共價(jià)復(fù)合物(如大型蛋白質(zhì)組裝體、蛋白質(zhì)-藥物復(fù)合物、核酸-配體復(fù)合物等)的組成、結(jié)構(gòu)、結(jié)合計(jì)量比、結(jié)合常數(shù)及動(dòng)力學(xué)等信息[7-9]。經(jīng)過20余年的發(fā)展，基于native MS的結(jié)構(gòu)生物學(xué)已被學(xué)界廣為接受，并成為2015年美國質(zhì)譜年會(huì)的主題[10]。之后，國內(nèi)逐漸開始將native MS正式譯為“非變性質(zhì)譜”。

長期以來，基于微米毛細(xì)管的納噴霧電離(nano-ESI)一直是native MS的核心。2013年，Baker等[11]首次將開口直徑<100 nm的納米毛細(xì)管引入ESI-MS。雖然在ESI-MS中的應(yīng)用不足10年，但得益于納米毛細(xì)管極高的離子化效率、抗基質(zhì)干擾能力以及對非特異性加合物形成的抑制等諸多特性，使其在native MS領(lǐng)域獲得了廣泛關(guān)注。本文重點(diǎn)介紹納米毛細(xì)管的制備與表征技術(shù)、電離行為特性及其機(jī)理，并回顧近10年來納米毛細(xì)管電噴霧電離在蛋白質(zhì)、核酸及其非共價(jià)復(fù)合物的非變性質(zhì)譜分析中的應(yīng)用。

1 納米毛細(xì)管的制備與表征

1.1 納米毛細(xì)管制備

通常使用微電極拉制儀對納米毛細(xì)管進(jìn)行次序加熱和拉制，基本原理示于圖1。以Sutter Instrument公司的Model P-2000激光拉制儀為例，其包含HEAT、FILAMENT、VELOCITY、DELAY和PULL等5項(xiàng)參數(shù)，分別對CO2激光加熱功率、加熱寬度、預(yù)拉制速度、硬拉延遲時(shí)間以及拉力大小進(jìn)行程序控制，且可使用多項(xiàng)參數(shù)實(shí)現(xiàn)對毛細(xì)管錐度、孔徑的精細(xì)調(diào)控。各項(xiàng)拉制參數(shù)對毛細(xì)管最終的錐度、孔徑等具體影響可參閱該公司的用戶手冊[12]。通常，在儀器狀態(tài)良好，且保持環(huán)境溫度、濕度恒定以及毛細(xì)管潔凈的情況下，毛細(xì)管孔徑的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)可控制在5%以內(nèi)。常見的玻璃毛坯管材質(zhì)有硼硅酸鹽玻璃和石英玻璃2種，前者易于熔化加工、價(jià)格低廉，使用廣泛；后者質(zhì)地堅(jiān)硬、性質(zhì)穩(wěn)定，更易于制備尺寸極小的針尖，如孔徑小于20 nm的毛細(xì)管。

圖1 錐形納米毛細(xì)管的拉制示意圖[13]Fig.1 Fabrication of nanopipettes[13]

典型的納米毛細(xì)管結(jié)構(gòu)示于圖2，包含源自玻璃毛坯管的主干(stem)和逐漸縮小的肩部(shoulder)和脛部(shank)，以及微納尺度的針尖(tip)部分[14]。其中，主干部分的長度通常在數(shù)厘米范圍，使這類微納毛細(xì)管的操縱和使用十分便捷；而錐形部分的尺寸則涵蓋了從毫米到微米、納米尺度的演變；除了改變拉制參數(shù)[12]，毛細(xì)管針尖的孔徑還可利用后期修飾或刻蝕進(jìn)行精細(xì)調(diào)控[15-16]。如Jin等[15]利用硅酸鈉水解法在針尖內(nèi)壁生長SiO2(與石英玻璃同質(zhì))以進(jìn)一步減小其內(nèi)直徑，得到了開口直徑僅為6.4 nm的納米毛細(xì)管。

1.2 納米毛細(xì)管表征

納米毛細(xì)管尖端的尺寸極小，已超出光學(xué)顯微表征的分辨極限，目前常用的表征方法主要包括掃描電子顯微鏡(SEM)、透射電子顯微鏡(TEM)和電化學(xué)。其中，SEM表征最常用，能直接獲得針尖的錐度、孔徑等形貌信息，但對樣品導(dǎo)電性有一定要求。常見的做法是在針尖濺射一層僅數(shù)納米厚度的金屬層(常用鉑、金等)以增強(qiáng)導(dǎo)電性。而TEM的空間分辨率更高，透射式的觀測模式甚至能獲得針尖內(nèi)壁鍍層的組成與形貌信息[17-19]。雖然TEM不嚴(yán)格要求導(dǎo)電性，但在高能電子束的轟擊下，玻璃針尖會(huì)迅速解構(gòu)變形，示于圖3，從而無法準(zhǔn)確獲得其幾何形貌信息。Watanabe等[20]發(fā)現(xiàn)使用導(dǎo)電碳膜包覆的銅網(wǎng)進(jìn)行制樣，同時(shí)使用TEM的低電子劑量(minimum dose)模式，可以有效避免針尖解構(gòu)畸變，實(shí)現(xiàn)超小針尖(<10 nm)的形貌表征，示于圖3。

注：a.錐形尖端的微觀結(jié)構(gòu)示意圖；b.錐形尖端的光學(xué)顯微照片；c.SEM顯微照片圖2 納米毛細(xì)管的形貌示意圖及其表征[14]Fig.2 Micrographs of nanopipettes[14]

圖3 納米毛細(xì)管針尖的TEM表征[20]Fig.3 Characterization of a nanopipettes via transmission electron microscope (TEM)[20]

基于電化學(xué)的電阻或電導(dǎo)測量也常用于毛細(xì)管孔徑的間接測算，且通常與電鏡表征結(jié)果有較好的一致性。納米毛細(xì)管內(nèi)的溶液電阻(R)與溶液電阻率(ρ)、針尖孔徑(rt)等關(guān)系示于式(1)[21-22]：

(1)

其中，rs、rt、θ等定義示于圖2a，通過簡單的溶液電阻測量即可推算出針尖孔徑(rt)的大小。Moss等[23-24]的公式則更簡潔，電阻(R)與溶液導(dǎo)電率(κ)、針尖孔徑(rt)及半錐角(θ)等的關(guān)系示于式(2)：

(2)

Unwin等[25]后續(xù)研究表明，基于該方程的有限元模擬結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合度較好。因此，通過測量納米毛細(xì)管的電阻和錐角信息即可利用該方程推算出納米毛細(xì)管的孔徑。需要指出的是，上述2個(gè)方程在原理上無本質(zhì)區(qū)別，只是所選取的參數(shù)略有差異。

此外，針尖孔徑也可以根據(jù)液/液界面上的極限擴(kuò)散電流(id)進(jìn)行間接測算[26-27]，示于式(3)：

id=4f(θ)zFDCrt

(3)

其中，F(xiàn)、z、D、C分別是法拉第常數(shù)、發(fā)生界面轉(zhuǎn)移的離子電荷數(shù)、擴(kuò)散系數(shù)、濃度，f(θ)是半錐角θ的列表函數(shù)，具體可參考文獻(xiàn)[26-27]。與電鏡(SEM或TEM)表征相比，電化學(xué)表征無需復(fù)雜且耗時(shí)的制樣過程，且理論上對針尖孔徑大小沒有限制。例如，孔徑僅約1 nm的毛細(xì)管已遠(yuǎn)超電鏡方法的極限，只能通過電化學(xué)方法進(jìn)行間接測算[28]，但電化學(xué)方法使用的高濃度電解質(zhì)溶液難以完全清洗去除，通常表征后不再適合用于質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。所幸的是，經(jīng)1次拉制即可得到2根幾何尺寸幾乎完全相同的毛細(xì)管，因此可將其中的1根用于表征，另1根用于具體實(shí)驗(yàn)。

2 納米毛細(xì)管電噴霧電離的基本特性

與傳統(tǒng)的微米毛細(xì)管相比，亞微米或者納米尺度的毛細(xì)管用作ESI噴針時(shí)，其電離行為表現(xiàn)出獨(dú)特的尺寸效應(yīng)，體現(xiàn)在噴霧起始電壓、噴霧流量、初始液滴尺寸、離子電荷分布、基質(zhì)耐受性、分子構(gòu)象、電遷移等方面，對這些尺寸效應(yīng)的認(rèn)知及其機(jī)理闡釋有助于評估納米毛細(xì)管電噴霧對特定研究體系的適用性。

2.1 起始電壓

納米毛細(xì)管的電噴霧起始電壓通常顯著低于開口尺寸更大的微米毛細(xì)管，這可以從Smith等[29]推導(dǎo)的公式得到解釋，其指出了電噴霧起始電壓(Von)和噴針半徑(rt)、溶液表面張力(γ)、噴針尖端與質(zhì)譜入口距離(d)之間的關(guān)系，示于式(4)：

(4)

其中，ε0為真空介電常數(shù)，β為泰勒錐(Taylor cone)的半錐角(通常為49.3°)[30]。非變性質(zhì)譜分析中的溶劑通常為水，其在負(fù)離子模式下容易發(fā)生電暈放電(corona discharge)，進(jìn)而降低目標(biāo)分子的離子化效率；此外，電暈放電產(chǎn)生的活性氧還會(huì)造成生物分子的氧化損傷[31]。噴霧電壓的降低可有效避免電暈放電對離子化過程的不利影響，這也是納米毛細(xì)管噴霧的優(yōu)點(diǎn)之一。玻璃毛細(xì)管的結(jié)構(gòu)脆弱性要求不宜使用過高的電壓進(jìn)行噴霧，特別是納米毛細(xì)管尖端的玻璃壁僅幾十甚至幾納米厚，噴霧電壓的大小對其結(jié)構(gòu)的維持至關(guān)重要[32]。如，Baker等[11]發(fā)現(xiàn)使用相對較低的電壓(0.9 kV)時(shí)，噴霧前后的石英納米毛細(xì)管孔徑無明顯變化；而當(dāng)電壓提高至1.8 kV時(shí)，僅2 min后，孔徑即可從37 nm擴(kuò)大至65 nm。

2.2 噴霧流量

納米毛細(xì)管的噴霧流量通常顯著低于微米毛細(xì)管的噴霧流量。直徑1～2 μm毛細(xì)管的噴霧流量通常小于100 nL/min，即納噴霧(nanospray)[33]；而直徑 <100 nm毛細(xì)管的噴霧流量可低至皮升流量(< 1 nL/min)，即皮噴霧(picospray)[34]。Williams等[33]使用稱重法測量了噴霧一定時(shí)間后毛細(xì)管內(nèi)溶液的質(zhì)量變化，測得直徑約1 465 nm毛細(xì)管的噴霧流量約為54.78 nL/min，而直徑約244 nm毛細(xì)管的噴霧流量則僅約2.88 nL/min。然而，利用稱重法實(shí)現(xiàn)皮升級流量的準(zhǔn)確測定十分困難，這是因?yàn)樵谄婌F中，1 μL樣品的質(zhì)量僅1 mg，但其噴霧時(shí)間卻長達(dá)數(shù)十小時(shí)。因此，常用體積法測定皮噴霧流量，即通過顯微鏡拍攝、測算噴霧前后毛細(xì)管內(nèi)溶液的體積變化。如，Li等[34]利用該方法實(shí)現(xiàn)了納米毛細(xì)管中超低噴霧流量(< 10 pL/min)的測定。對于極微量樣品而言，納米毛細(xì)管的超低流量是有益的，其延長的噴霧時(shí)間有利于串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集，以實(shí)現(xiàn)復(fù)合物組成的解析。

2.3 離子電荷分布

利用納米毛細(xì)管分析蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子時(shí)，其產(chǎn)生的離子平均電荷數(shù)通常顯著高于尺寸更大的微米毛細(xì)管[11,35]。事實(shí)上，這種伴隨噴針直徑減小而離子平均電荷數(shù)增加的現(xiàn)象在微米尺度亦同樣適用。如Cole等[36]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用直徑5 μm噴針時(shí)，血管緊張素Ⅰ的離子以1+和2+的低電荷分布為主；當(dāng)噴針直徑減小至1 μm時(shí)，則以3+的高電荷分布為主。而尺寸更小的納米毛細(xì)管用于蛋白質(zhì)ESI-MS分析時(shí)，其產(chǎn)生的蛋白離子電荷態(tài)更高，甚至可與以對硝基苯甲醇(m-NBA)為代表的超級充電試劑(supercharging reagent)的效果相媲美[37-38]。離子電荷態(tài)越高，通常其碎裂所需的能量越低，且更易于產(chǎn)生豐富的碎片離子，因此有利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析。

一般認(rèn)為，電噴霧產(chǎn)生的初始液滴尺寸與噴針開口直徑相關(guān)，當(dāng)使用微米毛細(xì)管時(shí)，前者通常不到后者的1/10[39-42]。雖然目前尚無精準(zhǔn)測定的報(bào)道，但納米毛細(xì)管電噴霧產(chǎn)生的初始噴霧液滴尺寸通常被認(rèn)為應(yīng)遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)微米毛細(xì)管產(chǎn)生的初始噴霧液滴尺寸[34-35,40]。初始帶電液滴的尺寸越小，其荷電量與體積的比值越大，這也是納米毛細(xì)管電噴霧中離子具有較高電荷態(tài)的原因之一。

2.4 非特異性加合

圖4 納米毛細(xì)管對蛋白質(zhì)和鈉離子非特異性加合物形成的抑制效應(yīng)[35]Fig.4 Effect of nanoemitters on suppressing the non-specific metal adduction to protein[35]

得益于極小的初始液滴尺寸，納米毛細(xì)管能顯著減少甚至完全避免電噴霧電離過程中蛋白質(zhì)與金屬離子、配體等分子間的非特異性結(jié)合，示于圖4[35]。以常見于各種緩沖溶液中的鈉離子為例，其對蛋白質(zhì)ESI-MS分析的不利影響來自多個(gè)方面[43]：1) 作為非揮發(fā)性鹽，Na+具有離子抑制效應(yīng)，能顯著抑制蛋白質(zhì)等目標(biāo)分子的離子化，降低其總信號強(qiáng)度[43]；2) 在去溶劑過程中，Na+能與蛋白質(zhì)中的負(fù)電性基團(tuán)(如天冬門氨酸、谷氨酸以及肽鏈羧基端的R—COO-)通過靜電相互作用形成加合物[43-44]，使得蛋白質(zhì)的質(zhì)譜峰分散，進(jìn)一步降低信號強(qiáng)度與信噪比；3) 高濃度的非揮發(fā)性鹽還易形成鹽簇峰，嚴(yán)重干擾甚至完全掩蓋蛋白質(zhì)的質(zhì)譜峰[45]。納米毛細(xì)管能從多方面改善非揮發(fā)性鹽溶液中目標(biāo)蛋白質(zhì)分子的ESI-MS分析性能。首先，得益于更小的初始液滴尺寸，蛋白質(zhì)與Na+等金屬陽離子的非特異性加合能被顯著抑制。以150 mmol/L NaCl、5 μmol/L蛋白質(zhì)的水溶液為例，平均直徑85 nm的液滴在概率上剛好包含1個(gè)蛋白質(zhì)分子，此時(shí)Na+數(shù)量約為30 000；而當(dāng)液滴尺寸減少至30 nm時(shí)，雖然大部分液滴中都不含有蛋白質(zhì)分子(即平均每22個(gè)液滴才含有1個(gè)蛋白質(zhì)分子)，但恰好含有1個(gè)蛋白質(zhì)分子液滴的Na+數(shù)量僅約為1 400[40]，這是納米毛細(xì)管能顯著減少電噴霧中蛋白質(zhì)與金屬陽離子間的非特異性加合的原因之一。此外，尺寸較大的帶電液滴需經(jīng)歷多個(gè)“溶劑蒸發(fā)”和“液滴碎裂”過程才能最終形成氣相離子，伴隨著的是非揮發(fā)性鹽的顯著濃縮，這也是電噴霧中蛋白質(zhì)易與金屬離子形成非特異性加合物的重要原因[35,44,46]。而在納米毛細(xì)管電噴霧中，由于初始帶電液滴尺寸極小，Williams等[47]甚至推測蛋白質(zhì)分子能從納米毛細(xì)管直接噴射出來，因此由于多步“溶劑蒸發(fā)”和“液滴碎裂”過程導(dǎo)致的溶質(zhì)濃縮效應(yīng)在納米毛細(xì)管電噴霧中不顯著，這也是其能抑制非特異性加合物形成的重要原因[35,40]。

2.5 基質(zhì)耐受性

除了對非特異性加合物形成的抑制效應(yīng)，納米毛細(xì)管電噴霧還具備極佳的抗基質(zhì)干擾能力。通常，溶液中除目標(biāo)分子以外的其他成分都可稱為基質(zhì)，其對目標(biāo)分子電離的不利影響可統(tǒng)稱為基質(zhì)干擾。納米毛細(xì)管實(shí)現(xiàn)高靈敏分析的原因：一方面源自其產(chǎn)生的初始液滴尺寸極小，具有較高的電荷/體積比，有利于目標(biāo)蛋白分子的離子化，因而能改善非揮發(fā)性鹽等的離子抑制效應(yīng)[11]；另一方面，小尺寸初始液滴中非揮發(fā)性鹽等基質(zhì)的絕對含量更低，鹽簇峰的形成顯著減少，其對目標(biāo)分子的譜峰干擾和掩蓋更少，有利于實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)環(huán)境下蛋白質(zhì)等生物分子的高靈敏檢測[40]。通常，大型蛋白質(zhì)組裝體、蛋白質(zhì)-藥物復(fù)合物結(jié)合狀態(tài)的維系往往需要生理或者近生理的離子強(qiáng)度和pH值環(huán)境[48]，所使用的高濃度非揮發(fā)性緩沖鹽對ESI-MS的分析性能影響極大[40,49]。對基質(zhì)尤其是非揮發(fā)性鹽的耐受能力是納米毛細(xì)管電噴霧最重要的特性，為這些極具挑戰(zhàn)的樣品分析提供有效的技術(shù)基礎(chǔ)，是其在native MS領(lǐng)域廣受關(guān)注的根本原因。

2.6 蛋白質(zhì)與玻璃內(nèi)壁的相互作用

納米毛細(xì)管的諸多特性對native MS亦非總是有利，如前文提及的蛋白離子高電荷態(tài)現(xiàn)象。ESI-MS中，蛋白離子的電荷態(tài)通常被認(rèn)為是反映蛋白質(zhì)構(gòu)象狀態(tài)的指針[33,50-51]。以細(xì)胞色素c(cyt c)為例，其在中性pH值下呈緊湊折疊的球狀構(gòu)象，非變性質(zhì)譜分析所得的質(zhì)譜峰通常應(yīng)為介于6+～10+的低電荷分布。然而，納米毛細(xì)管電噴霧所得的cyt c離子常為大于10+的高電荷分布，意味著其通過毛細(xì)管時(shí)構(gòu)象發(fā)生了改變，從緊湊折疊部分轉(zhuǎn)變?yōu)槿フ郫B構(gòu)象[11,35,52]。Mortensen等[52]對該現(xiàn)象進(jìn)行了細(xì)致的研究，指出cyt c等正電性蛋白質(zhì)分子通過納米毛細(xì)管時(shí)與帶負(fù)電玻璃內(nèi)壁的靜電相互作用導(dǎo)致了去折疊過程，示于圖5。類似的靜電相互作用還體現(xiàn)在正電性蛋白質(zhì)在玻璃內(nèi)壁上的吸附，結(jié)果是cyt c等正電性蛋白質(zhì)在界面吸附飽和之前完全無法測得任何質(zhì)譜信號[53]。通過對玻璃內(nèi)壁的界面修飾、改性，可有效避免上述靜電相互作用的不利影響[54]。

圖5 蛋白與玻璃內(nèi)壁的相互作用導(dǎo)致蛋白發(fā)生去折疊[52]Fig.5 Surface-induced protein unfolding in submicron electrospray emitters[52]

2.7 濃差極化

在靜電場下，玻璃毛細(xì)管中的物質(zhì)輸運(yùn)方向取決于電泳和電滲流(EOF)的矢量和。但與常規(guī)EOF有所不同，伴隨著噴霧的進(jìn)行，毛細(xì)管內(nèi)體相溶液的運(yùn)動(dòng)總是朝向針尖(質(zhì)譜入口)方向。而由于荷電離子的電遷移方向和速率(離子淌度)不同，在微納毛細(xì)管電噴霧中，常能在針尖觀察到顯著的濃差極化現(xiàn)象，體現(xiàn)為不同荷電性分子的質(zhì)譜信號隨時(shí)間增強(qiáng)或減弱的變化[55]。依據(jù)不同溶質(zhì)分子電遷移速率的不同，可在電噴霧過程中實(shí)現(xiàn)在線分離。如Wei等[45,56]利用梯度電場實(shí)現(xiàn)了基質(zhì)尤其是非揮發(fā)性鹽與蛋白質(zhì)、多肽等分子的有效分離，能在高濃度的緩沖鹽溶液中實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)、多肽等高靈敏質(zhì)譜檢測。納米毛細(xì)管電噴霧的流量較微米毛細(xì)管要低很多，因此由荷電離子的電泳運(yùn)動(dòng)引起的濃差極化現(xiàn)象通常更顯著，示于圖6，進(jìn)而有可能造成相對定量、蛋白質(zhì)-藥物復(fù)合物的結(jié)合狀態(tài)等分析結(jié)果的誤差，應(yīng)在相關(guān)的定量研究中予以考慮與評估。

圖6 高壓電場下納米毛細(xì)管內(nèi)離子的濃差極化現(xiàn)象[55]Fig.6 Ion concentration (depletion or enrichment) in a nanoscale electrospray emitter under high-voltage field[55]

3 納米毛細(xì)管電噴霧在非變性質(zhì)譜中的應(yīng)用

非變性質(zhì)譜要求在電噴霧電離中盡可能地保持蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的三維構(gòu)象和結(jié)合狀態(tài)，這是納米毛細(xì)管用于非變性質(zhì)譜分析的前提。Wysocki等[57]利用離子遷移譜和表面誘導(dǎo)解離等技術(shù)，詳細(xì)對比了直徑分別為80 nm和9 μm毛細(xì)管產(chǎn)生的蛋白質(zhì)離子的電荷態(tài)分布、碰撞截面積和碎裂模式，發(fā)現(xiàn)納米毛細(xì)管和常規(guī)微米毛細(xì)管產(chǎn)生的蛋白質(zhì)離子在結(jié)構(gòu)上具有高度的相似性，表明使用合適的緩沖溶液體系時(shí)，納米毛細(xì)管電噴霧能在離子化過程中較好地保持蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的三維構(gòu)象和結(jié)合狀態(tài)。近年來，基于納米毛細(xì)管的ESI-MS已廣泛用于生理或近生理緩沖溶液中蛋白質(zhì)的直接檢測、蛋白質(zhì)-配體親和力的直接測量、大規(guī)模潛在成藥分子的快速篩選、寡核苷酸的直接質(zhì)譜分析等領(lǐng)域。

3.1 生理或近生理緩沖溶液中蛋白質(zhì)的直接檢測

目前，native MS中常用的醋酸銨緩沖溶液雖能提供足夠的離子強(qiáng)度，但有研究[58]指出，醋酸銨并不具備中性pH值范圍內(nèi)的緩沖能力。而傳統(tǒng)生化緩沖體系中的非揮發(fā)性鹽對蛋白質(zhì)的離子化存在極大的抑制效應(yīng)，因此不經(jīng)除鹽處理的直接質(zhì)譜分析難度極大。此前，本課題組首次報(bào)道了～120 nm毛細(xì)管噴針能有效減少ESI-MS中多肽、蛋白質(zhì)與金屬陽離子間的非特異性加合，顯著改善ESI-MS的基質(zhì)耐受性[35]。Williams等[40]利用～0.5 μm毛細(xì)管實(shí)現(xiàn)了離子強(qiáng)度100～200 mmol/L生理緩沖溶液中蛋白質(zhì)的直接檢測，無需任何除鹽操作。與之相比，～1.6 μm微米噴針?biāo)玫馁|(zhì)譜圖中幾乎全是鹽簇峰，少有可辨別的蛋白質(zhì)信號。隨后，該課題組[49]將可分析的溶液體系進(jìn)一步拓展至磷酸鹽(PBS)、哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、三羥甲基氨基甲烷(TRIS)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)等生化實(shí)驗(yàn)常用的緩沖體系(示于圖7)，除水溶性蛋白外，還利用～0.5 μm噴針實(shí)現(xiàn)了膜蛋白的直接分析[47]。通常，膜蛋白的水溶性較差，常使用表面活性劑輔助溶解。然而，離子型和非離子型表面活性劑對膜蛋白的離子化存在顯著的抑制效應(yīng)，同時(shí)表面活性劑與膜蛋白的加合還會(huì)使蛋白質(zhì)的譜峰展寬，進(jìn)一步降低其信噪比。因此，使用傳統(tǒng)微米毛細(xì)管噴針通常無法實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中膜蛋白的直接質(zhì)譜分析。與之相比，～0.5 μm亞微米噴針則成功實(shí)現(xiàn)了從含有150 mmol/L NaCl、25 mmol/L Tris-HCl以及1.1%辛烷基葡糖苷溶液中直接檢出膜蛋白，無需任何除鹽或分離等前處理步驟[47]。

圖7 生理或近生理緩沖溶液中蛋白質(zhì)的直接質(zhì)譜檢測[49]Fig.7 Mass spectra of proteins from solutions at or near physiological ionic strength[49]

需要指出的是，上述研究雖然實(shí)現(xiàn)了生理或近生理緩沖溶液中蛋白質(zhì)分子的直接檢測，但僅是實(shí)現(xiàn)了蛋白譜峰的電荷分辨，金屬離子、表面活性劑等對蛋白的非特異性加合仍十分嚴(yán)重，表現(xiàn)為所測得的蛋白分子質(zhì)量通常遠(yuǎn)大于其理論值。

3.2 蛋白質(zhì)-配體親和力的直接測量

非揮發(fā)性鹽常用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與結(jié)合狀態(tài)。得益于基質(zhì)耐受性以及對非特異性加合的抑制，基于亞微米和納米毛細(xì)管的ESI-MS可用于蛋白質(zhì)與配體分子間親和力(解離常數(shù)Kd)的直接測量。Donald等[59]發(fā)現(xiàn)毛細(xì)管直徑從～2 μm逐步減小至～250 nm時(shí)，蛋白質(zhì)及其與配體復(fù)合物的譜峰質(zhì)量得到顯著改善，可滿足定量分析要求。而得益于質(zhì)譜的多組分同時(shí)檢測能力，實(shí)現(xiàn)了從1張質(zhì)譜圖中直接測算碳酸酐酶與多達(dá)6種配體分子的親和力數(shù)據(jù)。Klassen等[60]利用直徑～50 nm毛細(xì)管進(jìn)一步將蛋白質(zhì)與配體間親和力的直接精準(zhǔn)測量從此前的μmol/L級拓展至更弱的mmol/L級，此項(xiàng)定量研究表明納米毛細(xì)管電噴霧能在離子化過程中很好地保持蛋白質(zhì)-配體間僅mmol/L級的非共價(jià)弱相互作用。但值得指出的是，這些工作仍使用了醋酸銨部分或全部替換常規(guī)生化緩沖體系中的非揮發(fā)性鹽，以改善質(zhì)譜峰的質(zhì)量，對于生理或近生理溶液中蛋白質(zhì)-配體間親和力的直接測算仍存在困難。

3.3 潛在成藥分子的快速篩選

天然產(chǎn)物是指從自然界的動(dòng)物、植物及微生物中分離、提純得到的代謝物，其種類繁多、結(jié)構(gòu)多樣，是藥物研發(fā)中獲得先導(dǎo)化合物的重要來源[61]。水楊苷、奎寧、青蒿素、紫杉醇等一系列結(jié)構(gòu)新穎、生物活性強(qiáng)的天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和利用是現(xiàn)代藥學(xué)發(fā)展過程中重要的里程碑，對人類健康產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。然而，天然產(chǎn)物浩如煙海，其中活性組分的快速、高通量篩選充滿挑戰(zhàn)[62]。最近，Donald課題組[63]利用非變性質(zhì)譜技術(shù)開發(fā)了從天然產(chǎn)物中快速篩選活性分子的方法，其流程示于圖8a。該方法直接利用天然植物的提取物作為分子庫，將其與靶蛋白(如碳酸酐酶)混合，隨后利用凝膠過濾法除去提取物中未與靶蛋白結(jié)合的組分，再利用基于納米毛細(xì)管的非變性質(zhì)譜對新形成的復(fù)合物進(jìn)行檢測。同時(shí)，利用串聯(lián)質(zhì)譜還可方便地鑒定復(fù)合物中的活性小分子。該方法無需對提取物進(jìn)行復(fù)雜且耗時(shí)的分離提純，1次實(shí)驗(yàn)即可從包含上千種分子的天然產(chǎn)物提取物中快速鑒定出可能的活性分子，極大地提升了潛在藥物分子的篩選效率。

圖8 天然產(chǎn)物中活性分子的快速native MS篩選[63]Fig.8 Multiplexed screening of thousands of natural products for protein-ligand binding via native MS[63]

3.4 高濃度非揮發(fā)性鹽溶液中核苷酸的直接質(zhì)譜分析

與蛋白質(zhì)分子類似，核苷酸的三維結(jié)構(gòu)及其與配體(藥物分子、輔因子等)間的弱相互作用同樣廣泛受到溶液中金屬離子的調(diào)控[64]。一方面，正電性的金屬陽離子(如Na+、K+等)能通過與核苷酸骨架上負(fù)電性的磷酸基團(tuán)間的靜電相互作用，削弱核苷酸分子內(nèi)及分子間的靜電排斥，促進(jìn)分子折疊以形成發(fā)卡(hairpin)、雙螺旋(duplex)、三螺旋(triplex)、G-四鏈體(G-quadruplex)、i-Motif等高級結(jié)構(gòu)；另一方面，金屬陽離子也能通過與核酸分子的配位相互作用促進(jìn)高級結(jié)構(gòu)(特別是G-四鏈體)的形成并使其穩(wěn)定化[65]。此外，Mg2+等還能在磷酸基團(tuán)間形成鹽橋(salt bridge)，實(shí)現(xiàn)對核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的長程調(diào)控[66]。由于核酸分子含有大量的磷酸基團(tuán)，其在中性pH值下整體帶負(fù)電，因此常使用負(fù)離子模式進(jìn)行質(zhì)譜分析，這與蛋白質(zhì)分析時(shí)常使用正離子模式有所不同。然而，即便是在負(fù)離子模式下，溶液中的金屬陽離子對核酸分子的檢測仍存在極大的干擾和抑制。Fabris等[67]對比研究了1.4 μm和0.6 μm噴針分析高濃度非揮發(fā)性鹽(1～20 mmol/L NaCl)溶液中寡核苷酸時(shí)的性能表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)亞微米噴針?biāo)玫馁|(zhì)譜圖中不僅鹽簇峰極大地減少，寡核苷酸的信號強(qiáng)度以及譜峰信噪比也較微米噴針有數(shù)倍的提升。此外，寡核苷酸與金屬陽離子(Mg2+和Na+等)間的非特異性加合在亞微米噴針下也得以顯著減少，這對Mg2+與核酸之間特異性結(jié)合的識別十分有益。這些現(xiàn)象與正離子模式下分析蛋白質(zhì)時(shí)十分類似，表明了小尺寸噴針在改善基質(zhì)抑制效應(yīng)、減少非特異性加合等方面的普適性。

Donald等[68]使用～250 nm噴針進(jìn)一步研究了紡錘菌素(netropsin)和發(fā)卡DNA間的結(jié)合機(jī)理。紡錘菌素是第一個(gè)被鑒定的能特異性結(jié)合在DNA小溝區(qū)(minor groove)的小分子[69]，但其與DNA分子的結(jié)合模式存有一定爭議，文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)合模式主要包括與發(fā)卡結(jié)構(gòu)結(jié)合的2M機(jī)理(two modes (2M) mechanism)[70]以及結(jié)合誘導(dǎo)發(fā)卡結(jié)構(gòu)向雙螺旋轉(zhuǎn)變的HD機(jī)理(hairpin-to-duplex (HD) transition mechanism)[71]。得益于亞微米噴針的使用，他們從高質(zhì)量的質(zhì)譜數(shù)據(jù)中定量分析紡錘菌素與發(fā)卡DNA的結(jié)合情況，并發(fā)現(xiàn)了紡錘菌素的結(jié)合并不會(huì)顯著改變發(fā)卡與雙螺旋結(jié)構(gòu)的比例等不符合2M和HD機(jī)理的現(xiàn)象。據(jù)此提出了紡錘菌素與發(fā)卡結(jié)構(gòu)、雙螺旋結(jié)構(gòu)同時(shí)結(jié)合的SB機(jī)理(“simultaneously” bind (SB) mechanism)，表明了非變性質(zhì)譜在核酸與配體相互作用機(jī)理研究中的重要價(jià)值。

雖然亞微米毛細(xì)管能顯著提升高濃度非揮發(fā)性鹽溶液中核酸的質(zhì)譜檢出性能，但仍不足以完全抑制金屬陽離子與核酸分子間的非特異性加合現(xiàn)象，因而限制了對諸如G-四鏈體等復(fù)合物中金屬陽離子(如K+等)配位情況的準(zhǔn)確解析。針對這一挑戰(zhàn)，本課題組提出了一種聯(lián)合策略，即同時(shí)利用～70 nm納米毛細(xì)管、低流量干燥氣流以及使用乙酸三甲基銨部分替代非揮發(fā)性鹽，最終實(shí)現(xiàn)了對非特異性加合的完全抑制，能直接從生理或近生理離子強(qiáng)度溶液中準(zhǔn)確識別G-四聯(lián)體內(nèi)K+、Na+配位數(shù)及其配位模式[72]。

4 總結(jié)與展望

基于納米毛細(xì)管的非變性質(zhì)譜技術(shù)可以直接從生理或近生理的緩沖溶液中，在不破壞完整蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)和結(jié)合狀態(tài)的情況下，從分子層面獲取其組成、結(jié)合動(dòng)力學(xué)等信息，已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)-配體間的弱相互作用、潛在藥物分子的快速篩選等領(lǐng)域。納米毛細(xì)管的引入為電噴霧電離質(zhì)譜帶來了前所未有的基質(zhì)耐受性，極大地拓寬了非變性質(zhì)譜的應(yīng)用范圍，是該領(lǐng)域近年來最重要的技術(shù)進(jìn)步。然而，濃差極化、蛋白與玻璃內(nèi)壁的界面相互作用(蛋白質(zhì)的去折疊、吸附等)造成的不利影響仍需要在具體研究中予以考慮并設(shè)法避免。此外，當(dāng)前基于納米毛細(xì)管的非變性質(zhì)譜在通用性上仍存在較大的局限。首先，納米毛細(xì)管的小尺寸特性使其極易發(fā)生堵塞；其次，納米毛細(xì)管的噴霧流量極低，難以與液相色譜、毛細(xì)管電泳等分離技術(shù)結(jié)合；此外，納米毛細(xì)管電噴霧的電離行為對所使用的電離參數(shù)(電壓、溫度、距離、干燥氣流量等)極為敏感，實(shí)際操作中往往需要進(jìn)行細(xì)致調(diào)優(yōu)才能獲得較好的分析性能。納米毛細(xì)管的尺寸效應(yīng)和界面性質(zhì)是其電離行為特性的根源，通過精準(zhǔn)的尺寸控制、界面修飾與功能化，有望進(jìn)一步優(yōu)化納米毛細(xì)管電噴霧電離質(zhì)譜的分析性能，促進(jìn)其在大型蛋白質(zhì)組裝體、蛋白質(zhì)-藥物復(fù)合物等樣品分析中的應(yīng)用研究。