易可可，謝 潔，江 游，黃澤建，龔曉云，翟 睿，喬曉婷，劉梅英，戴新華，方 向，時(shí)國慶

(1.北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100083；2.中國計(jì)量科學(xué)研究院前沿計(jì)量科學(xué)中心，質(zhì)譜儀器工程技術(shù)研究中心，北京 100029)

對臨床實(shí)驗(yàn)室收集的患者血液、體液等樣品進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測，可以提供對疾病預(yù)防、診斷、治療方案和預(yù)后判斷的重要依據(jù)。傳統(tǒng)的檢測方法(如基于抗原抗體結(jié)合的免疫測定(IA))是常規(guī)臨床檢測方法之一[1]，但臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，IA法會(huì)出現(xiàn)選擇性差或假陽性結(jié)果[2]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)憑借高靈敏度和高選擇性的優(yōu)點(diǎn)，可提供更準(zhǔn)確的分析結(jié)果，在臨床檢驗(yàn)中發(fā)揮著重要作用。

質(zhì)譜的電離模式通?？煞譃橛搽婋x[3]和軟電離[4-5]，其中硬電離模式目前僅限于分析具有揮發(fā)性和熱穩(wěn)定的化合物[6]，不適用于分析臨床樣本；軟電離允許樣品分子在電離過程中保持完整形態(tài)[7]，有利于檢測臨床小分子分析物，電噴霧電離是臨床質(zhì)譜最常見的電離模式。完整的樣品分子進(jìn)入串聯(lián)質(zhì)譜后，在一級(jí)質(zhì)譜中選擇特定化合物的母離子，在碰撞池中將母離子碰撞裂解，隨后采用二級(jí)質(zhì)譜的MRM或SRM模式獲得對應(yīng)的離子對信息[8-9]。相比于其他方法如紫外分光光度法、熒光光譜法和免疫測定法等，串聯(lián)質(zhì)譜具有更高的選擇性、準(zhǔn)確性、分辨率、靈敏度等優(yōu)勢[10-11]，可通過MRM/SRM模式實(shí)現(xiàn)對多種分析物的同時(shí)準(zhǔn)確定量[12]。

基于液相色譜分離的LC-MS/MS是目前臨床實(shí)驗(yàn)室中最常用的檢測方法[13-15]。由于臨床檢驗(yàn)的樣本通常是基質(zhì)復(fù)雜的生物液體或固體，不適于直接通過質(zhì)譜分析，須對樣品進(jìn)行預(yù)處理和色譜分離。其中，預(yù)處理過程中樣品制備不僅會(huì)影響色譜的分離效果，還會(huì)影響分析物信號(hào)強(qiáng)度。有時(shí)需要根據(jù)所采用LC-MS/MS系統(tǒng)的檢出限濃縮或稀釋樣品，并通過優(yōu)化液相色譜條件將目標(biāo)物與干擾成分分離[11, 16-17]。

本文基于LC-MS/MS在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，擬討論LC-MS/MS在新生兒篩查[18]、維生素D檢測[19]、內(nèi)分泌激素檢測[20]、血藥濃度監(jiān)測[21]、蛋白定量分析[22]等應(yīng)用中存在的獨(dú)特優(yōu)勢和局限性，并討論目前臨床實(shí)驗(yàn)室在LC-MS/MS應(yīng)用中可能面臨的挑戰(zhàn)，并對其發(fā)展趨勢和應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

1 LC-MS/MS在臨床檢驗(yàn)的應(yīng)用研究進(jìn)展

目前，LC-MS/MS在臨床中可檢測項(xiàng)目多達(dá)500余項(xiàng)，主要的檢測項(xiàng)目列于表1。該技術(shù)使多種疾病在早期得以被準(zhǔn)確、快速、高靈敏地診斷。

表1 臨床質(zhì)譜檢測項(xiàng)目Table 1 Detectable items of MS in clinical application

1.1 新生兒遺傳代謝疾病篩查

先天性代謝缺陷(IEM)是一類罕見的遺傳疾病，其成因復(fù)雜，且多屬于進(jìn)行性疾病，病情惡化后可導(dǎo)致新生兒嚴(yán)重的損傷甚至殘疾，因此早期篩查、診斷和治療具有重要意義。LC-MS/MS技術(shù)能夠快速、準(zhǔn)確地對新生兒篩查中的多種疾病標(biāo)志物進(jìn)行定性、定量分析[57-58]。該技術(shù)可通過收集干血斑(DBS)制備樣本，對嬰兒傷害小且簡單[59]。通常直接用含有一定量同位素內(nèi)標(biāo)的提取液從干血斑中提取目標(biāo)物，然后直接進(jìn)行LC-MS/MS分析，預(yù)處理簡便、省時(shí)，2 min內(nèi)即可完成1個(gè)樣本的檢測，具備極高的檢測效率和通量。隨著方法的不斷開發(fā)，單個(gè)樣本中可同時(shí)檢測的分析物種類不斷增加。目前，市售的試劑盒可以同時(shí)分析單個(gè)樣品中的30多種標(biāo)志物，如山東英盛的新生兒遺傳代謝病篩查試劑盒，可檢測13種氨基酸、31種肉堿和琥珀酰丙酮，列于表2。此外，將高效液相色譜替換為超高效液相色譜，與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，不僅擴(kuò)大了疾病診斷的范圍，還能進(jìn)一步提高儀器的靈敏度，一些標(biāo)志物的檢出限可達(dá)1 ng/mL[25,29]，為臨床實(shí)驗(yàn)室提供了更強(qiáng)大的分離各種疾病標(biāo)志物的能力[60]。

LC-MS/MS技術(shù)自20世紀(jì)被用于新生兒篩查，至今已經(jīng)發(fā)展成熟，其缺點(diǎn)在于設(shè)備昂貴、對實(shí)驗(yàn)室條件和技術(shù)人員的要求較高，且需要實(shí)驗(yàn)室具有一定水平的質(zhì)量控制能力。此外，由于新生兒篩查臨床樣本中各分析物的濃度受疾病和新生兒母親營養(yǎng)水平影響較大，因此各分析物具有較寬的參考范圍。IEM患兒出生后，短時(shí)間內(nèi)一些代謝物可能保持在正常水平，但隨年齡增長后出現(xiàn)變化，有時(shí)僅依靠LC-MS/MS的定量結(jié)果不足以構(gòu)成診斷的充分條件。目前，第二代測序技術(shù)作為LC-MS/MS的二級(jí)診斷方式或二者組合的形式被廣泛使用，這種組合策略可降低LC-MS/MS的誤診風(fēng)險(xiǎn)[61]。

1.2 維生素D

維生素D(VD)的缺乏會(huì)導(dǎo)致少兒佝僂病和成年人的軟骨病，是一個(gè)世界性的健康問題，對VD的濃度水平檢測具有診斷意義[62]。VD在肝臟中轉(zhuǎn)化為25-羥基維生素D(25(OH)D)，其中25-羥基維生素D3(25(OH)D3)是主要的存在形式，同時(shí)也存在少量25-羥基維生素D2(25(OH)D2)。由于25(OH)D總含量高于其他任何VD代謝物且相對穩(wěn)定，臨床通過檢測25(OH)D作為評(píng)價(jià)人體VD營養(yǎng)水平的可靠指標(biāo)，將25(OH)D低于20 ng/mL (50 nmol/L)定義為VD缺乏[69]。目前，血清樣品中25(OH)D的檢測主要采用基于抗原與抗體特異性結(jié)合的IA法或LC-MS/MS法，IA法成本低廉，預(yù)處理過程易于自動(dòng)化和高通量檢測，但其主要缺點(diǎn)是抗體與25(OH)D代謝物之間存在交叉反應(yīng)，并且檢測容易受到溫度、基質(zhì)、抗體狀態(tài)等條件影響[70]。此外，該方法僅能得到25(OH)D總含量，無法分別定量25(OH)D2和25(OH)D3。LC-MS/MS技術(shù)不僅能區(qū)分微量復(fù)雜樣本中25(OH)D2和25(OH)D3，同時(shí)具有很高的靈敏度，這是由于通過色譜分離或同位素標(biāo)記法來篩選候選的生物標(biāo)記物，解決了同分異構(gòu)體干擾的問題[63]，因此，LC-MS/MS被國際公認(rèn)為測定25(OH)D的“金標(biāo)準(zhǔn)”[64]。

表2 氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮的LC-MS/MS測定試劑盒Table 2 LC-MS/MS kit for determination of amino acids, carnitine and succinyl acetone

然而，在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，VD存在少量差向異構(gòu)體的類似物，差向異構(gòu)體在一些人群如嬰兒體內(nèi)的含量足以影響診斷結(jié)果，需要進(jìn)行長時(shí)間的色譜分離才能得到滿意的分離效果。此外，由于25(OH)D為甾體類化合物，除C、H、O外只含有較少的其他原子，因此電離效率較低，且電離后表現(xiàn)出較差的、非特征性的碎裂特性[65]，限制了VD臨床檢測的靈敏度。一些研究[66-67]使用樣品衍生化或在流動(dòng)相中添加鹽來提高靈敏度，但衍生化步驟繁瑣、耗時(shí)且不便于大規(guī)模分析應(yīng)用。Tai等[68]開發(fā)了一種基于LC-MS/MS的測定人血清中25(OH)D的參考測量測序程序，采用LLE預(yù)處理樣品，不經(jīng)過衍生化，分析時(shí)長為45 min，25(OH)D的檢出限為0.375 nmol/L。Liebisch等[69]改進(jìn)了該方法后，使分析時(shí)間縮短至4 min。Kassim等[70]開發(fā)了一種基于衍生化的檢測血清中12種VD代謝物的LC-MS/MS方法，分析時(shí)間長達(dá)34 min，但檢出限可達(dá)fmol水平。Wan等[71]基于衍生化開發(fā)了檢測VD代謝物的新方法，同時(shí)采用液液萃取-固相萃取(LLE-SPE)聯(lián)用的預(yù)處理方法，與單獨(dú)的SPE相比，降低了2～4倍的離子抑制，分析時(shí)間為13 min，定量限為0.005～0.02 nmol/L。Mena-Bravo等[72]基于二維液相色譜(2DLC)提出了SPE-2DLC-MS/MS方法，用于人血清中VD代謝物的絕對定量分析，2DLC可以分離25(OH)D3和差向異構(gòu)體，檢出限范圍在0.023～0.225 nmol/L，RSD小于11.6%。最近，Kassim等[34]報(bào)道了在不使用衍生化的情況下，25(OH)D2和25(OH)D3的檢出限分別達(dá)到0.012和0.037 nmol/L，由于采用了在線SPE方法，進(jìn)一步純化提取物需要較長時(shí)間，總分析時(shí)長為35 min。因此，開發(fā)更短時(shí)間和少量樣本即可同時(shí)分析VD及其代謝物的新方法，將有助于VD缺乏相關(guān)疾病的臨床診斷。通過LC-MS/MS同時(shí)檢測維生素D和其代謝物的相關(guān)信息列于表3。

1.3 內(nèi)分泌激素

人體內(nèi)某種激素濃度發(fā)生變化可能會(huì)對其他激素產(chǎn)生影響，因此，同時(shí)測量多種內(nèi)源性激素在臨床和生理學(xué)研究中具有重要意義[73]。但許多激素具有相似的分子結(jié)構(gòu)，且激素含量較低，樣品受性別、年齡等因素影響較大[74-76]，準(zhǔn)確定量分析內(nèi)分泌激素是目前臨床最具挑戰(zhàn)性的問題之一。以臨床中常見的腎上腺皮質(zhì)癌為例，其病理特征是在男性和絕經(jīng)后女性體內(nèi)過量分泌雌激素，而且患者的17-羥基孕酮、雄烯二酮和硫酸脫氫表雄酮等多種激素也在生理周期內(nèi)異常上升[77]，須在1次檢測中同時(shí)篩選多種激素才能分析診斷，常規(guī)檢測涉及激素種類有限，難以滿足要求。采用LC-MS/MS法能同時(shí)檢測這些激素含量，通過色譜分離，使具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的類固醇得到優(yōu)異的純化效果，同時(shí)縮短了分析時(shí)間，能快速得到高重現(xiàn)性的結(jié)果，這對揭示內(nèi)分泌失調(diào)等疾病的發(fā)病機(jī)理，疾病診斷或預(yù)防的標(biāo)志物以及相關(guān)治療方案具有巨大潛力[78]。

目前，LC-MS/MS已用于測量幾乎所有類別的內(nèi)分泌激素[79]，Enver等[80]采用LC-MS/MS建立了嬰兒腎上腺激素含量的參考范圍，可檢測14種內(nèi)分泌激素。Handelsman等[81]通過LC-MS/MS測量10 904份血清樣本，認(rèn)為男性雄激素水平受到年齡、身高和體重等因素的影響，男性的睪酮及其2種生物活性代謝物雙氫睪酮和雌二醇等內(nèi)分泌激素水平呈現(xiàn)從35歲逐漸下降，80歲后下降更顯著的年齡特征。然而，LC-MS/MS在檢測內(nèi)分泌激素方面存在一些缺點(diǎn)。首先，檢測樣本時(shí)會(huì)受到基質(zhì)效應(yīng)和離子抑制等現(xiàn)象的影響，如來自不同人群的血液樣本基質(zhì)成分不同，顯示出不同的離子抑制效果，同時(shí)，由于樣本基質(zhì)復(fù)雜，可能會(huì)發(fā)生同量異位素干擾導(dǎo)致定量誤差，造成誤診。其次，雌激素離子化效率低，雖然通過衍生化引入帶電部分能提高離子化效率，但許多雌激素衍生物會(huì)產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物離子[20]。近年來，有報(bào)道[82]采用LC-MS/MS法測定人血清中包含雌激素在內(nèi)的類固醇，通過在流動(dòng)相中添加氟化銨鹽來替代衍生化，但該方法僅限于檢測孕婦體內(nèi)幾種高表達(dá)的內(nèi)源性雌激素，尚不適用于檢測低含量的類固醇化合物。此外，LC-MS/MS在內(nèi)分泌激素檢測的應(yīng)用時(shí)間相對較短，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部方法的開發(fā)具有一定難度，實(shí)驗(yàn)室建立的各分析物參考范圍仍需要經(jīng)過實(shí)踐檢驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化以盡量減少實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間的差異問題[83]。

表3 維生素D的LC-MS/MS分析Table 3 LC-MS/MS analysis of vitamin D

1.4 血藥濃度監(jiān)測

血藥濃度監(jiān)測包括治療藥物檢測(TDM)、疼痛藥物管理[84-85]和毒理學(xué)檢測[86]等，其中TDM是血藥濃度監(jiān)測在臨床中最常見的應(yīng)用。在臨床實(shí)踐中，由于免疫抑制藥物的治療窗口狹窄且患者個(gè)體差異較大，須準(zhǔn)確測量血液中的免疫抑制藥物濃度來確定給藥窗口，以制定個(gè)性化給藥方案，從而避免藥物副作用。LC-MS/MS方法可在單個(gè)血樣常規(guī)分析中對任意免疫抑制劑的組合方案進(jìn)行準(zhǔn)確定量，是目前實(shí)現(xiàn)TDM的最佳選擇[87]。

TDM中常用的免疫抑制劑包括他克莫司(TAC)、西羅莫司(SIR)、依維莫司(EvE)和環(huán)孢素A(CsA)等，藥物中約75%～95%的成分會(huì)與紅細(xì)胞結(jié)合，所以目前TDM的臨床實(shí)踐主要基于全血樣本，其他非常規(guī)臨床材料(如組織、細(xì)胞、尿液和其他體液的基質(zhì))也可用于TDM，但應(yīng)用較少。此外，由于全血樣本儲(chǔ)存時(shí)間短，將全血制備成DBS為臨床提供了一種簡單的樣本基質(zhì)替代方案，Sadilkova等[88]研究表明，通過LC-MS/MS在DBS和全血中進(jìn)行免疫抑制劑測量的結(jié)果具有良好的相關(guān)性。

在樣本前處理階段，由于全血樣本中血細(xì)胞和蛋白質(zhì)含量較高，大分子蛋白質(zhì)和細(xì)胞會(huì)堵塞色譜柱，無法直接注入色譜柱進(jìn)行分離。此外，全血樣本中藥物濃度通常較低，且存在大量干擾物質(zhì)，導(dǎo)致基質(zhì)干擾嚴(yán)重，因此，為提高方法的靈敏度，有必要去除干擾物質(zhì)來凈化樣品，并通過濃縮分析物來增強(qiáng)信號(hào)。蛋白質(zhì)沉淀(PP)、液液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)是常用于TDM的樣品預(yù)處理方法，PP使用有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈、丙酮或這些溶劑的混合物沉淀全血中的蛋白質(zhì)，將硫酸鋅添加到全血樣本中進(jìn)行溶血可以輔助沉淀蛋白質(zhì)。LLE通常使用甲醇、乙腈和叔丁基甲醚或它們的混合物萃取樣品，但蒸發(fā)和復(fù)溶步驟可能會(huì)導(dǎo)致分析物的損失。SPE無需蒸發(fā)和復(fù)溶步驟，減少了分析時(shí)間，但成本較高。臨床實(shí)驗(yàn)室需要根據(jù)具體分析目標(biāo)優(yōu)化合適的預(yù)處理方案或組合方案，具體報(bào)道列于表4。

表4 免疫抑制劑的LC-MS/MS定量分析Table 4 Quantification of immunosuppressantare by LC-MS/MS

Juliana等[89]采用LC-MS/MS同時(shí)分析了全血樣本中4種免疫抑制藥物的235種組合方案，以探究器官移植后患者的最佳免疫抑制劑給藥量，體現(xiàn)了LC-MS/MS在臨床中為患者提供準(zhǔn)確的個(gè)性化診療方案的巨大優(yōu)勢。然而，LC-MS/MS存在設(shè)備較昂貴、只能在具備條件的實(shí)驗(yàn)室使用等缺點(diǎn)。未來，隨著質(zhì)譜儀更加自動(dòng)化、小型化，使TDM從實(shí)驗(yàn)室分析走向現(xiàn)場快速分析成為可能。

1.5 肽類和蛋白質(zhì)定量分析

蛋白質(zhì)是生命過程的關(guān)鍵角色，定量檢測蛋白質(zhì)對于疾病的預(yù)防、診斷和治療至關(guān)重要。目前，質(zhì)譜已成為蛋白質(zhì)定量分析必不可少的工具，其應(yīng)用包括腫瘤標(biāo)志物檢測[95]、蛋白質(zhì)或肽類藥物定量[96]和靶向蛋白質(zhì)組學(xué)分析[97-98]，Sabbagh等[99]對蛋白質(zhì)定量分析適用方法進(jìn)行了概述。

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)定量分析要求檢測結(jié)果具有高靈敏度、高穩(wěn)定性、高通量以及良好的重復(fù)性，挑戰(zhàn)性較高。首先，由于蛋白質(zhì)在體外條件下易被降解，對樣本基質(zhì)的穩(wěn)定性具有更嚴(yán)格的要求，預(yù)處理方法時(shí)長須小于6 h[100]。其次，不同蛋白質(zhì)在血清或血漿樣本中豐度具有較大差異，須通過液相分離、使用SPE富集、適配體親和富集或使用包括修飾的磁性納米材料等技術(shù)富集含量較低的蛋白質(zhì)。此外，不同于臨床其他分析物，蛋白質(zhì)屬于大分子化合物，實(shí)驗(yàn)室常用的三重四極桿質(zhì)譜無法直接定量分析其天然存在形式，需使用胰蛋白酶進(jìn)行消化處理生成特征肽段，然后將這些特征肽段作為目標(biāo)分析物，并嚴(yán)格優(yōu)化包括孵育時(shí)間、反應(yīng)溫度以及蛋白酶用量在內(nèi)的消化條件，以確保特征肽段與目標(biāo)蛋白質(zhì)的物質(zhì)的量比例接近。可通過不同類型的質(zhì)譜儀實(shí)現(xiàn)肽類和蛋白質(zhì)的定量分析，包括基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)、離子阱質(zhì)譜、單四極桿質(zhì)譜、四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜、三重四極桿質(zhì)譜以及高分辨質(zhì)譜。大多數(shù)情況下使用三重四極桿的SRM/MRM模式即可實(shí)現(xiàn)對多個(gè)目標(biāo)物的高度并行分析[101]。

目前，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)定量分析方法日趨成熟，然而也存在不足：長時(shí)間的色譜分離和有限的通量限制了該方法進(jìn)一步發(fā)展；樣品制備中胰蛋白酶消化和低豐度蛋白質(zhì)的富集，大大延長了分析時(shí)間；大多數(shù)易于定量的蛋白質(zhì)尚未建立各自的參考范圍[102]，由于蛋白質(zhì)豐度的變化可能受多種非疾病因素影響，因此定量結(jié)果還需要其他技術(shù)印證。

2 結(jié)論與展望

基于LC-MS/MS的定量分析方法在臨床檢驗(yàn)中變得越來越重要，目前，已建立了LC-MS/MS對氨基酸、肉堿、VD、一些內(nèi)分泌激素和蛋白質(zhì)等分析物定量檢測的參考測量程序，并提供了可溯源至國際單位制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，隨著標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)模的擴(kuò)大，LC-MS/MS在臨床分析中將得到更多認(rèn)可。目前面臨的主要挑戰(zhàn)有：1) 受限于現(xiàn)有儀器的靈敏度，一些分析物的定量分析需要提前進(jìn)行衍生化處理，增加了分析時(shí)間和使用成本，不利于臨床大規(guī)模分析應(yīng)用；2) 由于臨床樣本基質(zhì)的復(fù)雜性，大多數(shù)分析物尚不明確其定量參考范圍，或缺少相應(yīng)的LC-MS/MS參考測量測序程序，不同個(gè)體間的定量差異須受到重視；3) LC-MS/MS設(shè)備昂貴，開發(fā)新方法的成本較高，因此分析物的定量分析通常僅限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，限制了臨床應(yīng)用的進(jìn)一步發(fā)展。未來，隨著質(zhì)譜儀器小型化，儀器成本將得到控制，現(xiàn)場LC-MS/MS檢測將成為可能。