趙 恒，劉哲益，郭永杰，楊詩蕊,2，王方軍,2

(1.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

非變性質(zhì)譜(native mass spectrometry, nMS)是一種基于非變性條件電噴霧離子化(ESI)的生物分子質(zhì)譜表征方法[1]。nMS采用非變性緩沖溶液將生物分子在保持其高級結(jié)構(gòu)和活性的條件下進(jìn)行電噴霧離子化并引入質(zhì)譜，可以獲取除分子質(zhì)量以外的結(jié)構(gòu)和相互作用信息[2]。目前，nMS已廣泛用于蛋白質(zhì)動態(tài)結(jié)構(gòu)變化、蛋白-蛋白相互作用、蛋白-配體相互作用等研究領(lǐng)域，成為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能表征的新興質(zhì)譜策略[3]。將非變性蛋白質(zhì)離子在保持其高級結(jié)構(gòu)的條件下進(jìn)行二級質(zhì)譜解離，通過檢測產(chǎn)生的碎片離子可以獲取蛋白質(zhì)精細(xì)結(jié)構(gòu)信息。然而，常規(guī)毫秒尺度氣體碰撞誘導(dǎo)質(zhì)譜解離(CID和HCD)通常在蛋白質(zhì)解離前引發(fā)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解聚變性而丟失原始結(jié)構(gòu)信息，且解離序列覆蓋率低，只能表征部分易解離區(qū)域。

高能紫外光解離(UVPD)是近年來迅速發(fā)展的一種納秒尺度快速解離方法，可以產(chǎn)生包括a、b、c、x、y、z等多種類型碎片離子，在肽段、整體蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合物的序列和結(jié)構(gòu)表征中均表現(xiàn)出優(yōu)異的性能[4]。193 nm紫外激光可以直接激發(fā)蛋白質(zhì)骨架實(shí)現(xiàn)5～10 ns單脈沖激發(fā)解離，具有亮度高、穩(wěn)定性好、可以在空氣中傳播的特點(diǎn)，在目前的UVPD分析中應(yīng)用最廣泛[5]。193 nm UVPD對29 ku Pin1蛋白的二級質(zhì)譜解離序列覆蓋率可達(dá)96%，且解離碎片離子仍然保留部分高級結(jié)構(gòu)和相互作用信息，位點(diǎn)解離效率與其局部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[6]。因此，UVPD與nMS的結(jié)合為蛋白質(zhì)精細(xì)結(jié)構(gòu)變化表征提供了一種全新研究范式，美國德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校Brodbelt課題組和荷蘭烏特勒支大學(xué)Heck課題組在該領(lǐng)域做出了開拓性工作[7-10]。在前期工作中，本課題組通過交叉學(xué)科聯(lián)合攻關(guān)搭建了193 nm UVPD-MS裝置，在多肽、蛋白質(zhì)、金屬團(tuán)簇等分子組成和序列、結(jié)構(gòu)表征中取得了新進(jìn)展[11-15]。

在質(zhì)譜氣相中能保持高級結(jié)構(gòu)及弱相互作用的類天然結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)離子通常電荷數(shù)較少、電荷分布較窄，具有較大的質(zhì)荷比，對質(zhì)譜的質(zhì)量檢測范圍要求較高。此外，高分辨質(zhì)譜(FTICR和Orbitrap)的分辨率會隨著被測物m/z的提高而顯著下降。因此，提高非變性蛋白質(zhì)離子的電荷數(shù)目而不影響其高級結(jié)構(gòu)，對質(zhì)譜檢測及后續(xù)二級質(zhì)譜解離具有重要意義。電噴霧離子化過程中樣品溶液會形成帶電液滴，液滴表面的電荷密度隨著溶劑的揮發(fā)而逐漸升高，當(dāng)電荷密度達(dá)到Rayleigh極限后，液滴發(fā)生“庫侖爆炸”產(chǎn)生更小尺寸的液滴，最終實(shí)現(xiàn)樣品分子進(jìn)入氣相并帶電荷。超電荷試劑可以在ESI電離過程中提高蛋白質(zhì)離子的電荷數(shù)目，主要包括環(huán)丁砜(sulfolane)、間硝基苯甲酸(m-NBA)等[16]。它可以使蛋白質(zhì)離子集中在較高電荷狀態(tài)，提高質(zhì)譜信號強(qiáng)度并降低譜圖復(fù)雜度[17]；提高電荷數(shù)目使檢測離子轉(zhuǎn)移到較低m/z區(qū)域，拓展質(zhì)譜檢測分析物的分子質(zhì)量范圍；且電荷數(shù)目增加有助于二級質(zhì)譜解離，提升蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)表征覆蓋度[18]。超電荷試劑增加蛋白質(zhì)離子電荷數(shù)與其改變電噴霧液滴的表面張力、氣液相酸堿度、偶極矩等因素有關(guān)；環(huán)丁砜等超電荷試劑可以在電噴霧過程中增加樣品分子所帶的電荷，也被稱為增荷試劑[19]，與超高電壓增荷[20]和金屬陽離子增荷[16]等提升樣品分子電荷狀態(tài)的方法相比，超電荷試劑具有操作簡單、對質(zhì)譜儀器污染小等優(yōu)點(diǎn)。然而，目前超電荷試劑與蛋白質(zhì)的相互作用、電荷增加對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響機(jī)理、增加電荷過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的詳細(xì)信息仍然不清楚[21]。

碳酸酐酶(carbonic anhydrase Ⅱ, CA)在控制細(xì)胞pH值和CO2運(yùn)輸方面起著重要作用，其表達(dá)紊亂或位點(diǎn)突變會導(dǎo)致青光眼、骨硬化、腦鈣化等疾病[22-24]。在天然狀態(tài)下，CA與鋅離子(Zn2+)非共價結(jié)合。本研究以CA為模型蛋白，利用193 nm UVPD-MS分析非變性電噴霧條件下不同電荷狀態(tài)CA的UVPD解離規(guī)律，對比分析在加入超電荷試劑環(huán)丁砜前后CA的UVPD解離情況，包括解離位點(diǎn)序列覆蓋區(qū)域和位點(diǎn)解離效率。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

本工作所有nMS實(shí)驗(yàn)均在Orbitrap Fusion Lumos Tribrid質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品)上完成。儀器配備了實(shí)驗(yàn)室自主搭建的ArF 193 nm EX50準(zhǔn)分子激光(Gam Laser, Orlando, FL, USA) UVPD解離模塊，在HCD解離阱中進(jìn)行193 nm紫外激光單脈沖解離(5 ns)，解離碎片離子轉(zhuǎn)移進(jìn)入Orbitrap高分辨檢測器進(jìn)行檢測，具體儀器信息可參照本課題組前期工作[11-15]。

1.2 主要材料與試劑

牛碳酸酐酶：美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；環(huán)丁砜、醋酸銨：上海Aladdin公司產(chǎn)品；去離子水：美國Milli-Q公司產(chǎn)品；BF100-58-10硼硅酸毛細(xì)管：美國Phoenix公司產(chǎn)品；250 mL注射器：美國Thermo公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1樣品制備 在非變性樣品制備中，以10 mmol/L醋酸銨為緩沖溶液(pH 7.4)配制10 μmol/L CA樣品溶液，以14 725 r/min離心后進(jìn)行質(zhì)譜分析；取10 μmol/L CA溶液，加入0.25%環(huán)丁砜[25]，振蕩，以14 725 r/min離心10 min后進(jìn)行質(zhì)譜分析。在變性條件下，采用50%甲醇、0.1%甲酸水緩沖溶液進(jìn)行配制，CA濃度同樣為10 μmol/L。

1.3.2質(zhì)譜條件 采用正離子模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，毛細(xì)管噴針電噴霧直接進(jìn)樣，噴霧電壓1.2～1.7 kV，樣品流速0.3 μL/min，質(zhì)譜加熱毛細(xì)管溫度275 ℃。一級質(zhì)譜掃描范圍m/z400～3 500。二級質(zhì)譜HCD模式：碰撞氣體為氮?dú)猓瑲w一化碰撞能量20%，激發(fā)時間10 ms；UVPD模式：193 nm 激光單脈沖激發(fā)(脈寬5 ns)，脈沖能量1.0～1.5 mJ。二級質(zhì)譜掃描范圍m/z400～4 000，自動增益控制(AGC)5×104；離子最大注入時間100 ms。所有二級質(zhì)譜圖均為500次掃描平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用TopPIC軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行去卷積處理[26]，得到每個質(zhì)譜峰的單同位素質(zhì)量以及絕對強(qiáng)度；去卷積數(shù)據(jù)采用Rstudio軟件進(jìn)行處理，首先對碎片離子進(jìn)行質(zhì)量校正，隨后以5×10-6的質(zhì)量偏差進(jìn)行匹配，并計算每個氨基酸位點(diǎn)的碎片產(chǎn)率。采用data.table和ggplot對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理，pymol 2.5.0軟件繪制蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)(PDB:1v9i)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同質(zhì)譜解離模式表征蛋白質(zhì)序列

在非變性電噴霧條件下，CA離子在質(zhì)譜中的價態(tài)(Z)集中分布于Z9～Z11，其中以Z10為主，顯著區(qū)別于變性條件電噴霧中的價態(tài)分布(Z15～Z39)，示于圖1a。這一結(jié)果表明，nMS分析中蛋白質(zhì)仍然能保持較緊湊的高級結(jié)構(gòu)及非共價相互作用，而在變性條件下結(jié)構(gòu)去折疊展開，帶電荷數(shù)目顯著增加。本實(shí)驗(yàn)首先對比了HCD和UVPD對非變性CA強(qiáng)度最高的Z10離子的解離情況。從母離子解離效率上看，HCD可以實(shí)現(xiàn)對大部分母離子的解離，而UVPD僅對部分吸收紫外光子的母離子發(fā)生激發(fā)解離。雖然UVPD產(chǎn)生的碎片離子信號強(qiáng)度較低，但碎片離子類型和數(shù)量顯著多于HCD，示于圖1b。碎片離子匹配結(jié)果顯示，HCD僅產(chǎn)生b、y類型碎片離子，且解離位點(diǎn)主要分布于CA的C端，中間區(qū)域解離較少，僅能在天冬氨酸(D)殘基C端發(fā)生解離，示于圖1c，這表明非變性蛋白質(zhì)離子的內(nèi)部缺乏可移動的質(zhì)子，HCD只能依賴于Charge-remote途徑進(jìn)行位點(diǎn)特異性解離[27]。而UVPD產(chǎn)生a、b、c、x、y、z等不同類型碎片離子，離子總數(shù)是HCD的2.4倍，示于圖1d。在解離位點(diǎn)分布上，UVPD可對大部分CA骨架區(qū)域進(jìn)行高效解離，在CA的N端同樣表現(xiàn)出高解離效率。CA的C端主要由結(jié)構(gòu)較松散的Loop組成，而N端存在Helix和Sheet緊湊結(jié)構(gòu)。HCD可以解離較松散的C端，但對于結(jié)構(gòu)緊湊的N端解離較困難，總體解離序列覆蓋率僅為36.8%。UVPD是對蛋白質(zhì)骨架直接產(chǎn)生激發(fā)，5 ns內(nèi)高能光子的快速激發(fā)可避免蛋白結(jié)構(gòu)去折疊而導(dǎo)致能量耗散，直接引發(fā)骨架肽鍵解離而產(chǎn)生豐富的碎片離子，解離位點(diǎn)序列覆蓋率達(dá)到77.9%，是HCD的2.1倍。以上結(jié)果表明，193 nm UVPD在表征保持高級結(jié)構(gòu)特征的蛋白質(zhì)方面相比于常規(guī)HCD具有明顯優(yōu)勢。

2.2 UVPD-MS表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

采用193 nm UVPD-MS分析非變性電噴霧中產(chǎn)生的帶有不同電荷的CA離子，Z9、Z10、Z11價態(tài)CA離子的UVPD解離序列覆蓋率分別為49.2%、77.9%、79.8%，示于圖2a。通過對不同電荷CA的位點(diǎn)光解離效率進(jìn)行歸一化對比分析發(fā)現(xiàn)，3個價態(tài)下高效解離位點(diǎn)分布區(qū)域類似，表明非變性條件下不同電荷CA離子的高級結(jié)構(gòu)和UVPD解離總體上具有相似性，示于圖2b。解離效率發(fā)生顯著變化的位點(diǎn)主要位于CA序列中間區(qū)域(Phe65-Leu155)，隨著電荷數(shù)目增加，中間區(qū)域位點(diǎn)逐漸發(fā)生解離。

193 nm UVPD對蛋白質(zhì)不同二級結(jié)構(gòu)區(qū)域具有較高的解離選擇性，解離位點(diǎn)更偏向于結(jié)構(gòu)相對松散的柔性區(qū)域，而局部吸光截面積較小、受更多氫鍵和鹽橋束縛的剛性緊湊區(qū)域較難解離[4]。從晶體結(jié)構(gòu)上看，CA分子中包含大量的Loop、部分Helix及Sheet區(qū)域，活性結(jié)構(gòu)中還結(jié)合1個Zn2+。通過分析CA Z11離子解離位點(diǎn)分布，可以看出UVPD能夠高效解離CA大部分序列結(jié)構(gòu)中的氨基酸位點(diǎn)，覆蓋包括Turn、Loop以及Helix區(qū)域的幾乎所有位點(diǎn)；但在綠圈標(biāo)注的結(jié)構(gòu)區(qū)域解離較困難，特別是Ile116-Asn125，該區(qū)域位于CA結(jié)構(gòu)中心，靠近Zn2+結(jié)合口袋，示于圖2c。雖然193 nm UVPD比常規(guī)HCD具有更高的解離位點(diǎn)覆蓋率，但對結(jié)構(gòu)中心具有較多非共價相互作用的剛性緊湊區(qū)域的解離效率較低。相對而言，位于蛋白質(zhì)外周的Loop等區(qū)域的氫鍵和鹽橋等非共價相互作用束縛較少，更容易激發(fā)解離并釋放碎片離子。從以上結(jié)果可以看出，電荷數(shù)目的增加有利于提高蛋白質(zhì)解離位點(diǎn)覆蓋率，但是存在電荷引起局部結(jié)構(gòu)變化的風(fēng)險。在保持蛋白質(zhì)主要高級結(jié)構(gòu)特征的前提下，增加蛋白質(zhì)的電荷數(shù)目可能是提高UVPD解離覆蓋率的有效策略。

圖1 非變性和變性電噴霧條件下CA 一級質(zhì)譜圖(a)，CA Z10 離子的HCD、UVPD二級質(zhì)譜圖(b)，解離序列匹配結(jié)果(c)及碎片離子種類分布(d)Fig.1 MS spectra of CA under native and denatured electrospray conditions (a), MS2 spectra by using HCD and UVPD (b), sequence matching results (c), and distribution of fragments in different ion types (d) of CA Z10

圖2 CA Z9-Z11價態(tài)UVPD解離序列匹配結(jié)果(a)，CA位點(diǎn)UVPD歸一化解離效率(b)， 以及CA Z11離子UVPD覆蓋結(jié)構(gòu)區(qū)域(晶體結(jié)構(gòu)：PDB 1v9i)(c)Fig.2 Sequence matching results of CA Z9-Z11 (a), the normalized UVPD fragmentation yields (FYs) of different residues of CA (b), and the UVPD characterized CA Z11 sequence in crystal structure (PDB 1v9i) (c)

2.3 超電荷試劑對CA價態(tài)和UVPD的影響

向CA樣品中加入0.25%環(huán)丁砜后，在相同非變性電噴霧條件下，CA離子電荷數(shù)目顯著增加，但仍相對集中分布于Z9～Z15范圍，其中以Z11和Z12為主；去卷積所得平均電荷數(shù)目由10.1增加至11.6。從去卷積分子質(zhì)量可以看出，加入環(huán)丁砜后，Zn2+非共價結(jié)合仍穩(wěn)定存在，顯著區(qū)別于變性電噴霧條件下CA的質(zhì)譜結(jié)果，示于圖3。表明環(huán)丁砜的加入并沒有導(dǎo)致CA結(jié)合Zn2+離子的丟失，推測Zn2+離子結(jié)合區(qū)域高級結(jié)構(gòu)及非共價相互作用未受明顯影響。本實(shí)驗(yàn)對加入環(huán)丁砜后CA Z10-Z15價態(tài)離子進(jìn)行UVPD和碎片序列匹配，發(fā)現(xiàn)CA Z11和Z12價態(tài)解離位點(diǎn)覆蓋率可分別提升至87.2%和83.3%，其余價態(tài)CA覆蓋率均大于70%，示于圖4a。與未添加環(huán)丁砜前的CA Z11離子解離相比，解離位點(diǎn)覆蓋率提升了7.4%。增加的位點(diǎn)主要在綠色圈中的2個Helix及靠近Zn2+結(jié)合口袋的Sheet區(qū)域，示于圖4c。隨著CA離子價態(tài)持續(xù)上升至Z13～Z15，解離位點(diǎn)覆蓋率保持在約78%，并未隨電荷數(shù)增加而繼續(xù)上升，這可能是由于在較高價態(tài)時產(chǎn)生的碎片離子在譜圖中較集中，數(shù)據(jù)去卷積存在偏差[28]。

進(jìn)一步對Z10～Z15價態(tài)CA位點(diǎn)的UVPD效率進(jìn)行歸一化和對比分析，與未添加環(huán)丁砜時所得結(jié)果類似(圖2b)，不同價態(tài)CA的UVPD解離具有較高的序列和結(jié)構(gòu)選擇性，示于圖4b。隨著環(huán)丁砜的加入引起CA價態(tài)的上升，蛋白N端的UVPD解離效率逐漸提高，而C端解離效率逐漸降低，難以解離區(qū)域也有向C端偏移的趨勢。這可能是由于價態(tài)升高后，質(zhì)子數(shù)量、位置以及局部結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的變化，從而導(dǎo)致解離位點(diǎn)效率的改變。CA Z11價態(tài)UVPD解離位點(diǎn)在晶體結(jié)構(gòu)上的分布情況示于圖4c，發(fā)現(xiàn)加入環(huán)丁砜后，CA中有更多結(jié)構(gòu)區(qū)域可以發(fā)生UVPD解離。與未加入環(huán)丁砜時相比，圖4c中綠圈內(nèi)的難解離Sheet區(qū)域的多個位點(diǎn)(包括Lys170、Ser166、Leu121)均可發(fā)生解離，其中Leu121靠近Zn2+

圖3 不同電噴霧條件和添加環(huán)丁砜后，CA質(zhì)譜圖及去卷積后分子質(zhì)量Fig.3 MS spectra and deconvolution results of CA under different electrospray conditions with the addition of sulfolane

圖4 加入環(huán)丁砜后CA Z10～Z15價態(tài)的UVPD序列匹配結(jié)果(a), 位點(diǎn)歸一化解離效率(b), CA Z11的UVPD解離位點(diǎn)覆蓋結(jié)構(gòu)區(qū)域(晶體結(jié)構(gòu)：PDB 1v9i)(c)Fig.4 UVPD sequence matching results of CA Z10-Z15 charge states after the addition of sulfolane (a), normalized UVPD FYs of different residues of CA Z10～Z15 (b), UVPD characterized CA Z11 sequences in crystal structure (PDB 1v9i) (c)

結(jié)合口袋剛性區(qū)域。以上結(jié)果表明，超電荷試劑的加入可以提高蛋白質(zhì)UVPD解離位點(diǎn)覆蓋率，增加對難解離緊湊區(qū)域的解離效率，但是電荷的持續(xù)增加會對解離的序列和結(jié)構(gòu)選擇性產(chǎn)生一定的影響。

2.4 超電荷試劑對CA結(jié)構(gòu)的影響

超電荷試劑的加入可以提高非變性質(zhì)譜分析中蛋白質(zhì)的電荷數(shù)，提高UVPD解離位點(diǎn)覆蓋率，特別是對相對緊湊區(qū)域的解離效率，同時，更多的電荷有利于檢測更大分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物。但是，超電荷試劑對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響風(fēng)險還需深入分析與評估。

圖5 加入環(huán)丁砜前后Z10和Z11價態(tài)CA位點(diǎn)的歸一化UVPD解離效率Fig.5 Normalized UVPD dissociation efficiency of Z10 and Z11 charge states of CA site before and after sulfolane addition

加入環(huán)丁砜后，CA的nMS譜圖與完全變性狀態(tài)的CA譜圖顯著不同，示于圖3。CA仍表現(xiàn)出Z9～Z15相對集中的價態(tài)分布，電荷數(shù)目也顯著區(qū)別于變性狀態(tài)，且非共價結(jié)合的Zn2+仍穩(wěn)定存在，表明CA仍具有有序的高級結(jié)構(gòu)。為進(jìn)一步探究超電荷試劑對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，對比分析環(huán)丁砜加入前后Z10和Z11價態(tài)CA的位點(diǎn)UVPD解離效率，結(jié)果示于圖5。在相同電荷下，環(huán)丁砜的加入對絕大多數(shù)分布位點(diǎn)的解離效率影響不大，表明0.25%的超電荷試劑并不會對大部分位點(diǎn)的局部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響。雖然加入環(huán)丁砜后Z11 CA的UVPD解離位點(diǎn)覆蓋率提升了7.4%，但并未干擾其他位點(diǎn)局部結(jié)構(gòu)。對于Z12～Z15等更高價態(tài)的CA離子，存在電荷增加引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)局部變動的風(fēng)險。

3 結(jié)論

本文采用UVPD-MS系統(tǒng)研究了0.25%的超電荷試劑對蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)表征的影響。結(jié)果表明，超電荷試劑環(huán)丁砜的加入可以有效提升非變性電噴霧條件下產(chǎn)生的蛋白質(zhì)離子價態(tài)，拓展了質(zhì)譜檢測的質(zhì)量范圍，有利于分析大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)及其復(fù)合物。加入環(huán)丁砜后，蛋白質(zhì)仍然保持有序的高級結(jié)構(gòu)，在nMS分析中仍保持相對集中的電荷分布，金屬離子等非共價結(jié)合也能穩(wěn)定存在。進(jìn)一步的UVPD位點(diǎn)解離分析表明，超電荷試劑有助于對難解離結(jié)構(gòu)緊湊區(qū)域的解離和表征，但是引入的更高價態(tài)存在蛋白質(zhì)局部結(jié)構(gòu)變化的風(fēng)險，在nMS分析中應(yīng)謹(jǐn)慎使用。綜上所述，本研究認(rèn)為超電荷試劑是一種在nMS結(jié)構(gòu)分析中調(diào)控蛋白質(zhì)價態(tài)和進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)表征的有效策略，具有廣泛的應(yīng)用前景。

致謝：感謝大連相干光源技術(shù)團(tuán)隊(duì)在儀器搭建和運(yùn)行中的技術(shù)支持。