羅宇翔，黃 靜，李惠琳

(中山大學藥學院，廣東 廣州 510006)

2019年年底暴發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19，簡稱新冠)疫情給人類生命健康和社會發(fā)展帶來了巨大的沖擊和挑戰(zhàn)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的數(shù)據(jù)，截至2022年3月5日，新冠肺炎全球感染累計病例突破4.4億例，死亡病例突破597萬例[1]。新冠肺炎由SARS-CoV-2病毒感染引起，伴隨咳嗽、發(fā)燒、肌肉疼痛、嗅覺味覺減退等癥狀，嚴重者可致死亡[2]。SARS-CoV-2病毒主要由刺突蛋白(S蛋白)、核衣殼蛋白(N蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)和RNA核酸鏈構成[3]，其中，表面的S蛋白在病毒入侵宿主過程中起關鍵作用，介導病毒與宿主細胞的識別以及膜融合過程[4-6]。SARS-CoV-2在入侵機體時，S蛋白與宿主細胞膜表面的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)的結合是觸發(fā)膜融合的關鍵步驟。S蛋白分為S1和S2兩個結構域，其中，S1的受體結合區(qū)域(RBD)與ACE2直接結合[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，干擾RBD和ACE2的結合對阻止病毒入侵有一定功效，以該過程為靶點是藥物研發(fā)的一個思路[9-10]，例如我國自主研發(fā)并上市的安巴韋單抗/羅米司韋單抗[11]。

糖基化修飾是一類常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾(PTMs)，可以影響蛋白質(zhì)結構穩(wěn)定性、增加蛋白溶解性，還可以參與蛋白-蛋白間的相互作用[12]。病毒包膜上的糖蛋白具有調(diào)節(jié)病毒指向性、穩(wěn)定蛋白及免疫逃逸的作用[13]。因此，考察糖基化的作用可為理解病毒入侵機制、揭示病毒致病機理以及為疾病治療和藥物設計提供思路[14]。SARS-CoV-2的S蛋白上有22個N-糖基化位點以及多個可能的O-糖基化位點，RBD中有4個糖基化位點，其中，N331、N343位點的糖修飾類型為N-糖基化，T323、S325位點為O-糖基化[13, 15-16]。目前普遍認為[17-18]，S蛋白中眾多的糖基化修飾會影響S蛋白的折疊以及疫苗的免疫原性和免疫優(yōu)勢，介導免疫逃逸。由此可見，S蛋白中的糖基化不僅蘊含翻譯后修飾信息，而且在蛋白結構和功能上也發(fā)揮重要作用。但S蛋白和ACE2蛋白上的糖基化修飾對二者結合穩(wěn)定性以及結構的影響尚不明確。

結構質(zhì)譜(structural MS)在近十年來得到快速發(fā)展，因其具有高靈敏度、低樣品消耗量、高通量等優(yōu)勢，已成為蛋白質(zhì)結構分析中廣泛應用的方法之一[19-21]。其中，非變性質(zhì)譜(native MS)是常用的結構質(zhì)譜分析方法，可以在氣相中保留蛋白樣品中的非共價相互作用，提供結合化學計量比、復合物結構動態(tài)性及穩(wěn)定性、亞基空間排列等信息，被廣泛應用于蛋白-配體、蛋白-蛋白復合物以及多蛋白復合物的結構分析中[22-24]。

本研究擬采用native MS方法研究RBD、ACE2及二者形成的復合物。首先對PNGase F切除RBD上N-糖的條件進行優(yōu)化，并用native MS/MS分析切N-糖后的RBD異質(zhì)性。隨后，將切糖前后的RBD與ACE2進行結合實驗，以揭示RBD中N-糖基化修飾對RBD-ACE2復合物穩(wěn)定性的影響，旨為糖蛋白復合物的后續(xù)結構研究提供見解。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Synapt G2-Si三重四極桿飛行時間質(zhì)譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品，配有納電噴霧離子源(nano-ESI)；P-97微電極拉制儀：美國Sutter公司產(chǎn)品；Centrisart A-14C小型臺式冷凍離心機：德國Sartorius公司產(chǎn)品；Nanodrop 2000超微量分光光度計：美國Thermo公司產(chǎn)品；JXH-100恒溫加熱混勻儀：上海凈信有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

Amicon Ultra-0.5超濾離心管：美國Sigma公司產(chǎn)品；BF100-58-10硼硅酸毛細管：美國Sutter公司產(chǎn)品。

Spike-RBD蛋白(片段319-532)、ACE2蛋白(片段18-740)：上海愷佧有限公司產(chǎn)品；PNGase F酶及配套反應緩沖液：美國New England Biolabs公司產(chǎn)品；乙酸銨(痕量金屬級)：美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 實驗條件

1.3.1切N-糖 PNGase F酶的原始狀態(tài)為溶液，母液濃度為500 000 units/mL，用15 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)緩沖液將其稀釋至25 000或50 000 units/mL。用15 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液溶解RBD凍干粉至濃度為15 μmol/L。隨后加入1 μL 25 000或50 000 units/mL PNGase F酶，體系中酶的終濃度為2 500或5 000 units/mL，于37 ℃恒溫加熱混勻儀中反應4、8、14 h。實驗過程中未添加任何變性劑。

1.3.2蛋白孵育 將未切糖和切糖后的RBD和ACE2按1.5∶1(物質(zhì)的量比)的比例，于37 ℃孵育2 h，對孵育后的樣品除鹽。

1.3.3蛋白樣品除鹽 將未切糖和切糖后的RBD分別加入10 ku超濾離心管，ACE2加入50 ku超濾離心管，于4 ℃下用500 mmol/L乙酸銨溶液離心超濾1次后，用100 mmol/L乙酸銨溶液離心超濾2次，收集截留液。將孵育后的蛋白復合物樣品溶液加入10 ku超濾離心管，于4 ℃下用100 mmol/L乙酸銨超濾3次，收集截留液。使用Nanodrop 2000 Protein A280法定量分析截留液中的蛋白濃度。

1.3.4Native MS條件 將制備好的樣品加入拉制好的毛細管噴針中，置于質(zhì)譜儀nano-ESI離子源處。質(zhì)譜參數(shù)如下：毛細管電壓 0.9～1.3 kV，采樣錐(sampling cone)電壓40/140 V，源補償(source offset)電壓80 V，錐孔氣體流速(cone gas flow)0 L/h，納流氣壓(nanoflow gas pressure)0 Pa，清洗氣體流速(purge gas flow)800 mL/h，脫溶劑化氣體流速(desolvation gas flow)800.0 L/h。串聯(lián)質(zhì)譜條件：選擇離子m/z3 101.0，捕獲池碰撞能量(trap collision energy)80 V。

2 結果與討論

2.1 RBD、ACE2及其復合物的native MS檢測

注：藍色框表示RBD單體峰；黃色框表示ACE2單體峰；紅色框表示ACE2二聚體峰；綠色框表示ACE2與RBD形成的蛋白復合物峰圖1 RBD(a)、ACE2(b)、RBD-ACE2復合物(c)樣品的native MS譜圖Fig.1 Native mass spectra of RBD (a), ACE2 (b), RBD-ACE2 complex (c) samples

首先分別對RBD和ACE2樣品進行native MS檢測。RBD的native MS譜圖(圖1a)顯示，RBD以單體形式存在，主要電荷態(tài)為9+、10+、11+，但譜峰較寬，表明樣品存在高度異質(zhì)性。根據(jù)文獻[25]報道，RBD上的糖基化位點N331和N343的N-糖鏈主要為復雜型；N331主要的糖鏈分支為四天線型，同時存在少量的三天線型；N343主要的糖鏈分支包括雙天線、三天線和四天線型；2個位點主要的單糖分子包括唾液酸(NeuAc)、半乳糖(Gal)和巖藻糖(Fuc)；T323、S325中的O-糖鏈結構包括HexNAc(1)(N-乙酰己糖胺)、HexNAc(1)Hex(1)(己糖)和HexNAc(1)Hex(1)NeuAc(2)等，主要單糖分子包括Gal、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、NeuAc及N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)[15-16]。復雜多樣的N-糖及O-糖修飾是導致RBD譜峰較寬的主要原因。RBD中N-糖的存在可能起到抗原屏蔽效應，且與受體ACE2的結合相關，而O-糖主要與ACE2的結合有關[16,26-27]。Yang等[28]報道的RBD樣品(片段319～541)譜圖也出現(xiàn)了因糖基化修飾、異質(zhì)性較強導致的峰展寬現(xiàn)象，且主要電荷態(tài)為9+、10+，10+電荷態(tài)質(zhì)心位置為m/z3 256，與本研究結果m/z3 240接近。不同的是，文獻[29]中RBD出現(xiàn)了二聚體信號。根據(jù)文獻[29-33]報道，樣品濃度過高、表達體系或離子傳輸參數(shù)以及檢測參數(shù)的差異均可能導致產(chǎn)生蛋白寡聚體信號。

ACE2中存在6個N-糖基化位點(N53、N90、N103、N322、N432和N546)，主要糖鏈為復雜型，同時含有少量的高甘露糖型和雜合型[18, 34]，其native MS譜圖示于圖1b。眾多糖基化位點及多樣、復雜的糖型是導致ACE2譜峰展寬、電荷態(tài)無法分辨的主要原因。ACE2的主要譜峰質(zhì)心約在m/z7 500處，推測其為ACE2二聚體信號，m/z5 500處出現(xiàn)的少量蛋白信號為ACE2單體。在文獻[29]報道中，ACE2的native MS譜圖主要以二聚體形式存在，也存在少量的單體，尚可實現(xiàn)電荷態(tài)分辨，二聚體質(zhì)心位于約m/z7 000處，單體質(zhì)心位于m/z5 200處。這可能是由于不同表達體系引入的糖基化程度不同[25]，在質(zhì)量和異質(zhì)性上出現(xiàn)差異。

ACE2和RBD的解離平衡常數(shù)(Kd)達4.7 nmol/L，表明RBD與ACE2結合能力較強[35]。本研究對孵育后的RBD-ACE2復合物進行檢測，結果示于圖1c?？梢?，譜峰仍較寬，糖基化修飾帶來的高度異質(zhì)性以及電噴霧過程中鹽和溶劑的加和是造成譜峰展寬、電荷態(tài)難以分辨的根本原因，但相比于圖1b中ACE2二聚體峰，質(zhì)量中心發(fā)生了明顯位移(約700 u)，表明形成了RBD-ACE2復合物。通過與文獻[28]對照，可以推斷本實驗中1分子ACE2二聚體與2分子RBD形成了復合物(RBD-ACE2)2，這一結合化學計量比與冷凍電鏡(cryo-EM)數(shù)據(jù)吻合[36]。為進一步確證化學計量比，可以利用Igor課題組開發(fā)的charge reduction法，即通過選擇母離子并利用電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)所產(chǎn)生的電荷還原效應，實現(xiàn)高度異質(zhì)性蛋白的電荷分辨[28, 37-38]。此外，Exactive Plus EMR和Q Exactive-UHMR(美國Thermo公司產(chǎn)品)等基于Orbitrap質(zhì)量分析器的儀器具有較強的脫溶劑化效率，可以在很大程度上減小鹽和溶劑加和，提高高度異質(zhì)性蛋白的電荷態(tài)分辨能力[39]。

2.2 RBD切N-糖條件的優(yōu)化

注：a.加入終濃度2 500 units/mL PNGase F于37 ℃孵育4 h；b.加入終濃度2 500 units/mL PNGase F于37 ℃孵育8 h；c.加入終濃度2 500 units/mL PNGase F于37 ℃孵育14 h；d.加入終濃度5 000 units/mL PNGase F于37 ℃孵育14 h圖2 不同條件切糖后的RBD native MS譜圖Fig.2 Native mass spectra of removing N-glycans in RBD under different conditions

本研究對RBD切糖條件進行優(yōu)化。當添加反應終濃度2 500 units/mL PNGase F于37 ℃孵育4 h時，譜圖中出現(xiàn)了切N-糖后產(chǎn)生的蛋白峰，但同時存在一定量未完全切N-糖的RBD蛋白，示于圖2a。增加孵育時間至8、14 h，未完全切N-糖的RBD信號逐漸降低，示于圖2b、2c。提高PNGase F的反應終濃度至5 000 units/mL，于37 ℃酶切14 h，此時切N-糖較徹底，完全切N-糖的蛋白峰較窄，譜圖中未充分切N-糖的RBD豐度極低，示于圖2d。因此，選擇反應終濃度5 000 units/mL的PNGase F 于37 ℃孵育14 h作為最優(yōu)的RBD切N-糖條件。

此外，發(fā)現(xiàn)切糖前RBD的主要電荷態(tài)為10+，切糖后為9+。造成電荷態(tài)位移的因素很多，如糖結構中的羥基或羧基可以與帶正電荷基團(如K，R)發(fā)生靜電相互作用，糖的切除可以暴露K/R側(cè)鏈氨基導致電荷增加[40]；切糖也可能導致蛋白結構溶劑可及性的一定程度變化，從而造成電荷態(tài)的增加或減少。

2.3 切N-糖后RBD異質(zhì)性分析

在完全切糖的RBD中，除了主要蛋白類型外，還存在一些信號強度較低、伴隨在主峰后的小峰，推測這類蛋白峰是由于RBD中存在O-糖基化帶來的蛋白異質(zhì)體。如與主峰差異365 u的異質(zhì)體，示于圖3a，根據(jù)質(zhì)量位移和Unimod數(shù)據(jù)庫檢索，推測該異質(zhì)體在主要蛋白類型基礎上加和了Hex(1)HexNAc(1)。該糖鏈在文獻[15-16]中有過報道，并提示具體組成可能為GalNAcGal或GlcNAcGal。此外，通過碰撞誘導解離(CID)對主峰(m/z3 101)進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，示于圖3b。當CID能量為80 eV時，低質(zhì)荷比處出現(xiàn)了2個裂解產(chǎn)物，裂解產(chǎn)物之間相差1分子唾液酸(NeuAc，291 u)，表明切N-糖后RBD主峰中存在2分子NeuAc，與文獻[15-16]報道呼應?？梢园l(fā)現(xiàn)，該RBD樣品中的O-糖修飾至少包含了NeuAc(2)、GalNAc(1)Gal(1)NeuAc(2)或GlcNAc(1)Gal(1)NeuAc(2)。此外，不同表達體系、蛋白四級結構、檢測方法、檢測儀器得到的O-糖修飾信息，其豐度和種類存在一定差異[15-16, 41]。本研究檢測基于哺乳動物細胞體系表達的重組RBD的O-糖類型，可為RBD的O-糖修飾提供參考。

研究表明[13,41]，S蛋白中N-糖與O-糖的出現(xiàn)頻率可能存在一定的關聯(lián)，S蛋白上的糖基化存在“O跟隨N(O-Follow-N)”規(guī)律，即O-糖修飾有一定概率出現(xiàn)在N-糖修飾之后。這一現(xiàn)象產(chǎn)生的原因可能與GalNAc-轉(zhuǎn)移酶識別N-糖位點并在附近催化O-糖加和有關?；诖?，需留意糖蛋白中N殘基后的S/T殘基，其可能成為潛在的O-糖基化位點。

2.4 切N-糖前后RBD-ACE2復合物穩(wěn)定性評估

將切糖前后的RBD(下文分別用“RBD”、“RBDdeglyco”表示)與ACE2孵育并進行native MS分析，比較2組復合物的差異。結果發(fā)現(xiàn)，RBD和RBDdeglyco均能與ACE2二聚體形成復合物，示于圖4a和4c。通過提高離子源采樣錐(SC)能量至140 V，使蛋白復合物在離子源內(nèi)發(fā)生裂解。發(fā)現(xiàn)RBD與ACE2復合物組中RBD豐度上升，且出現(xiàn)少量的ACE2單體信號，表明部分(RBD-ACE2)2復合物發(fā)生解離，示于圖4b。相比于圖4a，該譜圖中的復合物峰向低質(zhì)荷比位置發(fā)生了位移，推測這是由于SC電壓提高而產(chǎn)生的除加合物效應。在RBDdeglyco與ACE2復合物組中，RBDdeglyco和ACE2單體的豐度上升較多，而(RBDdeglyco-ACE2)2復合物的豐度下降明顯，其峰幾乎消失，示于圖4d。表明相同碰撞能量下，(RBDdeglyco-ACE2)2復合物的相互作用力更弱，容易發(fā)生碎裂。由此可以看出，RBD中的N-糖對于維持復合物穩(wěn)定性具有重要作用。

注：紅色五角星表示主要蛋白類型峰；綠色正方形表示加和1分子己糖和1分子N-乙酰己糖胺的蛋白類型圖3 切糖后的RBD native MS譜圖(a)及RBD(9+電荷態(tài))(m/z 3 101)的串聯(lián)質(zhì)譜圖(b)Fig.3 Native MS spectrum deglycosylated RBD (a) and MS/MS spectrum of 9+ charge state of deglycosylated RBD (m/z 3 101) (b)

注：a,c.SC=40 V；b,d.SC=140 V；藍色框表示RBD峰；紅色框表示(RBD-ACE2)2復合物峰；黃色框表RBDdeglyco峰；綠色框表示(RBDdeglyco-ACE2)2復合物峰；ACE2mono表示ACE2單體圖4 切糖前(a,b)、后(c,d)，RBD與ACE2形成復合物的native MS譜圖Fig.4 Native mass spectra of the complex formed by glycosylated (a,b)/deglycosylated (c,d) RBD with ACE2

有研究[42]表明，S蛋白中的糖基化位點區(qū)域高度保守，如RBD的S325、N331和N343位點。多個突變實驗[42-43]表明，將RBD上的N-糖基化位點N331和N343突變后，病毒的感染能力降低，表明這些位點在病毒入侵時發(fā)揮著重要作用。此外，一系列分子動力學(MD)模擬實驗[18, 27]表明，S蛋白的部分N-糖(N74、N165)與ACE2的N-糖直接作用，部分N-糖(N165、N234)具有調(diào)控RBD構象轉(zhuǎn)變的作用，同時N343上的糖基化也與RBD和ACE2的結合密切相關。因此，當切除RBD的N-糖后，RBD-ACE2復合物穩(wěn)定性降低。這一結果表明，在進行RBD結構和功能分析(尤其是與ACE2結合相關的實驗)時，不建議切除RBD的糖基化修飾。

糖基化修飾除了在維持蛋白及蛋白復合物結構方面的作用，在SARS-CoV-2的免疫逃逸方面也發(fā)揮著重要作用。有研究[44]表明，S蛋白通過構象變化來改變糖基化屏蔽區(qū)域，從而掩蓋表位信息。如N165和N234對RBD構象的調(diào)整作用可以改變聚糖對S蛋白的屏蔽表面積，同時RBD上的N331、N343始終對該位點起到保護作用，從而實現(xiàn)免疫逃逸[27]。

此外，本研究嘗試對ACE2上的N-糖進行同樣的去糖基化處理，但結果表明，ACE2上的糖不能被有效去除。其原因可能為ACE2二聚體上的糖比RBD多，且在非變性狀態(tài)下ACE2的高階結構較RBD復雜，干擾了糖鏈與PNGase F的相互作用，使其無法有效發(fā)揮去糖功能。據(jù)文獻[18,45-47]報道，ACE2中的糖同樣參與S蛋白的結合過程，ACE2中N90上的糖干擾了ACE2與S蛋白的結合，將其移除后，ACE2與S蛋白的親和力增強，而N322和N546上的糖可分別與S蛋白的殘基和糖發(fā)生作用。

3 結論

采用非變性質(zhì)譜對RBD和ACE2樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)RBD和ACE2的糖基化均會對檢測結果產(chǎn)生影響，且二者譜峰較寬。通過優(yōu)化切糖條件，最終選擇反應終濃度5 000 units/mL的PNGase F 于37 ℃孵育14 h作為最優(yōu)的切N-糖條件。切除N-糖后，RBD的結構和功能發(fā)生改變，導致其與ACE2結合產(chǎn)生的復合物穩(wěn)定性降低。上述結果表明，RBD上的糖基化修飾在支撐RBD結構中起到重要作用，且參與RBD與ACE2形成復合物的過程，并影響RBD-ACE2復合物的穩(wěn)定性，在病毒入侵過程中扮演著重要角色。

除了native MS外，結構質(zhì)譜法還包括氫氘交換質(zhì)譜法[48]、native top-down法[25,49]、交聯(lián)質(zhì)譜法[50]以及共價標記質(zhì)譜法[51]等，這些方法與主流結構生物學手段(X-射線晶體學、核磁共振波譜法及冷凍電鏡法)形成了良好的互補與印證。面對具有挑戰(zhàn)性的糖蛋白分析，通過整合多種結構生物學方法對蛋白質(zhì)結構進行分析，可為蛋白質(zhì)等生物大分子的結構解析提供更精細、更準確、多維度、多層次的信息和視野。