慕廣 張文豪 黃晶晶 陳志鵬 王俊

已有的研究[1]發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅取決于腫瘤細胞本身，還與腫瘤細胞所處的環(huán)境即腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, TME）密切相關(guān)。TME主要由血管、腫瘤相關(guān)成纖維細胞（cancer‐associated fibroblasts, CAFs）、細胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）和浸潤性免疫細胞組成[2]。其中，CAFs是一類異質(zhì)群體，是腫瘤細胞外最主要的基質(zhì)成分，可以分泌多種細胞因子對腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展進行調(diào)控[3]。微環(huán)境中的免疫細胞主要包括腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes, TILs）、腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor‐associated macrophages, TAM）、樹突狀細胞（dendritic cells, DCs）、骨髓來源的抑制性細胞（myeloid‐derived suppressor cells, MDSCs）和自然殺傷細胞（natural killer cell, NK）等，它們對于腫瘤的生物學行為同樣有著重要的調(diào)控作用。本文主要總結(jié)了近年來關(guān)于CAFs對于微環(huán)境中免疫細胞的調(diào)節(jié)作用的研究成果，強調(diào)了它們在腫瘤進展和免疫逃逸中的協(xié)同作用，以期發(fā)現(xiàn)影響腫瘤進展的新型分子靶點和通路。

1 CAFs的起源和異質(zhì)性

成纖維細胞是間質(zhì)中最豐富的細胞類型之一[4]。我們把TME中被激活的成纖維細胞稱之為CAFs[5]。盡管對于CAFs已經(jīng)有大量的研究，但是有關(guān)其起源的多重性，目前仍在討論中。組織駐留成纖維細胞是CAFs的主要來源之一[6,7]。腫瘤細胞分泌的轉(zhuǎn)化生長因子‐β（transforming growth factor‐β, TGF‐β）、血小板來源的生長因子（platelet derived growth factor, PDGF）和成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor 2, FGF‐2）、基質(zhì)衍生因子‐1（stromal cell‐derived factor 1, SDF‐1）等可以激活組織成纖維細胞[8‐10]。當然，由于腫瘤種類的不同，其分泌的調(diào)控因子也不相同。有研究[11,12]表明，靜止狀態(tài)的胰腺星狀細胞（pancreatic stellate cells, PSCs）和肝星狀細胞（hepatic stellate cells, HSCs）在TGF‐β和PDGF的激活下表達α‐平滑肌肌動蛋白（alpha smooth muscle actin, α‐SMA），α‐SMA反作用于PSCs和HSCs，將其激活為CAFs。另外，胰島素樣生長因子1（insulin‐like growth factor 1, IGF‐1）也可以對HSCs有激活作用[13]。CAFs還可以來源于骨髓，有研究[14]表明，骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchystem cells, BM‐MSCs）在TGF‐β1的介導下分化為不同的CAFs亞群。髓源性MSCs分化為CAFs后，可以表達α‐SMA和成纖維細胞活化蛋白（fibroblast activation protein, FAP）[15]。有研究[16]發(fā)現(xiàn)，TGF‐β1可促進增殖的內(nèi)皮細胞表型轉(zhuǎn)化為成纖維細胞樣細胞。TGF‐β1能夠誘導成纖維細胞特異性蛋白1（fibroblast specific protein‐1, FSP1）和SMA等間充質(zhì)標志物的表達刺激內(nèi)皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變（endothelial‐mesenchymal transition, EndMT）。此外，也有研究[17‐25]表明，脂肪細胞、上皮細胞、周細胞、平滑肌細胞也可以轉(zhuǎn)化為CAFs。CAFs的多重起源理論在某種程度上解釋了其異質(zhì)性的原因。近年來有學者[26]在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)了兩個對立的CAFs亞型：肌成纖維細胞性CAFs（myofibroblastic CAFs, myCAFs）和炎性CAFs（inflammatory CAFs, iCAFs）。myCAFs位于癌細胞附近，可以大量表達α‐SMA，而iCAFs離腫瘤細胞較遠，表達α‐SMA較少，但分泌較多的白介素（interleukin,IL）‐6和其他炎癥因子［如IL‐8、IL‐11和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor, LIF）］，可能通過刺激STAT3信號通路參與免疫抑制[27]。在三陰型乳腺癌（triple negative breast cancer, TNBC）中，根據(jù)不同的成纖維細胞標志物，將CAFs分為4個亞群（S1‐S4）[28]。激活標志物的差異表達主要包括α‐SMA、FAP、血小板來源的生長因子受體β（platelet‐derived growth factor receptor β, PDGFRβ）、成纖維細胞特異性蛋白‐1（fibroblast specific protein‐1, FSP‐1）、caveolin 1（CAV‐1）和CD29。所有CAF亞型均有較低的CAV‐1水平。CAF‐S1亞群主要表達這6種標志物，其中FAP和α‐SMA高表達；CAF‐S2亞群表達6種標志物的低水平；CAF‐S3亞群α‐SMA和FAP均為陰性，但其余4個標志物均為陽性；CAF‐S4亞群無FAP，但α‐SMA和CD29較高。在定位方面，CAF‐S1和CAF‐S4主要出現(xiàn)在TNBC腫瘤中，人類表皮生長因子受體2（human epidermalgrowth factor receptor‐2, HER2）+ 腫瘤中附加CAF‐S4。CAF‐S3在HER2+和TNBC腫瘤中具有腫瘤旁定位。最后，CAF‐S2既存在于腫瘤區(qū)，也存在于腫瘤旁區(qū)，主要存在于腔內(nèi)A亞型[28]。CAF‐S1亞群刺激Treg細胞的分化、募集和活化，從而促進腫瘤免疫抑制，還可以分泌CXCL12和TGF‐β，促進癌細胞遷移[28,29]。CAF‐S4亞群則通過NOTCH通路促進腫瘤細胞遷移和侵襲[30]。觀察表明，微環(huán)境中可能存在pCAFs（cancer‐promoting CAFs）和rCAFs（cancer‐restraining CAFs）兩種不同的群體[31]。pCAFs主要通過表達FAP‐α或α‐SMA多種途徑抑制抗腫瘤免疫[32,33]，而rCAFs廣泛分布于結(jié)腸癌、膀胱癌、腸癌等各種腫瘤中[34‐36]。有研究[37]發(fā)現(xiàn)，rCAFs可以抑制腫瘤的生長，而Meflin是一種以糖基磷脂酰肌醇為錨定的蛋白，可以作為rCAFs抑制胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）進展的標志。目前，由于缺乏特異性標志物來識別不同的CAFs，這為我們進一步了解CAFs的異質(zhì)性增添了不少困難。

2 CAFs對TILs的調(diào)節(jié)作用

TILs被認為是對特異性免疫應答具有高度反應性的細胞亞群，主要由CD4+T細胞和CD8+T細胞兩大細胞亞群構(gòu)成[38]。CD4+T細胞主要分為Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞和Treg細胞[39]?；罨腡h1細胞釋放IL‐2、干擾素γ（interferon‐γ, IFN‐γ）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor‐α, TNF‐α）等細胞因子，通過介導細胞免疫誘導腫瘤細胞的凋亡；而活化的Th2細胞釋放IL‐4、IL‐5、IL‐10和IL‐13等細胞因子，通過介導體液免疫發(fā)揮促進腫瘤生長的作用[40]。CAFs在被TNF‐α和IL‐1β激活后，分泌胸腺基質(zhì)淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin, TSLP），通過調(diào)節(jié)骨髓狀DCs，促進Th2的極化。在原發(fā)性腫瘤中，使用FAP+CAFs DNA疫苗可以顯著增加IL‐2、IL‐7 Th1細胞因子的表達，同時還可以顯著誘導TME中IL‐4、IL‐6 Th2細胞因子的減少，從而增加細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte, CTL）的殺傷力[41,42]。Treg細胞是一類調(diào)節(jié)性T細胞，可以分泌IL‐4、IL‐10及TGF‐β等細胞因子產(chǎn)生免疫抑制，促進腫瘤的發(fā)展[43]。CAFs在肺癌中表達的環(huán)加氧酶2會導致其分泌前列腺素E2，而前列腺素E2可誘導FOXp3的表達，F(xiàn)OXp3是Treg的重要標記，在Treg細胞功能中發(fā)揮重要作用[44]。有研究[28]表明，CAF‐S1通過分泌CXCL‐12吸引CD4+CD25+T淋巴細胞，并被OX40L、程序性細胞死亡蛋白1配體2（programmed cell death 1 ligand 2, PD‐L2）和JAM2保留。此外，CAF‐S1還可增加T淋巴細胞存活率，并通過B7H3、CD73和DPP4促進其分化為CD25（high）FOXP（high）Treg。有學者[45]發(fā)現(xiàn)CD73+γδTregs是乳腺癌中主要的浸潤性T細胞，并且比CD4+T細胞和CD8+T細胞有著更強大的免疫抑制效應。他們進一步發(fā)現(xiàn)了CAFs分泌IL‐6，并通過IL‐6/STAT3通路誘導CD73+γδTregs分化以及產(chǎn)生更多的腺苷，從而形成了強大的腫瘤免疫抑制功能。接著，他們又證明了CD73+γδTregs可以通過腺苷/A2BR/p38MAPK信號通路反向促進CAFs分泌IL‐6，形成IL‐6‐腺苷正反饋回路。CAFs通過釋放IL‐1β激活核因子κB（nuclear factor κB, NF‐κB）來誘導CCL‐22 mRNA的表達，而FOXp3的表達又和CCL‐22呈正相關(guān)?？梢?，IL‐1β‐CCL22‐CCR4軸會促進細胞轉(zhuǎn)化和Treg浸潤，從而引起腫瘤的免疫抑制[46]。在肺癌微環(huán)境中，大多數(shù)CD8+T細胞經(jīng)活化后轉(zhuǎn)變?yōu)镃TL發(fā)揮腫瘤殺傷作用[47]。有實驗[48]證明，當CAFs數(shù)量較低時，瘤內(nèi)和瘤周均有大量的CD8+TILs存在；當CAFs數(shù)量較多時，盡管瘤周CD8+TIL依然較多，但瘤內(nèi)的數(shù)量顯著減少。與之相反，CAFs較多時，瘤內(nèi)FOXp3+TILs較多。這表明CAFs可能通過調(diào)節(jié)TIL的遷移，實現(xiàn)免疫抑制。進一步研究顯示，CAFs抑制CD8+TIL向瘤內(nèi)浸潤，而促進FOXp3+TIL瘤內(nèi)浸潤。近年來也發(fā)現(xiàn)CAFs參與抗原交叉提呈過程，通過PD‐L2和Fas配體介導的抗原特異、抗原依賴途徑殺傷CD8+T淋巴細胞，從而使腫瘤細胞逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊。有研究[49]發(fā)現(xiàn)，在胰腺導管腺癌中存在一類表達主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex, MHC）II類和CD74的新CAF亞群——apCAFs（antigen‐presenting CAFs），研究證明從原位腫瘤分離的apCAFs具有在共培養(yǎng)的T細胞中顯示出誘導CD25和CD69的能力。CAFs利用腫瘤抗原交叉呈遞和關(guān)鍵免疫檢查點配體的同步上調(diào)，驅(qū)動抗原特異性T細胞死亡和細胞毒性T細胞的功能損傷，使腫瘤細胞逃避免疫攻擊。有學者[50]發(fā)現(xiàn)，CAFs分泌的TNF‐β可以誘導CD8+T細胞表達FOXP3，促進其向CD8+Treg細胞轉(zhuǎn)化。CAFs通過IL‐6調(diào)節(jié)TME中免疫抑制TIL數(shù)量。當IL‐6的產(chǎn)生被阻斷時，可改善已有的腫瘤免疫，提高常規(guī)免疫治療的療效。

3 CAFs對MDSCs的調(diào)節(jié)作用

MDSCs是一種異質(zhì)細胞群，可強烈抑制T細胞和NK細胞的抗腫瘤活性并刺激Treg細胞，導致腫瘤進展[51]。CAFs可通過SDF‐1a/CXCR4途徑趨化單核細胞，并通過IL‐6介導的STAT3激活誘導單核細胞分化為MDSCs。這些MDSCs以STAT3依賴的方式抑制T細胞增殖，改變T細胞的表型和功能，上調(diào)IL‐10，下調(diào)IFN‐γ，誘導Treg分化和T細胞凋亡[52]?；谶@些發(fā)現(xiàn)，未來可以考慮把IL‐6和GM‐CSF作為腫瘤患者MDSC誘導抑制的治療靶點。有研究[53]表明，CAFs與腫瘤細胞共培養(yǎng)時，會上調(diào)CCL7、CXCL1、CXCL2、CXCL8的表達水平，這些趨化因子會進一步促進MDSCs的募集。腫瘤細胞可產(chǎn)生集落刺激因子1（colony‐stimulating factor 1, CSF1），CSF1是一種負調(diào)控趨化因子，通過CAF將PMN‐MDSC募集到腫瘤部位，從而促進免疫抑制[54]。也有學者[55]發(fā)現(xiàn)通過抑制吲哚胺‐2,3‐雙加氧酶1（indoleamine 2,3‐dioxygenase1, IDO1）和NADPH氧化酶NOX2和NOX4，從而減少CAFs誘導的MDSCs中活性氧（reactive oxygen species, ROS）的產(chǎn)生，進而恢復CD8+T細胞的增殖，清除ROS破壞了CAFs‐MDSCs軸，為逆轉(zhuǎn)CAFs介導的免疫抑制微環(huán)境提供了潛在的治療途徑。但是如何有效清除微環(huán)境中過多的ROS以維持氧化還原平衡，改善CD8+T細胞的功能，值得進一步研究。

4 CAFs對TAMs的調(diào)節(jié)作用

TAMs是NSCLC免疫浸潤的重要成分，具有高度可塑性并表現(xiàn)出多種表型，包括M1型（經(jīng)典激活，抗腫瘤活性的促炎性反應）和M2型（非經(jīng)典激活，促血管生成和原始腫瘤活性的免疫抑制）[56]。有研究[57‐59]顯示，CAFs可能通過細胞因子MCP‐1和SDF‐1的介導實現(xiàn)對單核細胞的募集。研究人員分別通過阻斷MCP‐1或SDF‐1受體（CXCR4），抑制MCP‐1或SDF‐1活性，結(jié)果顯示單核細胞的遷移能力降低。研究發(fā)現(xiàn)，雖然SDF‐1和MCP‐1都與CAF和乳腺癌細胞介導的單核細胞招募相關(guān)；SDF‐1似乎在CAFs誘導的單核細胞招募中更為重要，而MCP‐1在乳腺癌細胞介導的單核細胞遷移中更為突出。該研究團隊還證明沒有腫瘤細胞的存在，CAFs也能夠自行誘導PD‐1+ TAM表型，在誘導PD‐1表達方面，CAFs與腫瘤細胞一樣有效[57]。有研究[60]發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞可以分泌IL‐6和GM‐CSF，刺激CAFs激活，而激活的CAFs又可以進一步促進單核細胞向M2分化。當使用IL‐6抗體和GM‐CSF抗體時，可以觀察到腫瘤重量的降低，降低了腫瘤的發(fā)生，這也進一步印證了其觀點。此外，CAFs可誘導IL‐6、IL‐8、TGF‐β、IL‐10等募集單核細胞并向M2型巨噬細胞分化。經(jīng)CAFs培養(yǎng)的M1巨噬細胞M2標志物表達增加，抗炎細胞因子IL‐10的產(chǎn)生增加，而促炎癥細胞因子IL‐12的產(chǎn)生減少；提示CAFs也能誘導M1巨噬細胞向M2巨噬細胞轉(zhuǎn)分化[60]。Cohen等[61]證實，Chi3L1在從乳腺腫瘤和轉(zhuǎn)基因小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤分離的CAFs以及人乳腺癌間質(zhì)中高度上調(diào)。體內(nèi)成纖維細胞內(nèi)的Chi3L1基因消融可降低腫瘤生長、巨噬細胞募集和向M2樣表型的重編程，增強CD8+和CD4+T細胞對腫瘤的浸潤，并促進Th1表型的轉(zhuǎn)化。同樣，M2巨噬細胞與CAFs的關(guān)系是相互的，M2巨噬細胞也能夠影響成纖維細胞的間充質(zhì)‐間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，導致其反應性增強[62]。盡管有大量研究表明，腫瘤細胞CAFs和TAMs之間通過分泌各種細胞因子相互調(diào)控，但是由于細胞因子網(wǎng)絡的復雜性，具體的機制尚未完全揭示，這為我們的研究提供了方向，也為治療提供了靶點。

5 CAFs對DCs的調(diào)節(jié)作用

DCs是有效的抗原呈遞細胞，能夠通過I類和II類MHC復合物、共刺激分子和黏附分子的表達啟動初級免疫反應，是啟動、調(diào)控和維持免疫應答的中心環(huán)節(jié)，在誘導抗肺癌免疫應答中起重要作用[63]。有研究[64]表明，色氨酸的代謝產(chǎn)物Kyn是一種重要的微環(huán)境因子，可以抑制DCs的分化，誘導癌癥生長和遷移。而CAFs可以表達IDO或色氨酸‐2,3‐雙加氧酶（recombinant tryptophan‐2,3‐dioxygenase, TDO）對色氨酸進行分解代謝，產(chǎn)生更多的Kyn，進而抑制DC功能，促進腫瘤免疫。關(guān)于CAFs對于色氨酸代謝的影響，還有待于進一步的探究，這也為我們提供了一個新的治療靶點。有研究[65]發(fā)現(xiàn)，來源于肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的CAFs可以促進調(diào)節(jié)性DC的生成，其特征是共刺激分子的低表達、高抑制性細胞因子的產(chǎn)生和免疫反應的增強調(diào)節(jié)，包括T細胞增殖障礙和通過IDO上調(diào)促進調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）擴增。該研究還發(fā)現(xiàn)，當使用STAT3特異性抑制劑時，肝臟CAFs‐DC中的IDO生成顯著下調(diào)，提示肝臟CAFs‐DC分泌IDO是由激活的STAT3介導。進一步研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞癌來源的CAFs能夠通過IL‐6介導的STAT3激活將正常DC轉(zhuǎn)化為IDO產(chǎn)生細胞，從而形成腫瘤的免疫抑制。有學者[66]嘗試將DCs與CAFs融合，發(fā)現(xiàn)DC/CAF融合細胞激活的T細胞在體外可以產(chǎn)生強烈的CTL反應。DC/CAFs融合比未成熟DCs表達更高水平的共刺激CD80、CD86和MHC II分子，實驗研究表明 DC/CAF融合細胞免疫可顯著降低H22腫瘤的生長并延長BALB/C荷瘤小鼠的存活時間。這些結(jié)果表明DC/CAF融合細胞作為一種新型抗腫瘤疫苗具有刺激T細胞的潛力。

6 CAFs對腫瘤NK細胞的調(diào)節(jié)作用

NK細胞通過直接識別并殺傷腫瘤細胞在抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用[67]。自然殺傷組2成員D（natural killer group 2 member D receptor, NKG2D）是NK細胞的激活受體之一，對NK細胞的激活至關(guān)重要。NKG2D的兩個配體MICA/B可以在腫瘤細胞表面表達。有研究[68]顯示，黑色素瘤微環(huán)境中CAF增加基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMPs）的分泌可降低MICA/B的表達，從而進一步降低NK細胞對依賴NKG2D的黑色素瘤癌細胞的細胞毒性活性。CAFs還可通過分泌前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）和/或IDO降低NK細胞表面幾種NK激活受體（包括NKp30、NKp44和NKG2D）的表達，從而降低NK細胞對腫瘤靶細胞的殺傷活性[69]。CAFs的細胞表面可以表達脊髓灰質(zhì)炎病毒受體（poliovirus receptor, PVR），PVR是NK激活受體DNAX輔助分子‐1（DNAM‐1）的重要配體，流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)相對于正常成纖維細胞，PVR在CAFs細胞表面表達降低，使用抗PVR的siRNA（PVRsi）來下調(diào)NEF中PVR的表達，與PVRsi轉(zhuǎn)染的正常成纖維細胞共培養(yǎng)的NK細胞殺傷活性下降到對照轉(zhuǎn)染正常成纖維細胞的大約1/3。PVR表達的降低和對NK細胞活性的影響與CAFs大致相當。這些數(shù)據(jù)提示PVR在CAFs中的表達降低是CAFs誘導的NK細胞活性抑制的關(guān)鍵。CAFs可產(chǎn)生TGF‐β從而抑制NK細胞IFN‐γ的表達，進而阻礙Th1的分化和抑制NK細胞活化受體如NKG2D、NKp6、NKp44和NKp30的表達[70]。盡管CAFs對于NK細胞的作用已經(jīng)做了很多研究，但是對于兩者的相互作用以及NK細胞反向?qū)τ贑AFs的調(diào)節(jié)機制，還有待于進一步發(fā)現(xiàn)。

7 總結(jié)與展望

CAFs和腫瘤浸潤性免疫細胞是微環(huán)境中關(guān)鍵的組成成分，二者對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到了不可或缺的調(diào)控作用。在本文中，我們著重討論了CAFs對于TILs、TAMs、DCs、MDSCs和NKs的調(diào)控作用，并對未來可能的研究方向和治療靶點進行了展望。CAFs可以分泌多種細胞因子以及通過多種通路實現(xiàn)對于腫瘤細胞、免疫細胞的調(diào)控。三者之間，形成了復雜的信息網(wǎng)絡，共同促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，盡管相關(guān)的研究越來越多，但是三者之間的復雜關(guān)系仍然等待著進一步的揭示。近年來，有人通過使用納米顆粒增強計算機掃描成像的方法，來探究微環(huán)境中免疫細胞的變化，以此評估免疫治療的效果[71]。受此啟發(fā)，考慮是否未來可以采用類似的方法來研究微環(huán)境中三者的作用關(guān)系。在治療方面，由于通路很多，如何選擇一個合適的通路來保證治療的有效性，是一個值得考慮的方向。此外，CAFs是一個異質(zhì)性群體，不同的CAFs亞群在腫瘤的免疫調(diào)控方面也有著不同的作用，如何區(qū)分不同亞型以及其各自的免疫調(diào)控機制，也期待著我們進一步的研究。