楊赫 劉子成 王鴻亞 陳亮 王俊 聞偉 徐心峰 朱全

由于早期肺癌篩查計(jì)劃在全國的開展以及2019冠狀病毒病（coronavirus disease 2019, COVID‐19）的大流行，胸部低劑量螺旋計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography,CT）篩查使得大量以磨玻璃結(jié)節(jié)為主要特征的早期肺癌患者被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)肺癌作為目前全球發(fā)病率第二高的癌癥（僅次于乳腺癌），其死亡率仍居所有癌癥首位[1]，肺癌的機(jī)制與治療一直是近年來研究熱點(diǎn)。

早期肺癌在影像學(xué)上往往表現(xiàn)為磨玻璃結(jié)節(jié)影（ground glass opacity, GGO），而實(shí)性成分的存在被認(rèn)為對(duì)肺腺癌的惡性程度及預(yù)后有較高的預(yù)測價(jià)值[2]。目前認(rèn)為，肺腺癌的預(yù)后與組織學(xué)類型密切相關(guān)，貼壁型為主的腺癌為低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，腺泡型和乳頭型為主的腺癌為中等復(fù)發(fā)可能的病理亞型，而微乳頭型與實(shí)體型腺癌則為有高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的病理亞型[3]，由此可知腺癌的影像學(xué)與病理學(xué)特征決定著患者的個(gè)體化診治方式。

當(dāng)前，手術(shù)切除仍是治療肺腺癌的主要選擇，然而，隨機(jī)臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明在晚期非小細(xì)胞肺癌（non‐small cell lung cancer, NSCLC）中，使用表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）治療后的無進(jìn)展生存期比化療后更長[4]。EGFR‐TKIs是最先應(yīng)用于臨床的靶向藥物，是NSCLC靶向治療的一座里程碑。此后，間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）、KRAS等肺癌相關(guān)基因也逐漸被發(fā)現(xiàn)，并且有大量研究在探討他們?cè)贜SCLC患者中的治療潛力。EGFR與ALK基因突變?yōu)榉伟┌l(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素[5]，是當(dāng)前NSCLC靶向治療的主要位點(diǎn)，已有較多研究探討EGFR、ALK基因突變所具有的影像學(xué)或病理學(xué)特征，但仍存在較多爭論。同時(shí)，由于國內(nèi)外尚缺乏單發(fā)腺癌所含各種病理亞型成分與基因突變及突變亞型的相關(guān)性研究，且關(guān)于EGFR、ALK突變型肺腺癌的影像學(xué)表現(xiàn)的研究多為小樣本回顧性研究，暫無統(tǒng)一的度量標(biāo)準(zhǔn)和分析軟件，使得肺腺癌的影像學(xué)、病理學(xué)特征與基因突變的相關(guān)性未得到足夠評(píng)估。因此，本研究旨在通過大樣本的回顧性研究，探討EGFR及ALK基因突變患者的臨床病理學(xué)特征以及影像學(xué)特征，以期提高肺腺癌患者的診斷效能及治療效能。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018年1月‐2019年12月于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行胸腔鏡下肺葉切除術(shù)和亞肺葉切除術(shù)的NSCLC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者術(shù)前于我院行薄層胸部CT檢查；②患者行單發(fā)病灶肺葉、肺段切除術(shù)或肺楔形切除術(shù)；③術(shù)后病理為浸潤性腺癌（病理學(xué)分型采用2015年世界衛(wèi)生組織肺部腫瘤分類）；④術(shù)后行常規(guī)肺癌相關(guān)基因檢測（EGFR、ALK基因等）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前行新輔助治療的患者；②病理資料（包含淋巴結(jié)、胸膜侵犯情況及腺癌中各種組織學(xué)亞型成分所占百分比）不完善的患者；③影像學(xué)資料不清晰的患者。研究內(nèi)容包括患者基本信息、影像學(xué)數(shù)據(jù)及病理學(xué)資料。本研究術(shù)后病理分期采用第8版NSCLC腫瘤原發(fā)灶‐淋巴結(jié)‐轉(zhuǎn)移（tumor‐node‐metastasis, TNM）分期。

1.2 影像學(xué)評(píng)估 所有患者于我院行薄層胸部CT平掃檢查，由2位有經(jīng)驗(yàn)的影像醫(yī)師和1位胸外科醫(yī)師分別在我院影像歸檔和通信系統(tǒng)（picture archiving and communication systems, PACS）上閱片，記錄腫瘤最大直徑、實(shí)性成分最大直徑、實(shí)性成分占比（consolidation tumor ratio, CTR）、分葉征、毛刺征、胸膜牽拉征、支氣管充氣征、空泡征，如遇結(jié)論不一致時(shí)，由上級(jí)醫(yī)師進(jìn)行分析進(jìn)一步明確結(jié)果。

1.3 病理結(jié)果和肺癌相關(guān)基因檢測 所有腫瘤組織標(biāo)本于術(shù)后行福爾馬林固定，石蠟包埋切片后行肺癌相關(guān)基因檢測?；驒z測均由我院病理科使用擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system, ARMS）進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）。通過查閱患者病理資料，收集所有符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者的石蠟切片病理結(jié)果以及EGFR、ALK等基因突變信息。當(dāng)肺腺癌中每種組織學(xué)成分（腺泡型、貼壁型、乳頭型、微乳頭型、實(shí)體型）比重大于5%時(shí)，該成分的存在將被記錄，并以5%的增量半定量地記錄各種組織類型的百分比，選擇占比最大的亞型作為主要組織學(xué)亞型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析組間差異，計(jì)數(shù)資料組間差異使用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。通過建立多因素邏輯回歸模型，納入單變量分析中P<0.1的變量進(jìn)行多變量分析，并計(jì)算優(yōu)勢比（odds ratio, OR），以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因突變組與野生組基線資料比較 在本研究納入的525例患者中，女性405例，男性120例，平均年齡（57.93±11.07）歲，腫瘤的平均直徑為（1.89±0.94）cm，包含56例（10.7%）純磨玻璃結(jié)節(jié)，326例（62.1%）混合磨玻璃結(jié)節(jié)，143例（27.2%）為純實(shí)性結(jié)節(jié)，478例（91.0%）患者病理TNM分期為I期。

EGFR基因突變患者在所有患者中占比為59.8%（314/525），女性患者EGFR突變率明顯高于男性（83.6% vs 49.2%, P<0.01），ALK基因突變組患者在所有患者中占比為3.2%（17/525），突變組患者年齡較?。≒=0.002），吸煙率高于野生組（P=0.039）（表1）。

2.2 EGFR、ALK基因突變組與野生組的影像學(xué)特征比較根據(jù)薄層胸部CT影像，EGFR基因突變組在胸部CT軸位圖像上的腫瘤直徑、實(shí)性成分直徑大于野生組（分別為P=0.008和P=0.004），在CTR上無顯著差異（P=0.052），但突變組在CTR≥0.5上占比大于野生組（P=0.019）（表1）。進(jìn)一步分層分析顯示：外顯子21突變型腺癌直徑大于野生型（P=0.034），外顯子19突變型腺癌的實(shí)性成分直徑大于野生型（P=0.019），外顯子19突變型腺癌在CTR及CTR≥0.5占比上大于野生型及外顯子21突變型（P=0.001）（表2）。形態(tài)學(xué)上，突變組較野生組存在更多分葉征（P=0.032）、胸膜牽拉征（P=0.001）。

表2 EGFR基因突變亞型分層分析及組內(nèi)對(duì)照分析Tab 2 Stratification analysis and intra-group control analysis of EGFR gene mutation subtype

ALK基因突變組與野生組在上述影像學(xué)特征上無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。

2.3 EGFR基因組與ALK基因組的病理結(jié)果比較 EGFR基因組在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)站點(diǎn)及有無臟層胸膜侵犯（visceral pleural invasion, VPI）等病理結(jié)果方面無顯著差異。在組織學(xué)亞型上，突變組腺癌較野生組存在更多腺泡型成分（P=0.033）。

ALK基因組在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)站點(diǎn)無顯著差異，突變組VPI的發(fā)生率高于野生組（P=0.005），在組織學(xué)亞型上，野生型腺癌存在更多貼壁型成分（P=0.004），突變型存在更多微乳頭成分（P=0.001）（表1）。

表1 EGFR、ALK基因組基線數(shù)據(jù)及影像學(xué)、病理學(xué)特征對(duì)比Tab 1 Comparison of baseline data and imaging and pathological features of patients with EGFR and ALK gene mutation group and wild group

在肺腺癌主要組織學(xué)亞型方面，EGFR基因野生組多為貼壁為主型（P=0.014），突變組多為腺泡為主型（P=0.037），ALK基因突變組與野生組在主要病理學(xué)亞型方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表3）。

表3 主要組織學(xué)亞型與基因突變的關(guān)系［n (%)］Tab 3 The relationship between main histological subtypes and gene mutation [n (%)]

2.4 多因素邏輯回歸分析 將上述單因素統(tǒng)計(jì)分析所得P<0.1的變量納入多因素邏輯回歸分析，結(jié)果顯示女性（OR=2.041, 95%CI: 1.330‐3.134, P=0.001）、胸膜牽拉征（OR=1.506, 95%CI: 1.014‐2.237, P=0.042）為EGFR基因突變的獨(dú)立預(yù)測因素。分層分析中：年齡相對(duì)較大（OR=2.010, 95%CI: 1.001‐1.044, P=0.036）、女性（OR=2.010, 95%CI: 1.210‐3.339, P=0.007）、較大腫瘤直徑（OR=1.360, 95%CI: 1.026‐2.489, P=0.034）及胸膜牽拉征（OR=1.754, 95%CI: 1.048‐2.915, P=0.029）為外顯子21突變型腺癌的獨(dú)立預(yù)測因素。女性（OR=2.230,95%CI: 1.226‐4.057, P=0.009）、CTR（OR=1.589, 95%CI:1.012‐3.456, P=0.047）、CTR≥0.5（OR=1.230, 95%CI:1.125‐1.369, P=0.038）及分葉征（OR=2.762, P=0.026）為外顯子19突變型腺癌的獨(dú)立預(yù)測因素。

在ALK基因研究組中，年齡相對(duì)較?。∣R=1.070,95%CI: 1.025‐1.117, P=0.002）、有吸煙史（OR=3.937, 95%CI:1.311‐11.765, P=0.015）、微乳頭型成分的存在（OR=4.184,95%CI: 1.261‐13.889, P=0.019）及VPI（OR=1.406, 95%CI:1.034‐2.345, P=0.034）為ALK基因突變的獨(dú)立預(yù)測因素（表4）。

表4 多因素邏輯回歸分析Tab 4 Multivariate Logistic regression analysis

3 討論

EGFR、ALK基因是NSCLC的重要驅(qū)動(dòng)基因，且對(duì)靶向治療的選擇具有決定性作用，腫瘤的影像學(xué)及病理學(xué)特征同樣在腺癌的規(guī)范診治決策中至關(guān)重要[6]，然而三者之間的聯(lián)系尚未完全闡明，在這項(xiàng)回顧性研究中，我們探討了手術(shù)切除的肺腺癌患者基因突變與影像學(xué)、病理學(xué)特征的相關(guān)性。

本研究中EGFR及ALK基因突變患者的占比分別為59.8%和3.24%，與既往研究[7,8]所報(bào)道的60%和2%‐7%相一致。女性患者的EGFR突變率較男性高（P=0.007），無吸煙史患者占比較高但無顯著差異（P=0.055），與先前研究[9]所報(bào)道EGFR基因突變易發(fā)生于不吸煙的年輕女性基本相符。ALK突變患者易發(fā)生于年輕患者（P=0.002），吸煙率高于野生組（P=0.039），有研究[10]報(bào)道ALK重排易發(fā)生于年輕的非吸煙或少吸煙腺癌患者，其中的差異可能與本研究納入ALK突變的病例數(shù)相對(duì)較少且未將吸煙程度明確分級(jí)有關(guān)，目前吸煙史與ALK突變之間的關(guān)系暫不明確，尚不能排除吸煙暴露是腺癌的異質(zhì)性來源[11]。

目前研究[12]多表明EGFR突變?cè)贑T中更多地表現(xiàn)為GGO，亦有研究[13]發(fā)現(xiàn)EGFR突變與實(shí)性成分相關(guān)。本研究中EGFR基因突變組較野生組腫瘤擁有更大直徑、實(shí)性成分，而多因素邏輯回歸分析顯示腫瘤大小及實(shí)性成分并非EGFR突變的獨(dú)立預(yù)測因素。這一發(fā)現(xiàn)可能的解釋為EGFR表達(dá)與CT上GGO的百分比呈負(fù)相關(guān)[14,15]，且EGFR突變可以促進(jìn)GGO向?qū)嵭猿煞洲D(zhuǎn)化[16]。為更進(jìn)一步探討其相關(guān)性，本研究對(duì)在EGFR突變中占比約85%且對(duì)EGFR‐TKI敏感的經(jīng)典外顯子19、外顯子21突變位點(diǎn)[17]進(jìn)行分層分析，結(jié)果表明外顯子21突變型腺癌的腫瘤直徑更大，外顯子19突變型腺癌的實(shí)性成分占比更多。我們有理由認(rèn)為外顯子19與外顯子21突變型腺癌影像學(xué)表現(xiàn)不同，對(duì)突變亞型分層可更精準(zhǔn)地探討EGFR突變與實(shí)性成分的相關(guān)性。

此外，本研究揭示了EGFR突變型腺癌在CT上更多表現(xiàn)為分葉征、胸膜牽拉征，且多因素邏輯回歸分析顯示胸膜牽拉征為EGFR突變的重要預(yù)測因素，這與Cheng等[18]的薈萃分析研究一致。分層分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)胸膜牽拉征為外顯子21突變的重要預(yù)測因素，分葉征為外顯子19突變的重要預(yù)測因素。胸膜牽拉征指胸膜受牽拉向腫瘤方向收縮，由腫瘤的反應(yīng)性纖維化和瘢痕增生形成，分葉征則代表腫塊向各個(gè)方向生長速度不一，我們的研究證實(shí)其均為腺癌診斷的重要影像學(xué)表現(xiàn)，研究未發(fā)現(xiàn)其他CT特征與EGFR突變之間的相關(guān)性，而Qiu等[19]研究發(fā)現(xiàn)EGFR突變型腺癌以分葉征、毛刺征、支氣管充氣征、胸膜牽拉征多見。對(duì)上述差異的解釋可能是由于多種影像學(xué)征象的判斷主觀性強(qiáng)，各研究之間無統(tǒng)一的研究設(shè)計(jì)、評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。未來，影像組學(xué)利用數(shù)字圖像處理技術(shù)、機(jī)器學(xué)習(xí)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，以其定性、定量的優(yōu)勢精準(zhǔn)分析肺癌的病灶形態(tài)，將進(jìn)一步探究基因突變與影像學(xué)特征的相關(guān)性[20]。

在病理學(xué)方面，我們發(fā)現(xiàn)EGFR突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胸膜侵犯的相關(guān)性較小，Zou等[21]通過多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在EGFR突變組與野生組間無明顯差異，與本研究一致，Shi等[22]研究發(fā)現(xiàn)與EGFR野生型相比，19del和L858R突變均能顯著增加NSCLC患者VPI的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，Shi等[22]的研究對(duì)象為包含鱗癌的III期占比為21.9%的NSCLC患者，存在VPI的患者占比較高（45.1%），而本研究中I期患者占比較高（91.0%），研究的差異可能是選擇偏倚導(dǎo)致的，但本研究表明早期腺癌EFGR突變與胸膜侵犯無顯著相關(guān)。既往研究[23]表明，腺泡優(yōu)勢型肺腺癌EGFR基因突變率高于其他亞型腺癌，本研究亦證實(shí)EGFR突變型腺癌與腺泡型成分關(guān)系密切，且存在更多腺泡為主型腺癌。

圖1 典型的CT征象。A：EGFR、ALK基因野生型腺癌，以磨玻璃成分為主；B：EGFR基因外顯子21突變型腺癌，存在胸膜牽拉征及較多磨玻璃成分；C：EGFR基因外顯子19突變型腺癌，存在分葉征及較多實(shí)性成分；D：ALK基因突變型腺癌，以實(shí)性腫塊為主。Fig 1 Typical CT signs. A: EGFR and ALK gene wild-type adenocarcinoma, mainly composed of ground glass; B: Exon 21 mutant adenocarcinoma had pleural traction sign and more ground glass components; C: Exon 19 mutant adenocarcinoma had lobulation sign and more solid components; D: ALK gene mutant adenocarcinoma is mainly solid mass. CT: computed tomography.

先前研究[24,25]表明ALK基因突變陽性患者腫瘤具有更大體積、實(shí)性腫塊，本研究亦發(fā)現(xiàn)突變組具有較大的腫瘤直徑及實(shí)性成分，可能因納入的ALK突變病例較少而差異不顯著（P>0.05）。本研究中ALK基因突變組在影像學(xué)特征方面無特異性表現(xiàn)，Chang等[26]研究發(fā)現(xiàn)ALK突變組與野生組在腺癌的分葉征、毛刺、氣管征、空泡征、胸膜牽拉征上無顯著差異，與本研究一致。

有研究[27‐29]表明ALK突變易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胸膜侵犯，是預(yù)后不良的一個(gè)預(yù)測因素，本研究同樣證實(shí)ALK突變腺癌易出現(xiàn)胸膜侵犯，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)，這可能與本中心所納入的ALK突變多為Ia期（76.5%）腫瘤有關(guān)，同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)Ia期周圍型肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率很低，尤其CT上以GGO為主的腺癌幾乎沒有發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)ALK基因突變患者組織學(xué)亞型中含有更多微乳頭成分，多因素回歸分析證實(shí)微乳頭型腺癌成分為ALK基因突變的獨(dú)立預(yù)測因素。Li等[27]研究發(fā)現(xiàn)ALK陽性患者術(shù)后的無病生存期明顯短于EGFR突變陽性患者和野生型患者，且既往研究多提示ALK重排為較低的無病生存率的顯著預(yù)測因素，我們可以推測微乳頭成分的增多提高了ALK突變的概率，同時(shí)降低了患者的生存率。

本研究亦存在一些局限：這些數(shù)據(jù)是基于單中心的回顧性研究，不可避免地會(huì)造成選擇偏差，研究納入ALK突變陽性的病例數(shù)相對(duì)較少且腫瘤分期較早，上述局限都是可能導(dǎo)致本研究結(jié)果與既往研究存在差異的原因；我們的隨訪時(shí)間較短，研究未納入關(guān)于腺癌患者預(yù)后的隨訪數(shù)據(jù)，無法直接得出EGFR及ALK基因突變狀態(tài)與預(yù)后的關(guān)系。然而，我們的研究結(jié)果為進(jìn)一步的研究提供了方向。

在NSCLC患者中，女性在CT上有胸膜牽拉征的患者更容易發(fā)生EGFR突變且不同突變亞型影像病理學(xué)表現(xiàn)有差異。年輕的吸煙患者及擁有微乳頭成分患者其ALK突變發(fā)生率更高，且其更易發(fā)生VPI。這些結(jié)果有利于臨床醫(yī)生將臨床、影像、病理特征與驅(qū)動(dòng)基因突變的表現(xiàn)結(jié)合起來，在臨床上加快篩選潛在的驅(qū)動(dòng)基因突變?nèi)巳海贫ㄗ罴阎委煵呗?，使患者接受個(gè)體化的針對(duì)性治療而提高治療效果，在臨床診治肺腺癌上具有重要意義。我們期待多中心、前瞻性的研究對(duì)本研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證與拓展，為肺腺癌患者的預(yù)測評(píng)估建立精準(zhǔn)的影像‐病理‐基因表型綜合模型。

Author contributions

Zhu Q and Chen L conceived and designed the study.Yang H performed the experiments. Yang H, Liu ZC and Wang HY analyzed the data. Wen W, Wang J and Xu XF contributed analysis tools. Yang H, Liu ZC and Zhu Q provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study.All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.