戴越 周帆 穆軍升

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心臟外科 北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029；2.解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心超聲科，北京 100039)

心血管疾病由于其高發(fā)病率而成為危害全世界人類健康的主要問(wèn)題[1]。如果發(fā)生心肌梗死(myocardial infarction，MI)，存活的心肌細(xì)胞(cardiomyocytes，CM)數(shù)量會(huì)下降。隨著MI后纖維瘢痕組織的形成和心室組織的重塑，這不僅不利于心臟泵血，反而會(huì)造成剩余的心肌肥厚，梗死區(qū)心肌變薄，心室擴(kuò)張。最終，導(dǎo)致心力衰竭發(fā)作。目前，臨床上沒有一種治療方式可逆轉(zhuǎn)MI造成的心肌損傷，因此臨床迫切需求新的治療方式來(lái)提高CM活性以改善心臟功能。通過(guò)將干細(xì)胞來(lái)源CM移植到MI區(qū)來(lái)修復(fù)受損的心肌和恢復(fù)心臟功能，被認(rèn)為是治療MI最有前途的方式之一[2-3]。

然而，干細(xì)胞來(lái)源CM的特點(diǎn)是分化率低和不成熟狀態(tài)，其被移植到受損心臟后存在心律失常的風(fēng)險(xiǎn)，無(wú)法執(zhí)行正常CM的功能[4-5]。在心臟收縮過(guò)程中，起搏器細(xì)胞從竇房結(jié)發(fā)出節(jié)律性電信號(hào)，通過(guò)細(xì)胞縫隙連接傳播至CM，再通過(guò)高導(dǎo)電性的浦肯野纖維傳導(dǎo)至心臟其他區(qū)域，最終實(shí)現(xiàn)整個(gè)心臟的節(jié)律性收縮。在此過(guò)程中，電信號(hào)和縫隙連接對(duì)心臟的同步搏動(dòng)至關(guān)重要[6]。近些年，電刺激(electrical stimulation，ES)因其為非藥物治療手段以及在疾病治療方面的安全、方便、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。因此，外源性ES模仿心臟原始環(huán)境來(lái)誘導(dǎo)干細(xì)胞心肌向分化，成為了一種很有前途的方法[7-8]，這將進(jìn)一步推動(dòng)干細(xì)胞在MI治療的臨床應(yīng)用進(jìn)程。

1 外源性ES影響干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的因素

CM之間通過(guò)閏盤結(jié)構(gòu)形成縫隙連接，有利于細(xì)胞間的電興奮傳導(dǎo)并根據(jù)電信號(hào)在節(jié)律上同步收縮[9]。為了促進(jìn)干細(xì)胞心肌向分化，在應(yīng)用ES來(lái)模擬心臟電生理信號(hào)的過(guò)程中，優(yōu)化所施加電場(chǎng)刺激的參數(shù)至關(guān)重要[10]。

1.1 脈沖方向

根據(jù)電流方向是否改變可分為單相脈沖和雙相脈沖。雖然單相脈沖能有效地刺激CM產(chǎn)生動(dòng)作電位，但也會(huì)產(chǎn)生活性氧等物質(zhì)造成組織損傷。雙相脈沖可有效防止組織損傷，但相應(yīng)的其產(chǎn)生的中次級(jí)脈沖超極化可能會(huì)抑制動(dòng)作電位的啟動(dòng)[11]。

Baumgartner等[12]對(duì)胎鼠CM連續(xù)6 d施加振幅1 V、脈寬5 ms和頻率10 Hz的單相脈沖，ES促進(jìn)了細(xì)胞形態(tài)伸長(zhǎng)和平行排列以及縫隙連接蛋白(connexin，Cx)43的表達(dá)。Pietronave等[13]對(duì)人類祖細(xì)胞分別施加電場(chǎng)強(qiáng)度2.5 V/cm、頻率1 Hz和脈寬1 ms的雙相方波脈沖以及具有相同總幅度和持續(xù)時(shí)間的單相方波脈沖(5 V/cm、1 Hz和2 ms)。他們發(fā)現(xiàn)雙相脈沖刺激組更早表達(dá)Cx43，早期心臟轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)，如肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D、鋅指轉(zhuǎn)錄因子蛋白4和Nk2型同源盒轉(zhuǎn)錄因子5，以及晚期心臟肌節(jié)蛋白表達(dá)增加，如心肌肌鈣蛋白T、心臟α-肌動(dòng)蛋白和肌漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+ATP酶。說(shuō)明雙相脈沖更快、更有效地促進(jìn)了人類祖細(xì)胞的心肌向分化。綜上，單相脈沖刺激可更有效產(chǎn)生動(dòng)作電位，引起更少的電極腐蝕，但會(huì)在長(zhǎng)期刺激中增加組織損傷；而雙相脈沖刺激可長(zhǎng)期產(chǎn)生有效刺激并不會(huì)引起組織損傷，雖然與單相脈沖相比不易產(chǎn)生有效動(dòng)作電位和更易產(chǎn)生電極腐蝕，但雙向脈沖刺激可通過(guò)改變ES條件，如雙向電荷平衡和雙向電荷不平衡等來(lái)減少相應(yīng)的副作用[11]。因此雙相脈沖ES具有更優(yōu)的選擇性，可能對(duì)長(zhǎng)期干細(xì)胞心肌向分化過(guò)程更有利。

1.2 電場(chǎng)強(qiáng)度與持續(xù)時(shí)間

對(duì)于相同的電場(chǎng)強(qiáng)度，當(dāng)脈沖持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞凋亡率更高[14]。因此在體外對(duì)細(xì)胞施加ES時(shí)，協(xié)調(diào)其電場(chǎng)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間十分重要。

為了探究ES持續(xù)時(shí)間對(duì)人心球源性細(xì)胞(human cardiosphere-derived cells，hCDCs)心肌向分化的影響，Nazari等[15]向hCDCs施加強(qiáng)度為150 mV、頻率1 Hz和電流2 mA的電荷平衡雙相脈沖，并分別持續(xù)1、3和5 d，每天ES 5和10 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)持續(xù)5 d，每天ES 10 min組的心肌肌鈣蛋白T和鋅指轉(zhuǎn)錄因子蛋白4表達(dá)最高，但α-肌球蛋白重鏈表達(dá)下降。Ma等[16]應(yīng)用1 V/cm、5 Hz的參數(shù)對(duì)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)施加持續(xù)30 d的ES后，發(fā)現(xiàn)心源性基因表達(dá)上調(diào)，并將誘導(dǎo)分化的心肌樣細(xì)胞(hiPSC-derived CMs，hiPSC-CMs)注射到小鼠梗死心臟區(qū)后，發(fā)現(xiàn)心臟功能的改善和梗死面積的減少。

1.3 ES起始作用時(shí)間

ES的影響部分程度上取決于第一次ES時(shí)細(xì)胞的分化程度。如果施加時(shí)間太早，ES會(huì)抑制心肌蛋白的聚集并產(chǎn)生不良的收縮行為。如果施加時(shí)間太晚，ES不再有助于細(xì)胞的功能組裝。

Radisic等[17]分別對(duì)1、3和5 d齡的新生大鼠心室肌細(xì)胞施加ES。1 d齡的心室肌細(xì)胞受到ES后，Cx43和α-肌球蛋白重鏈含量均下降，產(chǎn)生低度分化的單層CM，無(wú)法產(chǎn)生同步收縮。而5 d齡的心室肌細(xì)胞受到ES后只建立縫隙鏈接，無(wú)有效的收縮功能。最終發(fā)現(xiàn)3 d齡的新生大鼠心室肌細(xì)胞ES處理后具有更優(yōu)的收縮能力和縫隙鏈接。Ronaldson-Bouchard等[18]對(duì)體外培養(yǎng)的hiPSC-CMs早期(第一次自發(fā)收縮后，第12天)和晚期(第28天)施加ES，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早期hiPSC-CMs顯示出明顯的可塑性，說(shuō)明hiPSCs對(duì)ES反應(yīng)性隨分化進(jìn)程的進(jìn)行而下降。Chen等[19]分別對(duì)4、7和12 d齡的擬胚體施加ES，這分別對(duì)應(yīng)于干細(xì)胞分化的早期、中期和末期3個(gè)階段，ES參數(shù)為電流強(qiáng)度10、30和60 μA、頻率1 Hz、脈寬10 ms的雙相ES培養(yǎng)4 d。低強(qiáng)度ES對(duì)早期分化階段的干細(xì)胞作用不大，但在60 μA的ES下，其β-肌球蛋白重鏈水平顯著增加。對(duì)于中期分化階段的干細(xì)胞而言，β-肌球蛋白重鏈和肌鈣蛋白T在30 μA刺激時(shí)表達(dá)增加，而在60 μA時(shí)表達(dá)降低。在末期分化階段，肌鈣蛋白T表達(dá)水平隨ES幅度增加而增加。這說(shuō)明不同分化階段的胚胎干細(xì)胞對(duì)ES有不同程度的敏感性，因此根據(jù)ES起始作用時(shí)間來(lái)調(diào)整其參數(shù)是十分重要的。

1.4 頻率

ES頻率可影響CM的收縮和搏動(dòng)行為。頻率為1～2 Hz的ES可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平瞬時(shí)激增，同時(shí)促進(jìn)肌節(jié)組裝和成熟[7]。有證據(jù)[8]表明，自主搏動(dòng)hiPSC-CMs的搏動(dòng)頻率隨著ES頻率變化而變化，即使在ES停止后，hiPSC-CMs獲得的搏動(dòng)頻率也可保持在所施加的ES頻率水平并持續(xù)傳導(dǎo)到周圍細(xì)胞中。因此，在分化或成熟過(guò)程中，由于hiPSC-CMs具有電生理可塑性，易導(dǎo)致生成具有與移植目標(biāo)心肌區(qū)域不同搏動(dòng)頻率的心肌樣細(xì)胞，這將有引起心律失常的風(fēng)險(xiǎn)，而搏動(dòng)頻率是由ES誘導(dǎo)決定的，因此應(yīng)優(yōu)化ES頻率。

Tandon等[20]對(duì)新生大鼠CM的組織工程心臟構(gòu)建體施加3 V/cm，脈寬2 ms，頻率分別為1、3和5 Hz的單相方波脈沖。研究表明3 Hz組有最高濃度的心肌肌鈣蛋白和Cx43以及最好的收縮行為。Zhang等[21]對(duì)預(yù)培養(yǎng)2 d后的hiPSC-CMs施加ES。首先以1 Hz的頻率連續(xù)刺激5 d，然后每天以1 Hz的頻率遞增刺激，直到頻率達(dá)到6 Hz并保持6 Hz頻率2 d，最后再以1 Hz頻率刺激14 d。觀察到hiPSC-CMs的Cx43表達(dá)增高，形成了更成熟表型的功能性心臟組織。Hirt等[22]設(shè)計(jì)了兩種ES方案：頻率恒定0.5 Hz和第1周2 Hz隨后1.5 Hz，電場(chǎng)強(qiáng)度2 V/cm，脈寬4 ms的雙相脈沖，分別作用于hiPSC-CMs，第2種方案衍生的CM具有更強(qiáng)的自發(fā)搏動(dòng)和更高的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核比。Ronaldson-Bouchard等[18]也對(duì)hiPSCs施加了兩種方案的ES，4.5 V、2 ms單相方波脈沖：(1)2 Hz刺激3周；(2)2周內(nèi)頻率從2 Hz到6 Hz(每天增加0.33 Hz)，然后2 Hz培養(yǎng)1周。結(jié)果是第2種方案刺激效果更好，進(jìn)一步驗(yàn)證了增加誘導(dǎo)收縮的ES頻率可促進(jìn)被誘導(dǎo)分化細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)形成和功能發(fā)育。Nunes等[23]對(duì)hiPSC-CMs施加7 d的ES，電場(chǎng)強(qiáng)度為5 V/cm，脈寬1 ms，頻率從1 Hz開始逐步增加到3 Hz或6 Hz。他們發(fā)現(xiàn)與1～3 Hz的低頻增加方式相比，1周內(nèi)1～6 Hz的起搏頻率可進(jìn)一步增強(qiáng)工程心肌組織的結(jié)構(gòu)和電生理功能。而Zhao等[24]對(duì)胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的CM組織施加兩種ES方案，方案一是頻率從2 Hz到6 Hz，每周增加1 Hz，方案二是頻率從1 Hz到6 Hz，每天增加0.2 Hz，其余條件保持一致。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方案都可促進(jìn)心臟組織功能發(fā)育，并且心肌肌鈣蛋白T和Cx43等心肌蛋白表達(dá)沒有區(qū)別，但方案一具有更高的收縮間歇后力增強(qiáng)效應(yīng)、最大捕獲速率等結(jié)果，這說(shuō)明方案一刺激下組織成熟度更高。因此合理的頻率遞增將更有助于干細(xì)胞心肌向分化并促進(jìn)組織成熟度。

2 ES誘導(dǎo)干細(xì)胞心肌向分化的相關(guān)機(jī)制

雖然研究表明ES可在心臟發(fā)育成熟的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，但其中涉及的機(jī)制尚不完全清楚。

2.1 過(guò)去研究

伍長(zhǎng)學(xué)等[25]發(fā)現(xiàn)隨ES時(shí)間推進(jìn)，肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C基因的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)肌鈣蛋白I的表達(dá)和CM的形成。Genovese等[26]發(fā)現(xiàn)ES后人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中卵泡抑素的表達(dá)上調(diào)，證明短期ES促進(jìn)了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的心肌向分化。近年來(lái)，卵泡抑素已被證明是肌肉發(fā)育、分化和再生的關(guān)鍵。它可通過(guò)參與中胚層和內(nèi)胚層組織的修復(fù)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖并限制纖維化[27]。

2.2 最新進(jìn)展

He等[28]發(fā)現(xiàn)在ES的作用下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生心肌向分化原因之一是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了Cx43和肌動(dòng)蛋白α2的表達(dá)，并且這一過(guò)程受轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1抑制劑吡非尼酮的影響。

Nazari等[15]對(duì)hCDCs施加ES，發(fā)現(xiàn)hCDCs的分化高度依賴于電流的同步傳輸。這是通過(guò)由最佳排列和伸長(zhǎng)的CM構(gòu)成的名為“合胞體”的結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)施加恒定幅度的脈動(dòng)電流，受到刺激hCDCs橫向堆積，即與電流方向垂直。對(duì)齊的CM開始像電容器一樣發(fā)揮作用，響應(yīng)于施加的ES而充電和放電。CM的這種搏動(dòng)特性促進(jìn)了同步肌纖維收縮的形成。

Crestani等[29]發(fā)現(xiàn)暴露于ES的hiPSC-CMs中的閏盤蛋白伴肌動(dòng)蛋白相關(guān)錨定蛋白和β-連環(huán)蛋白的表達(dá)增加。Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)通路已被證實(shí)在hiPSCs心肌向分化和縫隙連接形成中起著重要作用[30]。伴肌動(dòng)蛋白相關(guān)錨定蛋白表達(dá)參與發(fā)育過(guò)程中的肌原纖維肌生成和成熟肌肉中的細(xì)胞-細(xì)胞連接[31]。表明ES可能通過(guò)激活Wnt/β-連環(huán)蛋白通路促進(jìn)hiPSC-CMs成熟度的提高。

Ma等[16]發(fā)現(xiàn)ES促進(jìn)hiPSCs心肌分化，可能機(jī)制為激活Ca2+/蛋白激酶C/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶通路。蛋白質(zhì)印跡表明，ES增強(qiáng)了Ca2+結(jié)合蛋白(鈣調(diào)蛋白1和3)和蛋白激酶C表達(dá)以及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶磷酸化，抑制了組蛋白去乙?；?的表達(dá)，以上兩種效果均可被鈣信號(hào)抑制劑消除甚至逆轉(zhuǎn)。鈣信號(hào)抑制劑包括維拉帕米(鈣通道阻滯劑)、W-7(鈣調(diào)蛋白拮抗劑)和8-(N，N-二乙胺)-n-辛基-3，4，5-三甲氧基苯甲酸酯(細(xì)胞內(nèi)鈣離子拮抗劑)。有研究表明，當(dāng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中組蛋白去乙酰化酶1基因表達(dá)受到特異性抑制時(shí)，與心肌發(fā)育和結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因的mRNA表達(dá)水平升高[32]。因此，ES可能通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)和下游基因來(lái)增強(qiáng)hiPSCs的心臟基因表達(dá)。

Haneef等[33]發(fā)現(xiàn)將ES作用于3D膠原支架上的干細(xì)胞可促進(jìn)其心臟標(biāo)志物的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)3D膠原支架具有類似于天然的細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)功能，如提供結(jié)構(gòu)強(qiáng)度和抗變形能力。ECM主要由為左心室提供結(jié)構(gòu)強(qiáng)度的膠原蛋白組成。最新研究[27]表明，這可能與糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)的導(dǎo)電性和膠原蛋白的壓電性有關(guān)。GAG在ECM中廣泛分布，富含可電離的羧基和硫酸根，具有電荷轉(zhuǎn)移特性。在施加ES期間，GAG充當(dāng)ECM到細(xì)胞的電導(dǎo)管。同時(shí)，ES會(huì)增加蛋白多糖的合成，每一種蛋白多糖都含有特定的GAG側(cè)鏈，特定的GAG側(cè)鏈對(duì)組織功能和發(fā)育具有重要意義。與此同時(shí)，膠原蛋白具有固有壓電特性，當(dāng)組織被壓縮時(shí)會(huì)產(chǎn)生電荷，對(duì)嵌入其中的細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。膠原組織是由高度排列的纖維狀Ⅰ型和Ⅱ型膠原堆積和交聯(lián)結(jié)構(gòu)組成的，主要存在于骨、軟骨組織[34]和心肌[35]。

3 ES作用于干細(xì)胞來(lái)治療MI的問(wèn)題與展望

不同條件下，不同的ES參數(shù)可能對(duì)應(yīng)著不同干細(xì)胞的不同分化方向，如心房、心室、傳導(dǎo)細(xì)胞等。Chan等[36]認(rèn)為電場(chǎng)強(qiáng)度6.6 V/cm、脈寬2 ms和頻率1 Hz的雙相脈沖刺激是人胚胎干細(xì)胞源CM最佳ES參數(shù)。Hernández等[37]發(fā)現(xiàn)ES誘導(dǎo)干細(xì)胞心肌向分化受細(xì)胞系影響。Crestani等[29]發(fā)現(xiàn)當(dāng)ES參數(shù)為10 V、4 ms、1 Hz和2 h/d時(shí)，人類多能干細(xì)胞向更成熟的心室傳導(dǎo)樣細(xì)胞分化，心室傳導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)增高，Cx40表達(dá)增高，Cx43表達(dá)(由縫隙連接蛋白α1編碼)下降。易洛魁族同源盒3基因在精確調(diào)節(jié)細(xì)胞間縫隙連接耦合和心臟脈沖傳播中起到關(guān)鍵作用，可直接抑制Cx43轉(zhuǎn)錄并間接激活Cx40轉(zhuǎn)錄[38]。

未來(lái)工作的領(lǐng)域包括摸索出完善的ES條件對(duì)應(yīng)不同干細(xì)胞的模型標(biāo)準(zhǔn)，為后續(xù)進(jìn)一步完善ES誘導(dǎo)分化機(jī)制的研究，將組織工程與相關(guān)干細(xì)胞心肌向分化ES方案結(jié)合，這在MI治療的臨床應(yīng)用研究方面具有廣闊前景。

4 結(jié)論

綜上所述，ES是解決干細(xì)胞來(lái)源CM分化率低和不成熟的有效方法之一。在臨床實(shí)踐中，應(yīng)根據(jù)不同的干細(xì)胞量身定制ES方案，以產(chǎn)生最佳的促進(jìn)效果。此外，如果在ES的同時(shí)施加其他相關(guān)刺激，可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同或拮抗作用，如機(jī)械刺激、基質(zhì)等。