閻文江 陳良 楊晶晶

(教育部、國家衛(wèi)健委、中國醫(yī)學科學院心血管重構與功能研究重點實驗室 省部共建心血管轉化醫(yī)學重點實驗室 山東大學齊魯醫(yī)院，山東 濟南 250012)

心血管疾病是目前全球因疾病導致死亡的主要原因，其中85%的缺血性事件是心肌梗死和腦卒中，而動脈粥樣硬化是這些缺血性事件的潛在原因。目前，動脈粥樣硬化的治療主要包括控制危險因素、溶栓和介入治療恢復阻塞相關血管的血流。盡管在預防、診斷和治療動脈粥樣硬化方面取得了一些進展，但臨床現狀仍任重道遠。分子診斷和治療技術從20世紀80年代興起，近年來得到了長足的發(fā)展。對動脈粥樣硬化的顯像和治療從單純的解剖學狹窄的嚴重程度，發(fā)展為斑塊生物學特性以及成分的診療水平。超聲技術具有超高的空間和時間分辨率，并且其具有無創(chuàng)、便捷和經濟的特點，一直是臨床上最常用的影像學技術，尤其是近幾年納米顆粒以及微泡分子介質的發(fā)展，使得超聲技術可對動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展進行靶向分子成像的診斷和治療，為動脈粥樣硬化性疾病的診療提供了巨大的機會。

1 對比增強超聲技術對動脈粥樣硬化斑塊顯像的臨床應用

歐洲超聲醫(yī)學和生物學會聯合會在2017年對對比增強超聲(contrast-enhanced ultrasound，CEUS)在血管系統的應用中指出，在臨床實踐中推薦其用于區(qū)分頸動脈和/或椎動脈閉塞和狹窄的殘余血流；鑒別顱外頸動脈、椎動脈、腹主動脈及其主要分支的解剖；診斷疑為炎性大血管和腹主動脈的輔助手段；應用于主動脈腔內修復的隨訪等方面。而關于斑塊特征成像的推薦，CEUS可用于評估提示斑塊不穩(wěn)定性的頸動脈斑塊血管新生，不過相關研究和應用主要局限于頸動脈[2]。CEUS技術檢測表明斑塊新生血管形成與組織學發(fā)現有很好的相關性，并且Saha等[3]總結了一個用于描述斑塊血管新生的分級系統，將其分為三級：(1)輕度，僅在外膜附近的斑塊邊界處存在移動的微泡；(2)中度，微泡出現在斑塊的肩部和內側，但不出現在頂端；(3)嚴重，整個斑塊(包括尖端)都存在微泡。盡管CEUS在評估血管新生方面有許多優(yōu)勢，但仍需一種最佳的定量方法以及標準化的測量方法[4]。與常規(guī)多普勒超聲相比，CEUS在評估斑塊纖維帽潰瘍的形成中也具有更高的敏感性和特異性。

從實際臨床應用角度出發(fā)，CEUS具有成本低，成像的持續(xù)時間短(10 min)以及對目標的空間分辨率和靈敏度相對平衡的特點，是非常適合基于人群篩查目的的成像方法[5]。但目前，只有少數造影劑被批準并推薦用于臨床應用，例如Definity/Luminity、SonoVue/Lumason或Sonazoid，因此造影劑的限制在某種程度上限制了CEUS在臨床實踐中的發(fā)展和應用[6]。因此目前臨床在實際應用中還是相對較少，將來隨著造影劑的進一步改進以及超聲技術的進一步普及，臨床應用空間會很大。

2 超聲分子成像技術對動脈粥樣硬化斑塊特征顯像的臨床前期研究

分子成像需具有三個因素：靶向配體(抗體、抗原結合片段和肽)，成像工具(超聲、計算機斷層掃描、磁共振成像、正電子發(fā)射計算機斷層顯像/單光子發(fā)射計算機斷層成像和近紅外熒光成像)和檢測劑(微泡、碘化化合物、放射性核苷酸、超順磁性化合物和熒光染料)。分子成像是指對體內的細胞和分子水平上生物過程的特征進行描述和測定，可同時獲取分子成像數據以及形態(tài)或功能特征，而這些數據可詳細描述疾病的病理生理學狀態(tài)，從而為精準治療開辟了道路。超聲分子成像技術是基于由微泡組成的超聲特異性造影劑基礎的成像，用抗體和小肽等結合配體修飾的造影劑，這些功能化超聲造影劑，即靶向造影劑或靶向微泡，可與參與各種疾病過程的生物標志物結合。目前關于臨床前期的研究，通過應用超聲分子成像技術，在各種不同的實驗動物，包括小鼠、大鼠、兔和豬的頸動脈、升主動脈和主動脈弓中，進行了很多有關動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的不同階段的研究。

基于微泡的超聲造影劑有血池限制，其應用僅限于與灌注相關或發(fā)生在血管腔內皮表面的事件，是單純的血管內制劑，不能被用于檢測那些血管腔外的動脈粥樣硬化靶點。所以超聲分子成像技術主要依賴于檢測動脈粥樣硬化部位內皮細胞相關的改變。在過去的數十年中，應用配體修飾的微泡的超聲分子成像技術在動脈粥樣硬化病變區(qū)域識別活化受損的內皮細胞取得了很大的進展，使用靶向成像可直接可視化動脈粥樣硬化炎癥及免疫反應的分子或細胞成分。

2.1 內皮細胞相關分子作為靶向檢測目標

血管腔內血流的變化產生的應變導致內皮細胞的損傷是目前公認的促動脈粥樣硬化因素。連接黏附分子A(junctional adhesion molecule A，JAM-A)被證明是對血流急性變化最敏感的生物標志物，在依賴于血流變化動脈粥樣硬化的好發(fā)部位的內皮細胞上特異性上調，繼而促進單核細胞在血管壁的募集和積累。Curaj等[7]應用可與活化的內皮細胞的JAM-A靶向結合的微泡MBJAM-A對小鼠動脈粥樣硬化模型進行超聲分子成像，發(fā)現MBJAM-A可與活化的內皮細胞上的JAM-A特異結合，從而早期識別動脈粥樣硬化炎性內皮功能障礙。血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)在血管內皮細胞表面或潛在的血管脈管上表達，參與動脈粥樣硬化初始階段單核細胞和T淋巴細胞向內皮細胞的募集和黏附，是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程的關鍵分子之一。因而VCAM-1是分子成像的理想靶標。Kaufmann等[8]應用靶向結合VCAM-1的納米微泡增強劑能快速量化在動脈粥樣硬化不同階段發(fā)生的血管炎性變化。P選擇素也是調節(jié)動脈粥樣硬化過程中白細胞募集的關鍵內皮黏附分子，在動脈粥樣硬化易發(fā)病變部位早期出現，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生。Kaufmann等[9]通過超聲分子成像技術同時靶向顯示VCAM-1和P選擇素，從而實現了在內膜黃瘤(脂肪條紋)發(fā)生之前，炎性細胞進入血管壁時檢測到動脈粥樣硬化血管炎癥的存在和發(fā)生，早期檢測到動脈粥樣硬化啟動事件，為動脈粥樣硬化的早期篩查和危險分層提供了方法。

在動脈粥樣硬化的進展階段，識別高風險的動脈粥樣硬化斑塊對于指導管理和預防嚴重的心血管事件的發(fā)生至關重要。血小板聚集和黏附是通過血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)Ⅰb-Ⅸ-Ⅴ復合物與已經構象激活的血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)的A1域相互作用。vWF的活化是通過黏附于基質蛋白、高剪切應力或vWF多聚化失調來促進的。因此，活化vWF的靶向成像可檢測導致動脈粥樣硬化血栓并發(fā)癥的首發(fā)事件，或檢測炎癥環(huán)境，因為短暫的血小板黏附促進內皮細胞活化。GPⅠb與vWF之間的相互作用是血栓形成早期的高親和力事件，即使在高剪切應力的情況下也能促進細胞的募集。McCarty等[10]應用可與血管內皮上活化的vWF靶向結合的含重組GPⅠbα微泡的超聲造影劑靶向檢測不穩(wěn)定斑塊。他們在LDLR-/-/Apobec-1-/-基因敲除小鼠中，驗證了靶向結合活化vWF的分子成像技術可檢測高危的晚期動脈粥樣硬化斑塊。該研究提供了vWF作為動脈粥樣硬化危險分層的分子影像學靶點的證據，并可用于預測斑塊不穩(wěn)定血栓形成等高危事件的發(fā)生。Moccetti等[11]通過與內皮細胞表面的黏附分子特異性結合的小分子肽配體進行內皮細胞的靶向超聲成像，在晚期動脈粥樣硬化的小鼠模型中，通過靶向結合斑塊內皮細胞的標志物(包括P選擇素、VCAM-1、氧化型低密度脂蛋白受體-1和vWF)進行超聲分子成像，證明其檢測高風險的晚期動脈粥樣硬化斑塊的可行性。而為了克服在大動脈血管中靶向微泡的細胞黏附不足，Yan等[12]通過將VCAM-1和細胞間黏附分子-1抗體以及合成的聚合sialyl Lewis X同時整合到微泡的表面，設計了同時與VCAM-1/細胞間黏附分子-1/P選擇素結合的微泡MBVIS。MBVIS與炎性內皮細胞具有良好的親和力，使其具有比單靶標或雙靶標以及對照微泡更加顯著的優(yōu)勢，可監(jiān)測動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展或評估藥物干預成效。

急性冠狀動脈綜合征或不穩(wěn)定型心絞痛患者血小板聚集率及循環(huán)血小板表面GPⅡb/Ⅲa表達均高于穩(wěn)定型心絞痛或健康志愿者。因此，GPⅡb/Ⅲa受體是動脈粥樣硬化斑塊中聚集血小板的潛在標志物。含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartic acid，RGD)序列的肽對GPⅡb/Ⅲa具有高度的黏附性。Guo等[13]研制了一種cRGD修飾的微泡(MB-cRGD)，它能與活化血小板上的GPⅡb/Ⅲa特異性地結合。他們應用MB-cRGD微泡靶向顯示黏附和聚集在內皮細胞表面的活化的血小板，證明GPⅡb/Ⅲa受體可作為動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性的生物標志物，用于超聲分子成像檢測。

2.2 通過靶向檢測血管新生的超聲分子成像

作為動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生發(fā)展和不穩(wěn)定性的先決因素，斑塊內血管新生和滋養(yǎng)血管已引起廣泛的關注，并且已被確定為斑塊內出血和斑塊破裂的獨立預測因子。在動脈粥樣硬化斑塊的內膜下通常存在大量的新生血管，促進動脈粥樣硬化的進展并引起臨床癥狀。對斑塊內新生血管的成像可顯示斑塊的生物學特性，有助于動脈粥樣硬化的危險分層。

血管內皮生長因子是由血管壁的內皮細胞和平滑肌細胞分泌的參與血管新生和血管通透性的主要分子。血管內皮生長因子受體-2是血管內皮生長因子在血管發(fā)育中發(fā)揮重要作用的主要受體，促進動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展。Liu等[14]使用可與血管內皮生長因子受體-2靶向結合的微泡成功地檢測到兔腹主動脈不穩(wěn)定斑塊，證明血管內皮生長因子作為靶向分子在超聲分子成像技術中評估動物模型易損斑塊的可行性。玻璃粘連蛋白受體整聯蛋白αvβ3是內皮活化的潛在標志物，在新生血管和易損斑塊中多見，與斑塊的外膜滋養(yǎng)血管以及斑塊內血管新生明顯相關。Daeichin等[15]使用抗avβ3整合素的生物素化抗體的靶向微泡無創(chuàng)地評估ApoE-/-小鼠頸動脈斑塊部位外膜滋養(yǎng)血管的特征。與血管新生相關的炎癥以及此過程中涉及的炎癥因子被廣泛認為是衡量動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的指標，而白介素-8是由巨噬細胞、單核細胞和內皮細胞分泌的炎癥因子，它是動脈粥樣硬化斑塊病變部位與炎癥反應相關的重要的血管生成因子，可促進動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生和發(fā)展。Lu等[16]合成了帶有白介素-8多克隆抗體的SonoVue微泡檢測兔腹主動脈粥樣硬化斑塊，證明該分子診斷技術更容易檢測到斑塊的存在以及斑塊的特征，尤其是斑塊滋養(yǎng)血管的情況，有望成為一種非常有價值的診斷方法。目前動物模型研究成功通過靶向結合活化內皮細胞相關的黏附分子或炎癥因子的超聲分子成像，檢測動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展以及識別易損斑塊。

3 超聲分子靶向治療方面的進展

超聲分子治療，通過微泡進行藥物和基因遞送是最新研究的熱點。通過藥物和微泡的共注射或通過將試劑摻入微泡，應用超聲脈沖控制微泡的破壞，聲孔效應和空化效應能提高細胞膜的通透性，從而使藥物或治療基因可精確高效地在靶組織釋放，提高了藥物的利用率或基因干預的有效率。目前很多臨床前研究成功地證實靶向微泡破壞技術在改善心肌梗死后心功能、促進心肌細胞再生和減少心肌組織的再灌注損傷等治療方面的可行性。也有部分研究[17-19]通過靶向微泡破壞技術基因治療高血壓以及糖尿病心肌病。在急性血管事件的抗栓治療方面，Wang等[20]設計了一種新型的治療性微泡，將重組纖溶藥物、回聲增強微泡和活化血小板特異性單鏈抗體結合在一起。他們在使用氯化鐵誘導的小鼠頸動脈血栓模型中，測試了這種治療性微泡在超聲微泡成像以及靶向溶栓治療中的效果。證明了這種技術能同時進行血栓的診斷和治療，以及溶栓成敗的監(jiān)測。但目前為止，尚無靶向微泡破壞技術在抑制動脈粥樣硬化進展、促進斑塊消退以及穩(wěn)定易損斑塊方面的相關研究。

4 超聲分子成像技術靶向診療動脈粥樣硬化的發(fā)展方向和應用前景

動脈粥樣硬化通常是一種慢性炎癥性疾病，早期病變通常是無癥狀的，且檢測困難。炎癥在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，研發(fā)新的策略以便更敏感地檢測和早期預防動脈粥樣硬化，以及早期識別不穩(wěn)定斑塊阻止其進一步糜爛破裂是未來的發(fā)展方向。目前動脈粥樣硬化的治療并不能有效地消除或逆轉斑塊[21]，同樣在動脈粥樣硬化血栓形成后，也需探索新的無嚴重副作用的藥物治療方式，以迅速有效地溶解血栓。近年來通過對分子影像學診斷和治療相結合方法的研究，為解決動脈粥樣硬化疾病提供了潛在的機會。超聲靶向分子治療可將治療藥物精準地運送到病變部位，與全身給藥相比，減少藥物劑量從而減少全身用藥時經常發(fā)生的副作用。Wang等[22]研究顯示應用與活化的血小板特異性結合的GPⅡb/Ⅲa靶向微泡的超聲分子成像可動態(tài)觀察急性動脈血栓形成的圖像，并且可實時監(jiān)測體內藥物溶栓的成功或失敗。超聲分子診療法有望成為治療心血管疾病的個性化藥物的解決方案。

5 目前臨床轉化的局限性

超聲分子診療具有巨大潛力，在臨床前的研究中，微泡可與不同的靶向配體結合，用來檢測心肌缺血、血栓形成，并評估動脈粥樣硬化不同階段的斑塊在細胞水平的生物學特征。但臨床應用的轉化還是面臨很多困難，微泡在人體循環(huán)系統的作用時間限制了微泡與目標結合的時間跨度，由于動脈內的生理性高血流速度，微泡在作用靶點的滯留時間相對較短，超聲很難探測到較大的血管部位。目前仍缺少有效的可安全使用的臨床傳遞系統，需開發(fā)可安全用于人體的可結合化學分子和配體的相關造影劑等。另外仍需優(yōu)化治療參數，因為嚙齒動物中已描述了許多不良事件，例如微血管滲漏、心臟內溶血、毛細血管破裂或炎性細胞浸潤。