謝雨宸 鄒雪梅 李紅穎 仁真旺甲 李慧林 范 剛* 張 藝

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都 611137

超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS)具有高質(zhì)量精度、高靈敏度、高分辨率的特點(diǎn)，對(duì)藥用植物中的復(fù)雜化學(xué)成分具有很強(qiáng)的分辨能力，可實(shí)現(xiàn)快速鑒別[5]。因此，本研究擬采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術(shù)對(duì)細(xì)葉亞菊的化學(xué)成分進(jìn)行全面分析，為明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和建立質(zhì)量控制方法奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 VanquishTM， 超高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo-Fisher公司)，Q-Exactive Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo-Fisher公司)，Sartorius BSA124S型電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，Compound Discoverer 3.0工作站(美國(guó)Thermo-Fisher公司)，CQ-250超聲清洗器(上海必能信有限公司)，TDZ5-WS臺(tái)式低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.2 材料 色譜級(jí)乙腈和甲醇購(gòu)于美國(guó)Fisher公司；色譜級(jí)甲酸和分析級(jí)甲醇試劑購(gòu)于成都市科隆化學(xué)品有限公司；水為屈臣氏蒸餾水。細(xì)葉亞菊藥材采自四川省阿壩州若爾蓋縣班佑鄉(xiāng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)龍飛老師鑒定為菊科亞菊屬細(xì)葉亞菊Ajaniatenuifolia(Jacq.) Tzvel.的干燥地上部分。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 取細(xì)葉亞菊粉末約1 g，精密稱(chēng)定，置50 mL錐形瓶中，精密加入純甲醇20 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心(11000 r/min，10 min)，取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2 色譜條件及質(zhì)譜條件 色譜條件：Agilent Eclipse Plus C18柱(4.6×100 mm,1.8 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-0.1%甲酸溶液(B)；梯度洗脫程序(0～10 min，8%～15%；10～25 min，15%～30%；25～35 min，30%～45%；35～45 min，45%～65%；45～50 min，65%～80%；50～55 min，80%～95%)；流速0.3 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：采用HESI離子源，正、負(fù)離子模式檢測(cè)，正離子檢測(cè)模式，噴霧電壓+3500 V；負(fù)離子檢測(cè)模式，噴霧電壓-3000 V，鞘氣流速35.0 Arb，輔助氣流速10.0 Arb，毛細(xì)管溫度320 ℃；采用Full MS/dd-HRMS2掃描模式，F(xiàn)ull MS分辨率70000，dd-HRMS2分辨率17500，掃描范圍m/z 100～1500。

2.3 數(shù)據(jù)處理及分析 按照2.2項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣，將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Xcalibur 2.0軟件進(jìn)行擬合，以實(shí)際測(cè)得的相對(duì)分子質(zhì)量與理論相對(duì)分子質(zhì)量二者偏差<5×10-6的原則，確定各色譜峰對(duì)應(yīng)化合物的分子式，并與Compound Discover 3.0化合物分析鑒定軟件和自建本地庫(kù)mzCloud和mzVault相匹配，初步對(duì)高分辨質(zhì)譜下獲取的各成分進(jìn)行前期推測(cè)，再通過(guò)相關(guān)參考文獻(xiàn)、PubChem、SciFinder等數(shù)據(jù)庫(kù)提供的相對(duì)保留時(shí)間及高能碰撞下產(chǎn)生的碎片離子信息，進(jìn)一步對(duì)細(xì)葉亞菊所含化學(xué)成分進(jìn)行準(zhǔn)確定性分析。

3 結(jié)果與分析

采用UPLC-Q-Executive Orbitrap MS技術(shù)對(duì)細(xì)葉亞菊供試品進(jìn)行正、負(fù)離子掃描，獲得正負(fù)離子流圖如圖1。本文共鑒定出35個(gè)色譜峰，其中包括16個(gè)黃酮類(lèi)、5個(gè)萜類(lèi)、5個(gè)香豆素類(lèi)、6個(gè)有機(jī)酸類(lèi)及3個(gè)其他類(lèi)化合物。結(jié)果見(jiàn)表1。

(A)正離子 (B)負(fù)離子圖1 細(xì)葉亞菊的正離子(A)和負(fù)離子(B)模式總離子流圖

表1 細(xì)葉亞菊在正負(fù)離子模式下化學(xué)成分鑒定結(jié)果

表1(續(xù))

表1(續(xù))

3.1 黃酮類(lèi)成分的鑒定 研究從細(xì)葉亞菊中共鑒定出16種黃酮類(lèi)成分，主要包括黃酮苷、黃酮醇兩種類(lèi)型。黃酮苷類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)主要是與葡萄糖或鼠李糖等形成氧苷，在質(zhì)譜高能碰撞下，連續(xù)斷裂苷鍵，丟失糖基，生成高強(qiáng)度的黃酮苷元碎片，二級(jí)黃酮苷元質(zhì)譜主要裂解方式有-CO、-CO2、C2H2O、H2O等中性離子的丟失以及黃酮苷元自身發(fā)生RDA裂解。以化合物15山奈酚-3-O-蕓香糖苷為例，保留時(shí)間為18.85 min，在正離子模式下，準(zhǔn)分子離子為[M+H]+m/z 595.1656，經(jīng)Xcalibur 2.0擬合分子式為C27H30O15，在高能碰撞離子作用下獲得主要二級(jí)碎片離子信息為m/z 449.1069、287.0544、153.0180，分別對(duì)應(yīng)[M+H-C6H10O4]+、[M+H-C6H10O4-C6H10O5]+、[M+H-C6H10O4-C6H10O5-C8H6O2]+碎片離子。根據(jù)該化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、斷裂方式，并與文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行比對(duì)后，最終確定該化合物為山奈酚-3-O-蕓香糖苷，其質(zhì)譜裂解途徑如圖2。

圖2 山奈酚-3-O-蕓香糖苷裂解途徑圖

3.2 萜類(lèi)化合物成分的鑒定 細(xì)葉亞菊中共鑒定出5種倍半萜類(lèi)化合物，其中有4種化合物為倍半萜內(nèi)酯，分別為化合物11、14、22和35。以化合物35-1,10β-epoxyachillin為例，保留時(shí)間為49.50 min，闡述其質(zhì)譜裂解規(guī)律。在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 263.1276[M+H]+，根據(jù)精確相對(duì)分子質(zhì)量可確定其分子式為C15H18O4，在正離子二級(jí)質(zhì)譜的碎片峰中給出m/z 245.1166、m/z 235.1326，分別對(duì)應(yīng)[M+H-H2O]+、[M+H-CO]+碎片離子。通過(guò)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)，確定該化合物為1,10β-epoxyachillin，二級(jí)質(zhì)譜圖及可能的裂解途徑如圖3。

圖3 1,10β-epoxyachillin裂解途徑圖

3.3 香豆素類(lèi)成分的鑒定 在細(xì)葉亞菊中共鑒定出5種香豆素類(lèi)成分，香豆素類(lèi)化合物是以苯駢α-吡喃酮為母核的衍生物，在苯環(huán)上常連有羥基、甲氧基、吡喃環(huán)、呋喃環(huán)等取代基。最大質(zhì)譜特征是吡喃酮環(huán)失羰基，常丟失如-CH3，-CO，-OH 等碎片。以化合物10濱蒿內(nèi)酯為例，保留時(shí)間為21.51 min，正離子模式下經(jīng)一級(jí)質(zhì)譜掃描得到準(zhǔn)分子離子m/z 207.0653[M+H]+，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的碎片離子主要有m/z 192.9733、164.9780、179.1422、151.1478、163.1113，分別對(duì)應(yīng)[M+H-CH3]+、[M+H-CH3-CO]+、[M+H-CO]+、[M+H-2CO]+、[M+H-CO2]+碎片離子。經(jīng)與文獻(xiàn)比對(duì)，該化合物與文獻(xiàn)中二級(jí)質(zhì)譜離子碎片信息一致，故鑒定為濱蒿內(nèi)酯。濱蒿內(nèi)酯正離子模式下的裂解途徑如圖4。

3.4 有機(jī)酸類(lèi)成分的鑒定 研究從細(xì)葉亞菊中共鑒定了6個(gè)有機(jī)酸類(lèi)化合物，以化合物6 綠原酸為例，保留時(shí)間為18.30 min，在負(fù)離子模式下形成準(zhǔn)分子離子m/z 353.0863[M-H]-，經(jīng)軟件擬合得到其分子式為C16H18O9；在二級(jí)質(zhì)譜中產(chǎn)生的碎片離子主要有m/z 191.0556、179.0350，分別對(duì)應(yīng)[M-H-C9H6O3]-、[M-H-C7H10O5]-碎片離子。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，確定化合物為綠原酸，其裂解途徑見(jiàn)圖5。

圖4 濱蒿內(nèi)酯裂解途徑圖

圖5 綠原酸裂解途徑圖

3.5 其他類(lèi)成分的鑒定 實(shí)驗(yàn)還從細(xì)葉亞菊中鑒定出3種其他類(lèi)化合物，分別為腺苷、香草醛和丁香酚。以化合物4腺苷為例，為核苷類(lèi)化合物，保留時(shí)間6.92 min，此類(lèi)化合物易丟失H2O、NH3等碎片離子，正離子模式下可見(jiàn)其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 268.1035，二級(jí)質(zhì)譜圖可見(jiàn)其先后產(chǎn)生m/z 136.0616[M+H-C5H8O4]+，m/z 119.0352[M+H-C5H8O4-NH3]+的碎片離子，結(jié)合參考文獻(xiàn)推斷其可能為化合物腺苷。

4 討論

研究對(duì)細(xì)葉亞菊提取物在質(zhì)譜正負(fù)離子模式下進(jìn)行掃描及初步分析，結(jié)果表明各成分在正負(fù)離子模式下的響應(yīng)強(qiáng)度具有明顯差異。因此，本研究按照各成分的理化性質(zhì)結(jié)合其在不同掃描模式下的質(zhì)譜響應(yīng)優(yōu)劣，最終選擇了響應(yīng)最佳時(shí)的離子模式作為檢測(cè)條件，使各待測(cè)物具有較好的響應(yīng)值和峰形，能夠滿(mǎn)足快速、準(zhǔn)確的定性要求。

研究首次采用具有高分辨率的UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS定性技術(shù)全面分析了藏藥細(xì)葉亞菊中的化學(xué)成分，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，共鑒定了35種化學(xué)成分，包括已有文獻(xiàn)[3]報(bào)道的槲皮素、木犀草素、綠原酸和金腰乙素，并首次鑒定出濱蒿內(nèi)酯、柳穿魚(yú)黃素、橙皮內(nèi)酯、東莨菪內(nèi)酯、三葉豆苷、薊黃素等19種化學(xué)成分，這些研究結(jié)果可為細(xì)葉亞菊藥材的質(zhì)量控制及其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。然而，由于質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)不完整、細(xì)葉亞菊基礎(chǔ)研究薄弱缺乏參考數(shù)據(jù)等原因，仍然有18個(gè)主要色譜峰(保留時(shí)間分別為10.02 min、15.00 min、15.08 min、17.00 min、18.08 min、21.48 min、23.48 min、25.78 min、30.50 min、33.40 min、36.98 min、41.00 min、41.40 min、44.00 min、44.80 min，45.50 min、46.54 min、48.00 min)未得到準(zhǔn)確的鑒定。因此，今后應(yīng)結(jié)合制備型高效液相色譜、二維核磁共振等技術(shù)，加強(qiáng)細(xì)葉亞菊藥材的化學(xué)成分分離及分析研究工作，促進(jìn)其質(zhì)量控制及開(kāi)發(fā)利用。