張鴻娟 綜述，單 斌△ 審校

1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，云南昆明 650032；2.云南省醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)臨床研究中心，云南昆明 650032；3.云南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650032

細(xì)菌耐藥(AMR)是全球公共健康領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)，世界衛(wèi)生組織(WHO)要求各國(guó)積極行動(dòng)，采取系統(tǒng)性措施遏制AMR，否則感染性疾病將成為嚴(yán)重威脅人類健康與生命安全的首要因素?？刂艫MR是醫(yī)療機(jī)構(gòu)主要的工作內(nèi)容之一，是醫(yī)療機(jī)構(gòu)質(zhì)量評(píng)價(jià)和評(píng)級(jí)的指標(biāo)之一。近年來多重耐藥細(xì)菌檢出率，尤其是革蘭陰性菌的檢出率呈快速上升趨勢(shì)，且革蘭陰性菌中腸桿菌目細(xì)菌占比非常高，超過60%[1-2]。腸桿菌目細(xì)菌中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注對(duì)第三代頭孢菌素或碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的細(xì)菌[3]。碳青霉烯類抗菌藥物具有良好的通透性和光譜抗菌活性，被認(rèn)為是治療腸桿菌目細(xì)菌感染的最后一道防線[4]。隨著碳青霉烯類藥物的廣泛運(yùn)用，耐碳青霉烯類腸桿菌(CRE)檢出率不斷升高。2020年中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)(CHINET)結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌對(duì)美羅培南的耐藥率為24.2%，對(duì)亞胺培南的耐藥率為23.2%，雖然與2018年相比呈下降趨勢(shì)，但是與2005年3.0%和2.9%的耐藥率相比，增長(zhǎng)率高達(dá)7倍[2]。 不恰當(dāng)?shù)目垢腥局委煏?huì)影響患者的治療結(jié)局。根據(jù)不同碳青霉烯酶的特征開展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，有助于精準(zhǔn)的抗感染治療方案的制訂。因此，準(zhǔn)確、快速地對(duì)CRE產(chǎn)生的碳青霉烯酶進(jìn)行檢測(cè)分型，在抗感染方案的制訂、醫(yī)院感染防控方面具有重要的價(jià)值。碳青霉烯酶酶型/耐藥基因檢測(cè)的方法按檢測(cè)的結(jié)果分為表型檢測(cè)和基因型檢測(cè)。本文主要介紹可以在2 h以內(nèi)完成碳青霉烯酶酶型/耐藥基因檢測(cè)的方法。

1 CRE概述

CRE導(dǎo)致的感染病死率高。我國(guó)CRE血流感染30 d內(nèi)的病死率為46.2%[5]。在血液病患者中，CRE導(dǎo)致的血流感染病死率甚至高達(dá)77.3%[6]。編碼碳青霉烯酶的基因通常位于可移動(dòng)的元件上，如質(zhì)粒、整合子、插入序列等，易在細(xì)菌間橫向傳播[7]。CRE菌株常同時(shí)攜帶其他的耐藥基因，導(dǎo)致多重耐藥菌株，甚至全耐藥菌株的出現(xiàn)。目前，我國(guó)的CRE菌株主要分離自住院患者，但是該類菌株存在社區(qū)播散的可能性，需要高度重視。CRE的流行病學(xué)特征是醫(yī)院獲得性病原體傳播的典型模式。醫(yī)療器械的使用、碳青霉烯酶類抗菌藥物的使用、侵入性醫(yī)療操作、ICU入住史等均為醫(yī)院獲得性CRE的風(fēng)險(xiǎn)因素[8]。CRE定植或感染患者的流動(dòng)造成了醫(yī)療機(jī)構(gòu)的CRE暴發(fā)。對(duì)ICU患者進(jìn)行進(jìn)入病房前篩查，同時(shí)對(duì)產(chǎn)碳青霉烯酶菌株(CPO)檢測(cè)陽(yáng)性的患者分區(qū)隔離，能夠有效地降低CPO的感染率[9]。在器官移植中，對(duì)移植受者在接受移植或化療前進(jìn)行CRE直腸定植篩查，對(duì)供者進(jìn)行CRE直腸定植篩查，能夠有效地降低移植后CRE的感染率[10]。目前，臨床醫(yī)生只能通過藥敏結(jié)果判定腸桿菌目細(xì)菌是否為CRE，但不能對(duì)其耐藥機(jī)制做出判定。

產(chǎn)碳青霉烯酶是腸桿菌目細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥最主要的機(jī)制[11]，其他耐藥機(jī)制包括產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBL)和(或)產(chǎn)AmpC酶合并外膜孔蛋白表達(dá)下調(diào)或缺失，但占比較低。碳青霉烯酶是一種能水解碳青霉烯類抗菌藥物(如厄他培南、多尼培南、亞胺培南和美羅培南)的β內(nèi)酰胺酶。通常情況下，碳青霉烯酶也可水解β內(nèi)酰胺類抗菌藥物，如青霉素類、β內(nèi)酰胺類/酶抑制復(fù)合制劑、單酰胺環(huán)類和頭孢菌素類等，所以CPO對(duì)所有β內(nèi)酰胺藥物均耐藥[11]。

根據(jù)β內(nèi)酰胺酶底物譜、抑制劑譜、序列同源性的不同，建立了兩個(gè)內(nèi)酰胺酶分類系統(tǒng)，將其分為Ambler類(即基于氨基酸序列同源性的A、B、C和D類)和Bush-Jacoby-Medeiros組(即基于底物和抑制劑譜的第1、2、3和4組)，其中Ambler 分子分類方法更常用。按照 Ambler 分子分類方法，碳青霉烯酶可分為A、B、D 3類[12]。A類為絲氨酸碳青霉烯酶，B類為金屬β內(nèi)酰胺酶，D類為絲氨酸碳青霉烯酶。目前，我國(guó)臨床分離的CRE菌株產(chǎn)生的碳青霉烯酶以A類KPC型、B類NDM型和D類OXA-48 型為主。不同種類的抗菌藥物對(duì)不同CPO的抗菌活性不同[5]，如頭孢他啶-阿維巴坦對(duì)產(chǎn) KPC和OXA-48型絲氨酸CPO具有高度抗菌活性，但對(duì)產(chǎn)金屬β內(nèi)酰胺酶菌株無抗菌活性[13]。

2 表型檢測(cè)法

表型檢測(cè)法通過對(duì)CRE產(chǎn)生的碳青霉烯酶酶型進(jìn)行檢測(cè)，常用的膠體金免疫層析法與基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDITOF MS) 能夠在2 h內(nèi)完成碳青霉烯酶酶型檢測(cè)。

2.1膠體金免疫層析法 膠體金免疫層析法是近年發(fā)展起來的一種快速檢測(cè)CRE中碳青霉烯酶酶型的方法[14]。該技術(shù)體外定性檢測(cè)培養(yǎng)后可獲取細(xì)菌標(biāo)本產(chǎn)KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM型碳青霉烯酶的情況。方法為將待測(cè)菌落和提取緩沖液在EP管中進(jìn)行混合，混合液加入檢測(cè)卡的標(biāo)本孔后，待測(cè)菌落中的KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM型碳青霉烯酶與膠體金結(jié)合墊上的碳青霉烯酶單克隆抗體反應(yīng)，形成相應(yīng)的“抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物”，在層析作用下沿著硝酸纖維素膜移動(dòng)，被固定在檢測(cè)卡檢測(cè)線上的 KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM型碳青霉烯酶單克隆抗體捕獲，形成“抗體-抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物”，并在測(cè)試區(qū)相應(yīng)檢測(cè)線上出現(xiàn)一條或多條紅線?；旌衔镏卸嘤嗟慕饦?biāo)抗體移至檢測(cè)卡質(zhì)控線(C線)被連接生物素-BSA的羊抗鼠多克隆抗體捕獲，形成質(zhì)控信號(hào)，即在C線上出現(xiàn)一條紅線。該方法具有檢測(cè)速度快、不需要特殊儀器、結(jié)果容易判讀的優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)能夠在30 min內(nèi)快速準(zhǔn)確地給出 KPC、OXA-48、VIM、IMP 和 NDM 結(jié)果，操作方便，結(jié)果可靠，同時(shí)能夠快速直接檢測(cè)血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本的CPO感染情況。有助于加速由CPO引起的血流感染的診斷和治療。該方法的不足之處為只能檢測(cè)靶向酶，對(duì)某些亞型及罕見酶型無法檢出。

2.2MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS 是近年發(fā)展起來的一種微生物種屬鑒定技術(shù)，該技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、成本低的優(yōu)勢(shì)。該方法根據(jù)不同細(xì)菌間質(zhì)譜峰強(qiáng)度，通過質(zhì)譜儀采集待檢標(biāo)本質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌種的圖譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)聚類分析，獲得鑒定結(jié)果[15]。在碳青霉烯酶酶型檢測(cè)中，通過待檢菌株與碳青霉烯類抗菌藥物(如亞胺培南和美羅培南)共同孵育，待測(cè)菌株如果產(chǎn)碳青霉烯酶，將會(huì)水解抗菌藥物，造成抗菌藥物的相對(duì)分子質(zhì)量發(fā)生變化，隨后使用MALDITOF MS進(jìn)行抗菌藥物的相對(duì)分子質(zhì)量的檢測(cè)，間接證明該菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶。該方法操作方便、通量高、耗時(shí)短，而且特異度和靈敏度較高，但是該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室的條件要求高，不僅需要質(zhì)譜儀，而且不能使用常規(guī)的微生物種屬鑒定分析軟件，需要專用的分析軟件，軟件價(jià)格昂貴，同時(shí)使用的碳青霉烯類抗菌藥物的種類、質(zhì)量、濃度及培養(yǎng)過程均會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果。該方法可以檢測(cè)目前已知的碳青霉烯酶，也可檢測(cè)尚未被發(fā)現(xiàn)的碳青霉烯酶，但是無法分辨碳青霉烯酶的具體類型，而且只能檢出產(chǎn)碳青霉烯酶的耐藥菌，可能會(huì)造成漏檢。

3 基因型檢測(cè)

基因型檢測(cè)方法通過對(duì)產(chǎn)碳青霉烯酶的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，如blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM、blaOXA-48耐藥基因，常用的方法有多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)、實(shí)時(shí)熒光PCR一體化平臺(tái)等。

3.1多重PCR法 PCR是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，能夠短時(shí)間內(nèi)、特異地?cái)U(kuò)增任何目的DNA。多重PCR又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，與普通PCR法相比，多重PCR反應(yīng)體系有兩對(duì)以上引物，可以同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)核酸片段，操作過程與普通PCR相同。碳青霉烯酶基因檢測(cè)主要使用多重PCR法，該方法可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多個(gè)編碼碳青霉烯酶基因進(jìn)行檢測(cè)。多重PCR檢測(cè)碳青霉烯酶基因時(shí)，通過一次擴(kuò)增多個(gè)常見耐藥基因，不僅提高了檢測(cè)效率，而且降低了檢測(cè)成本。同時(shí)有研究表明，使用多重PCR可有效減少非特異性擴(kuò)增，提高了檢測(cè)的特異性[16]。多重PCR能夠在2 h左右檢測(cè)出常見的5個(gè)編碼碳青霉烯酶的基因，但是對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件、工作人員要求高，不能檢測(cè)其他的碳青霉烯酶基因，可能會(huì)造成漏檢。

3.2LAMP LAMP是一種新的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，已廣泛用于檢測(cè)病毒、細(xì)菌和寄生蟲。該技術(shù)可以在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)核酸的體外擴(kuò)增[17]。LAMP通過針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物(FIP和BIP、F3和B3、LF和LB)，65 ℃擴(kuò)增30 min，通過比色變化觀察放大產(chǎn)物，或通過副產(chǎn)物(焦磷酸鎂)濁度的存在目測(cè)放大產(chǎn)物。在碳青霉烯酶基因檢測(cè)中，LAMP通過與凝膠電泳、濁度、SYBR green或calcein等方法結(jié)合測(cè)量副產(chǎn)物，從而實(shí)現(xiàn)碳青霉烯酶基因的檢測(cè)[18]。LAMP具有效率高、特異性強(qiáng)、速度快，以及在等溫條件下不需要使用復(fù)雜的精密熱循環(huán)器進(jìn)行溫度循環(huán)等優(yōu)點(diǎn)，但不能檢測(cè)碳青霉烯酶基因的變體，在產(chǎn)物檢測(cè)方面只有擴(kuò)增和不擴(kuò)增兩種結(jié)果，對(duì)靶序列長(zhǎng)度要求高，不能進(jìn)行長(zhǎng)鏈DNA的擴(kuò)增。

3.3實(shí)時(shí)熒光PCR一體化平臺(tái) 實(shí)時(shí)熒光PCR一體化平臺(tái)采用PCR 技術(shù)對(duì)主要的碳青霉烯酶基因進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了標(biāo)本制備、核酸提取和擴(kuò)增等功能為一體的自動(dòng)分析，檢測(cè)時(shí)間一般在1 h左右，檢測(cè)靈敏度和特異度均在96%以上。平臺(tái)設(shè)計(jì)了引物和探針用于檢測(cè)與革蘭陰性菌對(duì)碳青霉烯類藥物不敏感有關(guān)的blaKPC、blaoxa-48、blaIMP、blaNDM、blaVIM基因序列中的特有序列，以及用于監(jiān)測(cè)目標(biāo)細(xì)菌是否被正確處理，監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)中是否存在抑制劑的標(biāo)本處理質(zhì)控(SPC)是否在控，如GeneXper、Verigene和 Filmarray等系統(tǒng)[19]。該方法可以直接檢測(cè)臨床標(biāo)本，如直腸拭子、肛周拭子、純菌落，以及經(jīng)過簡(jiǎn)單處理的痰標(biāo)本，具有檢測(cè)快速(可直接從標(biāo)本中檢測(cè))和結(jié)果容易判讀的優(yōu)點(diǎn)，但缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴，需要特殊的試劑和設(shè)備，檢測(cè)特異性靶基因，若待測(cè)基因與目標(biāo)基因不同，則呈假陰性結(jié)果。這些基因序列的檢出不代表存在活的微生物，不能進(jìn)行細(xì)菌鑒定。該類試劑盒在國(guó)內(nèi)上市時(shí)間較晚，市面上價(jià)格較高，而且需要購(gòu)買特殊的儀器，可用于對(duì)特殊人群，如危重癥患者、移植患者的檢測(cè)。

4 小 結(jié)

碳青霉烯類抗菌藥物的抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)，對(duì)產(chǎn)ESBL腸桿菌科細(xì)菌具有很強(qiáng)的抗菌活性，被認(rèn)為是治療腸桿菌目細(xì)菌感染的最后一道防線[20]。隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，CRE在全球范圍內(nèi)的流行播散已成為公共健康領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。CRE所致感染具有“三高一快”的特點(diǎn)，即高病死率、高耐藥性、高傳播性、快速增長(zhǎng)。同時(shí)碳青霉烯酶耐藥基因可以通過質(zhì)粒介導(dǎo)，在不同種之間高度傳播，導(dǎo)致醫(yī)院、社區(qū)感染的暴發(fā)。國(guó)家、地區(qū)、醫(yī)院、人群及細(xì)菌的不同，檢出的碳青霉烯酶種類均有差異[21]。不同種類的抗菌藥物對(duì)不同CPO抗菌活性不同。有效而規(guī)范的治療方案是提高CRE感染救治率的關(guān)鍵[22]。面對(duì)這樣的“超級(jí)細(xì)菌”，快速診斷在控制院內(nèi)感染方面具有重要意義。在標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防的基礎(chǔ)上，通過檢測(cè)對(duì)確定或高度疑似多重耐藥菌感染患者或定植患者實(shí)施接觸隔離措施，可以有效遏制CRE在不同患者和不同區(qū)域間的流行播散。同時(shí)，應(yīng)開展耐藥性監(jiān)測(cè)，定期分析院內(nèi)CRE檢出率變化，為院內(nèi)感染控制提供數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。因此，快速進(jìn)行CRE碳青霉烯酶酶型或耐藥基因檢測(cè)，對(duì)于院內(nèi)感染預(yù)防控制、臨床抗感染治療方案制訂、改善患者結(jié)局具有重要的價(jià)值。