摘?要：在中學(xué)生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，利用數(shù)碼電子顯微鏡觀察青霉和匍枝根霉時(shí)，存在青霉菌觀察成功率較低的問題。針對(duì)實(shí)驗(yàn)存在的幾個(gè)難點(diǎn)，文章對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)，提出了解決青霉菌觀察成功率較低的實(shí)驗(yàn)方法。

關(guān)鍵詞：青霉;匍枝根霉;數(shù)碼電子顯微鏡;解決方法

“認(rèn)識(shí)和學(xué)習(xí)使用顯微鏡”章節(jié)在中學(xué)生物能級(jí)要求中，知識(shí)要求為A，技能要求為E，情感要求為H。所以在教學(xué)過程中，通過實(shí)驗(yàn)教學(xué)提高學(xué)生這三個(gè)層次的能級(jí)水平，是重要教學(xué)目標(biāo)。隨著教學(xué)硬件的改善，數(shù)碼電子顯微鏡（以下簡(jiǎn)稱“電鏡”）已經(jīng)步入很多學(xué)校。相比于普通光學(xué)顯微鏡，電鏡的觀察效果更加清晰，放大倍數(shù)更高，直接呈現(xiàn)學(xué)生的制片情況和觀察效果，極大方便了實(shí)驗(yàn)教學(xué)，提高了課堂效率，緊跟了多媒體時(shí)代的步伐。

《認(rèn)識(shí)真菌》是蘇教版七年級(jí)下冊(cè)第13章第2節(jié)《土壤中的微生物》中的內(nèi)容，其中學(xué)會(huì)初步觀察青霉（Penicillium）和匍枝根霉（Rhizopusstolonifer）是課堂能力目標(biāo)的重要要求?；趯?shí)驗(yàn)教學(xué)的原則，筆者嘗試自己培養(yǎng)和觀察這兩種霉菌。

一、 菌落培養(yǎng)

參照課本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)方法。

二、 鏡檢觀察

采用方法一對(duì)培養(yǎng)的匍枝根霉和青霉在電鏡下低倍鏡觀察。

方法一：

1. 取干凈的載玻片，在中央滴一滴清水;

2. 用解剖針輕挑樣品上少量菌落，用干凈的牙簽將樣品取下，涂在水滴中;

3. 蓋上蓋玻片，電鏡下低倍鏡觀察。

在觀察過程中發(fā)現(xiàn)，匍枝根霉菌落易培養(yǎng)，觀察效果極佳。電鏡下匍枝根霉菌落特征明顯，菌絲個(gè)體較大，臨時(shí)裝片的制作簡(jiǎn)單且觀察效果好，能夠快速地觀察到無橫隔的直立菌絲和頂端膨大的球狀孢子囊，形態(tài)典型。如果菌落培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，則可以觀察到黑色的孢子從孢子囊中散落出來的現(xiàn)象。

青霉菌落培養(yǎng)較為便捷，但實(shí)際鏡檢效果不佳，存在以下幾個(gè)問題：

問題1：完整的掃帚狀菌絲不容易發(fā)現(xiàn)

在培養(yǎng)青霉的過程中發(fā)現(xiàn)橘皮上有兩種不同的菌落形態(tài)（橘皮中間和周圍的兩種菌落），如下圖2。經(jīng)過文獻(xiàn)搜索，得知導(dǎo)致中間灰綠色菌落病害的是由意大利青霉（Penicilliumitalicum）引起的柑橘青霉病，導(dǎo)致周圍黃綠色菌落病害的是由指狀青霉（Penicilliumdigitatum）引起的柑橘綠霉病。

感染青霉病和綠霉病的柑橘，都先出現(xiàn)柔軟，褐色，水漬狀，略凹陷皺縮的圓形病斑。2～3天后，病部長(zhǎng)出白色霉層，青霉病產(chǎn)生的粉狀物藍(lán)色，白色霉?fàn)钗锖苷瑑H1-2毫米。腐爛的速度較慢，在17-21℃下，全果腐爛要半個(gè)月，有一股發(fā)霉氣味。綠霉病產(chǎn)生的粉狀物藍(lán)綠色，白色霉?fàn)钗飵л^寬，約8-18毫米，腐爛速度較快，在17-21℃下全果腐爛約要一星期，有芬香氣味。

由于兩種青霉菌的菌落形態(tài)不同，將兩種青霉屬菌分別放在電鏡下鏡檢觀察。采用方法一制作青霉臨時(shí)裝片觀察。

引起青霉病的意大利青霉菌分生孢子梗集結(jié)成束，解剖針挑取有針對(duì)性，鏡檢成功率較高，且分生孢子梗頂端有2-5個(gè)分枝，呈掃帚狀，為中學(xué)教材中典型的青霉的形態(tài)。引起綠霉病的指狀青霉分生孢子梗短，緊貼橘皮，取樣時(shí)很難取到完整的分生孢子梗和孢子囊，顯微鏡視野中全部覆蓋著散落的孢子，鏡檢成功率很低，且分生孢子梗頂端有1-2個(gè)分枝，掃帚狀形態(tài)不明顯。

因此將鏡檢成功率較高且菌落形態(tài)典型的意大利青霉菌種純化，接種到新的柑橘表皮（圖3）。2-3天后觀察到柑橘表面的意大利青霉分生孢子梗成束，約有3-5mm，1天后由白色菌落變成灰綠色。這樣的意大利青霉形態(tài)接近具有子實(shí)體的大型真菌，取樣時(shí)可以用鑷子夾取完整的一束觀察。

問題2：鏡檢時(shí)游離孢子多

青霉菌的分生孢子梗呈掃帚狀，上面著生成串的孢子，往往成熟后的孢子散落各處，因此在蓋蓋玻片后視野中游離的孢子較多（圖4），所以將制片方法改進(jìn)。采用方法二制作臨時(shí)青霉臨時(shí)裝片。

方法二：

1. 取干凈的載玻片，在中央滴一滴水;

2. 用鑷子夾取樣品上的少量青霉，用酒精浸泡3秒，洗去脫落孢子，再用蒸餾水沖洗一下;

3. 用干凈的牙簽將鑷子上的樣品放入載玻片的水滴中;

4. 蓋上蓋玻片，電鏡下觀察。

鏡檢成功率高達(dá)90%以上，觀察效果好。鏡檢效果如下圖5?？梢郧逦乜吹揭獯罄嗝咕姆稚咦庸５膾咧銧罘种熬z橫膈。

問題3：菌絲透明，不容易找到典型掃帚狀結(jié)構(gòu)

為了在實(shí)驗(yàn)課堂上讓學(xué)生更加快速及清晰地找到青霉菌的掃帚狀典型菌落，筆者進(jìn)行了菌絲染色實(shí)驗(yàn)。臨時(shí)裝片制作方法如方法三：

方法三：

1. 取干凈的載玻片，在中間滴一滴乳酸石碳酸棉藍(lán)染色液;

2. 用鑷子夾取樣品上的少量青霉，用酒精浸泡3秒，洗去脫落孢子，再用蒸餾水沖洗一下;

3. 用干凈的牙簽將鑷子上的樣品放入載玻片的水滴中;

4. 蓋上蓋玻片，電鏡下觀察。

鏡檢效果如圖6：

用染色劑染色處理后的意大利青霉菌在臨時(shí)裝片下能夠快速地找到完整的掃帚狀完整結(jié)構(gòu)，極大地節(jié)省了課堂實(shí)驗(yàn)時(shí)間，實(shí)驗(yàn)成功率顯著提高。

問題4：樣品容易挑到（夾到）橘皮或橘肉

本實(shí)驗(yàn)操作中還存在一個(gè)問題，在挑取或夾取菌絲的時(shí)候，容易沾上腐爛的橘皮或橘肉。此問題可以通過制作PDA（馬鈴薯葡萄糖）培養(yǎng)基代替橘皮來解決。PAD培養(yǎng)基偏硬，菌落容易挑取，不易沾上基質(zhì)。

通過以上方法，實(shí)驗(yàn)教師和學(xué)生能在課堂上快速地制取臨時(shí)裝片，成功觀察到匍枝根霉和青霉的典型結(jié)構(gòu)，達(dá)到本節(jié)課教學(xué)內(nèi)容的要求。

參考文獻(xiàn)：

[1]徐來.初中生物學(xué)習(xí)能力自測(cè)[M].蘇州：蘇州大學(xué)出版社，2017.

[2]閔曉芳.柑橘采后致病青霉的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

作者簡(jiǎn)介：竇佩娟，江蘇省蘇州市，江蘇省常青藤實(shí)驗(yàn)中學(xué)。