盧亞楠，劉思瓏，麻雨晴，劉夢(mèng)琪，齊 悅

(北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部，北京 100094)

引言

伴隨著全球老齡化加劇，世界范圍內(nèi)患癌患者的人數(shù)不斷上升，中國(guó)作為人口大國(guó)，無(wú)論是患癌患者還是因癌癥死亡的人數(shù)都不容小覷。在世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)中顯示，2020年全球癌癥死亡病例996萬(wàn)例，其中中國(guó)新發(fā)癌癥457萬(wàn)人，將近占全球的24%，而肺癌死亡人數(shù)就高達(dá)180萬(wàn)例，遠(yuǎn)超其他癌癥類(lèi)型，位居因癌癥死亡人數(shù)第一。

根據(jù)病理組織不同，肺癌具體分為非小細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌兩種。非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌的85%，主要分為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌三個(gè)亞型。與小細(xì)胞癌相比，非小細(xì)胞肺癌癌細(xì)胞生長(zhǎng)分裂較慢，擴(kuò)散轉(zhuǎn)移相對(duì)較晚，因此約75%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，5年生存率不足30%，手術(shù)治療效果不理想，只能進(jìn)行以化療為主的綜合性治療。

PRDM14(正性調(diào)節(jié)區(qū)鋅指蛋白14)作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是PRDM家族成員之一，與細(xì)胞的增殖調(diào)控、分化、發(fā)育等密切相關(guān)，癌癥以及一些其他疾病也與該因子異常有關(guān)。PRDM14在N端有1個(gè)PR結(jié)構(gòu)域，在C端有6個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，含有的SET蛋白結(jié)構(gòu)域已經(jīng)檢測(cè)到組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，可以對(duì)靶基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行直接修飾，以此來(lái)實(shí)現(xiàn)基因的表達(dá)調(diào)控 。

劉冰冰等研究發(fā)現(xiàn)隨著肺癌細(xì)胞分化程度的升高，PRDM14的表達(dá)水平也升高，推測(cè)PRDM14在肺癌發(fā)生的早期起作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖，在肺癌發(fā)展到嚴(yán)重分化不良時(shí)，可能由于PR域的CpG島甲基化使mRNA表達(dá)受到抑制，引起了其蛋白表達(dá)的下調(diào)。另利用Western blot技術(shù)檢測(cè)了PRDM14蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示PRDM14蛋白的表達(dá)在肺鱗癌和腺癌中均高于癌旁正常組織，而且與非小細(xì)胞癌的分化程度有關(guān)，這提示我們PRDM14在非小細(xì)胞肺癌早期起著重要的作用。

Zhang等分析了手術(shù)切除后非小細(xì)胞肺癌病人PRDM14的表達(dá)水平與其預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果顯示PRDM14在35.65 %的原發(fā)腫瘤樣本中表達(dá)增加，在39.68 %的伴有淋巴轉(zhuǎn)移的樣本中表達(dá)增加，PRDM14表達(dá)的增加與腫瘤細(xì)胞的分化程度顯著相關(guān)(p= 0.008)。因此，PRDM14可能成為非小細(xì)胞肺癌不良預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。

近年來(lái)精準(zhǔn)醫(yī)療的快速發(fā)展，基因靶向治療是近年來(lái)新興的治療手段，具有特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞并殺死腫瘤細(xì)胞，對(duì)其他細(xì)胞危害較少等優(yōu)點(diǎn)。靶向治療為非小細(xì)胞癌提供了新的治療手段，PRDM14基因有望成為非小細(xì)胞肺癌早期診斷和預(yù)后評(píng)估的新靶點(diǎn)。

本研究通過(guò)克隆人PRDM14基因，構(gòu)建真核過(guò)表達(dá)載體后轉(zhuǎn)染人的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，得到高表達(dá)PRDM14的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，該細(xì)胞株不僅可以為后續(xù)非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展以及耐藥性等相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)材料，還可以為后續(xù)靶向治療非小細(xì)胞肺癌的方法探尋奠定理論基礎(chǔ)。

一、實(shí)驗(yàn)材料

(一)實(shí)驗(yàn)耗材

NCI-H1975肺腺癌細(xì)胞系為中藥與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心細(xì)胞房?jī)龃?；無(wú)水乙醇、異丙醇、1×TBE緩沖液、6×Loading Buffer、氨芐抗生素、LB培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、二甲基亞砜、1×TBST、脫脂奶粉、pcDNA3.1質(zhì)粒和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞等均購(gòu)自北京愛(ài)科嘉生物科技有限公司。其余實(shí)驗(yàn)耗材見(jiàn)表1所列。

表1 實(shí)驗(yàn)耗材及品牌

(二)主要儀器

實(shí)驗(yàn)使用的主要儀器見(jiàn)表2。

表2 主要儀器及型號(hào)

二、實(shí)驗(yàn)方法

(一)PRDM14引物設(shè)計(jì)和基因擴(kuò)增

在NCBI上獲取人的PRDM14 cDNA序列(基因序列號(hào)：NM_024504.4)，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)上游引物F：5’-TAGTCCAGTGTGGTGGAATTCATGGCTCTACCCCG-3’和下游引物R：5’-ACGGGCCCTCTAGEACTAGTAGTCTTCATGAAACTTCATGTGG-3’，引物中含有載體同源臂序列。以人的胚胎干細(xì)胞cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到PRDM14。

PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 min，94℃變性15 s，56℃退火5 s，72℃延伸90 s，循環(huán)30次，72℃終延伸5 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物條帶，參照Magen凝膠DNA小量回收試劑盒的方法進(jìn)行回收純化。

(二)重組載體的構(gòu)建

用EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切pcDNA3.1載體質(zhì)粒，用膠回收試劑盒回收質(zhì)粒并實(shí)行純化。利用諾維贊同源重組試劑盒，建立目的片段PRDM14與pcDNA3.1載體的無(wú)縫克隆連接體系，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于氨芐抗性平板上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑選單克隆菌落，搖菌后進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，選擇經(jīng)電泳驗(yàn)證條帶正確的菌液送生物公司測(cè)序。參照Magen去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。

(三)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H1975細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)70%-80%時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前換液。取一個(gè)潔凈無(wú)菌離心管，向待轉(zhuǎn)染的六孔板中每孔的NCI-H1975細(xì)胞加入125 μL不含抗生素和血清的DMEM培養(yǎng)液，加入2.5 μL質(zhì)粒DNA，并用槍輕輕吹打混勻；再加入4 μL Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑，用槍輕輕吹打混勻后加入6孔板中，培養(yǎng)48 h。設(shè)立空白對(duì)照組、pcDNA3.1空載體對(duì)照組及pcDNA3.1-prdm14過(guò)表達(dá)組。

(四)Western blot

用蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，100℃水浴10 min，使其變性后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用一抗稀釋液以1∶4000比例稀釋GAPDH Mouse Monoclonal Antibody和Anti-PRDM14，4℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次，每次5 min；再加以1∶4000比例稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗，室溫輕搖1 h；TBST洗膜3次，每次5 min；采用化學(xué)發(fā)光法顯色，將發(fā)光液A和B按等體積混合，均勻滴加在PVDF膜上，孵育1 min，在顯影儀中進(jìn)行顯影并拍照。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(一)PCR擴(kuò)增PRDM14基因電泳結(jié)果

人的PRDM14 CDS全長(zhǎng)為1716 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，條帶大小與預(yù)期大小一致，可以進(jìn)行膠回收純化，得到目的基因片段。

圖1 PCR擴(kuò)增得到PRDM14目的基因

(二)pcDNA3.1質(zhì)粒雙酶切電泳結(jié)果

pcDNA3.1質(zhì)粒圖譜如圖2所示，通過(guò)建立酶切反應(yīng)體系進(jìn)行雙酶切，獲得線性化載體片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，雙酶切產(chǎn)物條帶位置與原始質(zhì)粒線性條帶位置一致，說(shuō)明酶切完全，可以進(jìn)行膠回收，得到高濃度的線性化載體片段。

圖2 pcDNA3.1質(zhì)粒圖譜

圖3 載體雙酶切電泳鑒定

(三)過(guò)表達(dá)PRDM14真核表達(dá)載體的構(gòu)建

通過(guò)酶切連接的方式將PRDM14片段重組到pcDNA3.1載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成pcDNA3.1-prdm14的重組載體。經(jīng)過(guò)大腸桿菌擴(kuò)增和菌液PCR鑒定，PCR鑒定時(shí)選擇載體上的T7位點(diǎn)設(shè)計(jì)上游引物，在插入目的基因片段上設(shè)計(jì)下游引物，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果如圖4所示，在217 bp處有單一條帶的即為陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性克隆菌測(cè)序鑒定正確。提取重組質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果如圖5所示，條帶位置在7100 bp左右，與預(yù)期一致，測(cè)定其濃度為596 ng/μL。

圖4 菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆

圖5 重組質(zhì)粒電泳結(jié)果

(四)Western Blot檢測(cè)PRDM14蛋白的表達(dá)

復(fù)蘇培養(yǎng)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H1975，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度達(dá)70%，以合適密度接種至細(xì)胞培養(yǎng)板。利用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒回收重組質(zhì)粒pcDNA3.1-prdm14，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒至細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞并提取蛋白質(zhì)。經(jīng)過(guò)Western Blot檢測(cè)分析，目的蛋白PRDM14在NCI-H1975細(xì)胞中可以正常表達(dá)(如圖6所示)。

圖6 Western Blot 檢測(cè)PRDM14蛋白的表達(dá)

結(jié)語(yǔ)

肺癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率長(zhǎng)居前列，同時(shí)，還有著早期診斷率低、化療副作用大、五年生存率較低等問(wèn)題。近年來(lái)，探索非小細(xì)胞肺癌的靶向治療方式主要有兩個(gè)方向：一個(gè)是為沒(méi)有特異性藥物的已知驅(qū)動(dòng)基因?qū)ふ业接行У陌邢蛩幬?，另一個(gè)是尋找新的驅(qū)動(dòng)基因。越來(lái)越多的非小細(xì)胞肺癌晚期病人接受了靶向藥物的治療，明顯延長(zhǎng)了無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期，提高了生活質(zhì)量。目前，已有研究表明PRDM14與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的聯(lián)系，進(jìn)一步探究PRDM14對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖過(guò)程的影響，有望為尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

本研究以人胚胎干細(xì)胞cDNA為模板，PCR擴(kuò)增PRDM14基因片段，將其連接至pcDNA3.1載體并轉(zhuǎn)染至非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H1975中，成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)PRDM14的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，為后續(xù)深入研究該基因的功能提供了重要的實(shí)驗(yàn)材料。