◎ 孫晶瑋，鐘松清

（深圳三方圓檢測(cè)監(jiān)管服務(wù)有限公司，廣東 深圳 518000）

水質(zhì)重金屬污染是危害較大的水污染問(wèn)題之一。鎘是一種常見(jiàn)的重金屬，有劇毒。人們長(zhǎng)期飲用含鎘殘留的水，會(huì)對(duì)人體腎臟、肝臟和生殖系統(tǒng)造成不可逆的損傷。目前，檢測(cè)重金屬鎘的方法有石墨爐原子吸收光譜法、火焰原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[1-3]等，這些方法具有靈敏度高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，但需要昂貴的大型儀器設(shè)備、專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)室和專(zhuān)業(yè)的操作技術(shù)人員，不適用于大宗樣品的快速篩查。因此，急需建立一種高效、便捷、低成本的重金屬鎘檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)水中重金屬鎘的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。

納米材料的研究已成為當(dāng)今國(guó)際上的前沿研究課題，熒光微球作為熒光探針標(biāo)記生物大分子，在分析領(lǐng)域已有重要的應(yīng)用[4-5]。時(shí)間分辨熒光微球是基于鑭系元素發(fā)光的新型標(biāo)記材料，其特點(diǎn)是通過(guò)延遲讀取發(fā)射光時(shí)間以區(qū)分特異性熒光信號(hào)和基質(zhì)背景熒光信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度高[6]。

本研究采用了熒光微球標(biāo)記抗體，建立重金屬鎘的新型、快速、實(shí)用、靈敏的納米熒光免疫層析檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鉛、汞、鎘、鉻、銅和鐵標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 mg·L-1，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；鎘抗體、鎘抗原（純度95.0%，深圳市三方圓生物科技股份有限公司）；熒光微球，南京微測(cè)生物科技有限公司；玻璃纖維墊、硝酸纖維素（NC膜），Millipore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

劃膜儀、數(shù)控?cái)厍袡C(jī)，上海金標(biāo)生物科技有限公司；分析天平，美國(guó)Sartorius公司；超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)記抗體

吸取5 μL熒光微球于2 mL離心管中，加入40 μL 0.05 mol·L-1MES緩 沖 溶 液（pH 4.7），混 勻， 13 500 r·min-1離心20 min，去掉上清，加入40 μL上述緩沖液溶解沉淀，將復(fù)溶液轉(zhuǎn)移入另一2 mL離心管中，超聲30秒；分別加入4 μL N-羥基琥珀酰亞胺溶液 （10 mg·mL-1）和2 μL碳二亞胺溶液（5 mg·mL-1），室溫靜置活化反應(yīng)30 min，13 500 r·min-1離心20 min， 去掉上清，加入40 μL MES緩沖溶液（pH 4.7）溶解沉淀，超聲處理1 min，將復(fù)溶液轉(zhuǎn)入新的2 mL離心管中；加入適量待標(biāo)記抗體，避光，室溫?fù)u床振蕩 1 h；再加入5 μL 10%BSA，封閉1 h，13 500 r·min-1離心15 min，去掉上清，加入50 μL復(fù)溶液超聲復(fù)溶沉淀，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 制備熒光檢測(cè)卡

檢測(cè)卡由PVC底板、樣品墊、耦聯(lián)物墊、NC纖維素膜和吸水墊組成。通過(guò)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，確定最佳抗原包被量、熒光抗體使用量及羊抗鼠二抗工作濃度。使用滑膜儀將抗原稀釋液和羊抗鼠二抗稀釋液分別包被在NC膜上，形成檢測(cè)線(xiàn)T和質(zhì)控線(xiàn)C，將制備好的NC反應(yīng)膜置于50 ℃烘箱中干燥1h；將適宜濃度的熒光微球標(biāo)記的抗體均勻噴涂在耦聯(lián)物墊上，于室溫干燥，備用；裁剪玻璃纖維膜，磷酸緩沖液（1% BSA，0.5%吐溫）浸泡30 min，室溫干燥，備用；將上述樣品墊、耦聯(lián)物墊、NC反應(yīng)膜和吸水墊依次粘貼在PVC底板上，結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 熒光檢測(cè)卡裝置解析示意圖

將組裝好的檢測(cè)卡大板切成5 mm寬的檢測(cè)條，裝入檢測(cè)卡殼中，組裝后的檢測(cè)卡放入帶有干燥劑的鋁箔袋中，封口，室溫保存。

1.3.3 熒光檢測(cè)卡的判讀

本文采用競(jìng)爭(zhēng)的方法研制檢測(cè)重金屬鎘的免疫熒光檢測(cè)卡。檢測(cè)樣本中的待測(cè)目標(biāo)物在流動(dòng)過(guò)程中先與熒光微球標(biāo)記的特異性單克隆抗體相結(jié)合，再帶著標(biāo)記抗體繼續(xù)層析，未結(jié)合的標(biāo)記抗體與NC膜檢測(cè)線(xiàn)（T）上包被抗原結(jié)合。如果樣本液中含有目標(biāo)物，檢測(cè)線(xiàn)（T）顯色較淺或不顯色，結(jié)果為陽(yáng)性；反之，檢測(cè)線(xiàn)（T）顯色與質(zhì)控線(xiàn)（C線(xiàn)）相同或略深，結(jié)果為陰性；若質(zhì)控帶無(wú)顯色，表明實(shí)驗(yàn)無(wú)效。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

將1 000 mg·L-1的 鎘 標(biāo) 準(zhǔn) 品 溶 液 與1 mol·L-1的EDTA溶液混合，靜置反應(yīng)15 min，用0.01 mol·L-1的PBS緩沖溶液將上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋為1 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1和40 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液。分別取80 μL加至檢測(cè)卡的樣品孔中，室溫下反應(yīng)8～10 min。以T/C比值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度的lg值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。

1.3.5 熒光檢測(cè)卡穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

制備3批熒光檢測(cè)卡，在室溫保存12個(gè)月，測(cè)試的時(shí)間為第7天、第15天、第30天、第60天、第90天、第120天、第150天、第180天、第210天、第240天、第270天、第300天、第330天以及第360天，檢測(cè)其敏感性變化。

1.3.6 熒光檢測(cè)卡特異性實(shí)驗(yàn)

選取與目標(biāo)待測(cè)物性質(zhì)相同的同系物進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)交叉反應(yīng)，檢測(cè)所建立的熒光檢測(cè)卡的特異性。

1.3.7 重金屬檢測(cè)樣本處理方法

如果水較混濁需要過(guò)濾，則取1 mL待測(cè)水樣，加入一滴含絡(luò)合劑的0.02 mol·L-1PBS緩沖液（pH 7.4），混勻，沸水浴5 min，待恢復(fù)室溫后用一次性滴管取2～3滴（或用移液槍取80 μL）進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光標(biāo)記抗體量的確定

確定鎘抗體與1 mg熒光微球的最佳偶聯(lián)量，分別檢測(cè)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，用免疫熒光層析檢測(cè)儀記錄檢測(cè)卡的T/C比值。

如圖2所示，隨著抗體標(biāo)記量增加，T/C比值逐漸增大，鎘抗體量達(dá)到200 μg·mg-1時(shí)T/C比值最大，超過(guò)該值后，T/C比值逐漸降低，表明抗體加入量不是越多越好，分析可能是由于結(jié)合到熒光微球表面的抗體達(dá)到飽和，出現(xiàn)了空間位阻，導(dǎo)致標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合量降低，從而使檢測(cè)信號(hào)降低。因此確定熒光標(biāo)記抗體量為200 μg·mg-1。

圖2 抗體標(biāo)記量的確定圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

根據(jù)T/C比值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度的lg值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖，如圖3所示，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2為0.995，線(xiàn)性范圍在1～40 μg·L-1，半抑制率為8.7 μg·L-1，最低檢測(cè)限為1.5 μg·L-1。

圖3 重金屬鎘的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

2.3 檢測(cè)卡的性能

通過(guò)分析比較重金屬鎘與鉻、鉛、汞、銅和鐵檢測(cè)結(jié)果的顯色情況，分析評(píng)估鎘熒光檢測(cè)卡的特異性。檢測(cè)結(jié)果如表1所示，重金屬鎘熒光檢測(cè)卡與其余金屬離子的交叉反應(yīng)率較低，表明本試劑盒的特異性較好。

表1 重金屬鎘特異性表

按照1.3.5實(shí)驗(yàn)方法，將3批次檢測(cè)卡在室溫下保存，測(cè)試的時(shí)間為第7天、第15天、第30天、第60天、第90天、第120天、第150天、第180天、第210天、第240天、第270天、第300天、第330天和第360天，考察其檢測(cè)敏感性變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，檢測(cè)卡在外觀、敏感性上無(wú)顯著差異，說(shuō)明所制備的檢測(cè)卡穩(wěn)定性較好。

按照1.3.7樣本處理方法，檢測(cè)自來(lái)水、純凈水、河水等樣本，分別添加不同濃度水平的重金屬鎘離子，每個(gè)添加樣品測(cè)試5次，并計(jì)算加標(biāo)回收率。由表2可知，回收率在85.7%～105.1%，準(zhǔn)確度較好；變異系數(shù)在5.4%～10.8%，平均變異系數(shù)低于15%。

表2 重金屬鎘的添加回收率表

2.4 與儀器分析法的對(duì)比

目前我國(guó)檢測(cè)生活飲用水中重金屬的標(biāo)準(zhǔn)為《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法金屬指標(biāo)》（GB 5750.6—2006）[7]，石墨爐原子吸收光譜法的最低檢測(cè)限為0.5 μg·L-1。 為對(duì)比兩種檢測(cè)方法，選擇陰性樣品和添加量為20 μg·L-1的陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果較為一致，表明本熒光檢測(cè)卡可以用于檢測(cè)水中鎘的快速篩選。

3 結(jié)論

本研究在重金屬鎘單克隆抗體的制備基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)了鎘的納米熒光免疫層析檢測(cè)卡，經(jīng)過(guò)一系列優(yōu)化，確定本方法的線(xiàn)性范圍為1～40 μg·L-1，靈敏度為 8.7 μg·L-1，最低檢測(cè)限為1.5 μg·L-1。該方法前處理簡(jiǎn)單方便，與傳統(tǒng)的儀器分析法結(jié)果符合性較高，適用于基層現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。