楊 欣，郭會(huì)芹

(國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科，北京 100021)

口咽癌(oropharyngeal cancer，OPC)是我國常見的頭頸部惡性腫瘤之一，主要來源于舌根、扁桃體、軟腭和咽后壁等部位，病理類型多為鱗狀細(xì)胞癌，男性多發(fā)。2015年中國癌癥統(tǒng)計(jì)顯示唇癌、口腔癌及口咽癌、喉咽癌的總發(fā)病率為48.1/10萬，死亡率為22.1/10萬[1]。中國OPC在2008—2012年間每年發(fā)病率約為3.28/10萬(男性4.26/10萬，女性2.26/10萬)，占所有癌癥新發(fā)病例的1.16%，位列第20位[2]。世界范圍內(nèi)18%～72%口咽鱗狀細(xì)胞癌(oropharyngeal squamous cell carcinoma，OPSCC)的發(fā)生與高危HPV感染有關(guān)[3]，其中HPV16、18為兩種主要致癌病毒[4]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)提出HPV相關(guān)OPSCC的發(fā)生率與地域有關(guān)，南歐發(fā)生率小于20%，北美發(fā)生率大于60%[5]，而亞洲發(fā)生率為17%[6]。中國不同地區(qū)HPV相關(guān)OPSCC的發(fā)生比例各異，數(shù)據(jù)顯示中國華南、華東和東北地區(qū)的陽性率分別為20.8%、11.7%和5.51%[7-9]。WHO頭頸部腫瘤分類2017版基于HPV感染狀態(tài)，將OPSCC分為HPV陽性及HPV陰性兩個(gè)組織學(xué)類型[10]，HPV陽性的OPSCC有其獨(dú)特的生物學(xué)行為和較好的臨床預(yù)后。HPV狀態(tài)判斷的方法有常規(guī)HE染色下形態(tài)學(xué)評(píng)估、p16免疫組織化學(xué)染色和HPV病毒特異性檢測(cè)。

1 HPV相關(guān)口咽癌的病理形態(tài)學(xué)特征

WHO頭頸部腫瘤分類2017版指出：HPV陽性的OPSCC多數(shù)呈非角化形態(tài)，腫瘤起源于腺窩上皮，形成大而堅(jiān)實(shí)且邊緣光滑的巢狀或者小葉狀細(xì)胞團(tuán)，中央可伴有壞死；腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)少，細(xì)胞邊界不清，細(xì)胞核深染，呈橢圓形至梭形，核質(zhì)比大，有絲分裂活性及凋亡活性較高，往往呈基底樣形態(tài)，伴有豐富的淋巴細(xì)胞浸潤[10]。HPV陰性的OPSCC多數(shù)呈角化形態(tài)，因具有豐富且成熟的細(xì)胞質(zhì)，獨(dú)特的細(xì)胞邊界和細(xì)胞間橋的多邊形細(xì)胞組成，其生長(zhǎng)模式通常是浸潤性的，呈角狀的腫瘤巢具有錐形延伸和明顯的間質(zhì)結(jié)締組織增生，所以HPV陰性的OPSCC比HPV陽性的OPSCC更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[11]。但是，形態(tài)學(xué)判斷并不完全準(zhǔn)確，例如認(rèn)為所有伴角化的鱗狀細(xì)胞癌均與HPV無關(guān)是不正確的，因?yàn)橐恍〔糠諬PV陽性的OPSCC也可表現(xiàn)出與常規(guī)鱗狀細(xì)胞癌相同的角化，尤其既往接受過治療的病例，角化可能更明顯[12]。盡管經(jīng)典型HPV陽性的OPSCC呈低分化形態(tài)，缺乏角化或者往往角化不顯著，伴大量有絲分裂，但是患者預(yù)后良好，其分子機(jī)制需進(jìn)一步研究。HPV陽性O(shè)PSCC表達(dá)常規(guī)鱗狀上皮標(biāo)記物，如p40、p63和CK5/6，p53往往呈野生型，未出現(xiàn)突變。

2 p16免疫組織化學(xué)染色

p16蛋白是一種細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑，在持續(xù)性HPV感染中由于E7蛋白降解視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb)而出現(xiàn)過表達(dá)，p16免疫組織化學(xué)染色(immuno-histochemistry，IHC)被證明是OPSCC一種敏感的HPV感染狀態(tài)的替代檢測(cè)方法。美國病理學(xué)家協(xié)會(huì)(College of American Pathologists，CAP)發(fā)布了頭頸癌HPV病毒檢測(cè)指南，建議使用p16 IHC作為腫瘤HPV感染狀態(tài)檢測(cè)的替代方法[13]。該方法可應(yīng)用于組織標(biāo)本或細(xì)胞蠟塊，操作簡(jiǎn)單且費(fèi)用低，是臨床上應(yīng)用最廣的檢測(cè)方法。p16 IHC顯示細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核彌漫性表達(dá)，當(dāng)70%以上的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)中等到強(qiáng)的彌漫的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核著色時(shí)，HPV結(jié)果判讀為陽性。研究[14]提示，50%～70%腫瘤細(xì)胞著色的病例需要增加HPV病毒檢測(cè)進(jìn)一步確定是否存在HPV感染。當(dāng)用淋巴結(jié)細(xì)針穿刺標(biāo)本的細(xì)胞塊進(jìn)行p16免疫組化時(shí)，CAP建議判讀標(biāo)準(zhǔn)中著色腫瘤細(xì)胞的數(shù)量可以減少10%～15%，因?yàn)榱馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移往往因發(fā)生囊性變而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的退變和壞死[13]。

理論上，p16過表達(dá)由病毒E7蛋白降解Rb蛋白所致，與感染病毒的亞型無關(guān)，也就是說各種亞型的病毒感染均能反映在p16蛋白上，因此其敏感性較高，接近100%，但其特異性存在質(zhì)疑[15-17]。研究顯示，p16彌漫強(qiáng)陽性還可見于包括皮膚鱗狀細(xì)胞癌、腺樣囊性癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌和黑色素瘤等多種腫瘤，此時(shí)p16過表達(dá)可能與Rb基因突變所致的功能失調(diào)有關(guān)，而與HPV感染無關(guān)[12]。Nauta等[18]分析了一組口咽癌中p16+/HPV DNA-患者的預(yù)后，發(fā)現(xiàn)與p16和HPV DNA均陽性患者相比，該亞組5年總生存率明顯較差，接近p16-/HPV-組，進(jìn)一步說明p16 IHC檢測(cè)存在假陽性判讀的情況。因此，臨床現(xiàn)行的p16 IHC作為HPV風(fēng)險(xiǎn)分層的獨(dú)立檢測(cè)方法存在診斷風(fēng)險(xiǎn)，OPSCC的精準(zhǔn)診療中需要更可靠且可行的HPV病毒特異性檢測(cè)。

3 HPV病毒特異性檢測(cè)方法

3.1 原位雜交檢測(cè)HPV DNA

原位雜交的方法是基于基因?qū)用?，利用其?fù)制、轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)，將帶有特定標(biāo)記的已知序列核酸探針與待測(cè)細(xì)胞或者組織中提取的核酸進(jìn)行雜交，從而定位有HPV感染的細(xì)胞或者組織，并可對(duì)其進(jìn)行定量定性分析。DNA原位雜交(in situhybridization，ISH)是臨床上較為常見的分子檢測(cè)技術(shù)，在OPSCC的HPV檢測(cè)當(dāng)中也是經(jīng)常被納入二線參考的方法。臨床上DNA ISH檢測(cè)既可以使用組織標(biāo)本，也可以使用細(xì)胞標(biāo)本，可以檢測(cè)多種HPV亞型。其最大的優(yōu)點(diǎn)是使腫瘤細(xì)胞內(nèi)的靶DNA可以在細(xì)胞及組織切片上呈可視化，從而確保基因檢測(cè)的準(zhǔn)確性[19]。目前，關(guān)于DNA ISH檢測(cè)方法的敏感性及特異性的數(shù)據(jù)較少，Qureishi等[20]的研究顯示，DNA ISH與p16 IHC相比，具有較高的特異性(88%和82%)及較低的敏感性(88%和94%)，尤其是當(dāng)腫瘤組織中的HPV DNA拷貝數(shù)較低時(shí)檢測(cè)敏感性會(huì)進(jìn)一步降低。

3.2 PCR檢測(cè)HPV DNA

PCR是體外酶促合成特異性DNA片段的一種方法，通過特定引物介導(dǎo)目標(biāo)DNA(E6/E7)的擴(kuò)增，以此檢測(cè)HPV感染狀態(tài)。有實(shí)驗(yàn)將107例HPV陽性標(biāo)本提取的DNA分別用GP、SP16/SP18、SP16b 3組引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果證明以GP作為共同引物檢出率較高[21]。新鮮冷凍樣本及福爾馬林固定石蠟包埋樣本(formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)均可進(jìn)行HPV DNA PCR檢測(cè)[22]，PCR克隆DNA具有操作簡(jiǎn)便、省時(shí)的優(yōu)點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道，以p16 IHC為對(duì)照，DNA PCR檢測(cè)HPV感染狀態(tài)的敏感性及特異性分別為97%和87%[20]。DNA PCR與DNA ISH相比較，兩者敏感性相似，但是前者的特異性低于后者[23]。有研究發(fā)現(xiàn)通過ddPCR(droplet-based digital PCR)檢測(cè)血液循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)中的HPV病毒表達(dá)情況，可作為一種有用且無創(chuàng)的檢測(cè)方法。通過對(duì)治療前的OPSCC血液進(jìn)行HPV16 ctDNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ddPCR評(píng)估的HPV16 ctDNA拷貝數(shù)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，以及臨床分期顯著相關(guān)[24]。

3.3 原位雜交檢測(cè)HPV RNA

HPV E6/E7 mRNA是CAP推薦的金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法[25]，E6/E7基因是HPV的主要致病基因，E6基因通過抑制P53基因阻斷細(xì)胞凋亡，E7基因可抑制RB基因而使細(xì)胞周期失調(diào)控。相比于HPV DNA檢測(cè)，E6/E7 mRNA表達(dá)水平提示的是有轉(zhuǎn)錄活性的病毒的存在，是目前HPV檢測(cè)的重要手段。研究顯示：RNA ISH敏感性為97%，與p16 IHC具有較高的一致性(93%)[26]。一項(xiàng)愛爾蘭數(shù)據(jù)以p16 IHC陽性病人為基數(shù)，對(duì)HPV DNA ISH/RNA ISH/DNA PCR技術(shù)的敏感性及特異性進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示：3種檢測(cè)方法在p16+病例中有相似的敏感性(RNA ISH為89%；DNA ISH為74%；DNA PCR為79%)，而兩種ISH技術(shù)的特異性均優(yōu)于DNA PCR(RNA ISH為100%；DNA ISH為100%；DNA PCR為67%)。該研究認(rèn)為，3種方法中準(zhǔn)確性最高的是HPV RNA ISH(95%)，其次是HPV DNA ISH(90%)，而HPV DNA PCR最低(72%)[23]。隨著HPV陽性的OPSCC的研究進(jìn)展，用于檢測(cè)HPVE6/E7基因的廣譜雞尾酒探針已經(jīng)可檢測(cè)多種HPV亞型的E6/E7基因，從而擴(kuò)大了HPV的檢出率[27]。RNAscope技術(shù)是最新的原位雜交技術(shù)，其RNA探針敏感性高于PCR-反向斑點(diǎn)雜交，解決了FFPE中mRNA降解的問題[28]。研究顯示，以p16 IHC為參考，RNAscope技術(shù)檢測(cè)HPV的敏感性為93.4%[29]。然而，當(dāng)檢測(cè)多種高危型HPV(如HPV16、18、52、53等)時(shí)，則需要使用多種探針，檢測(cè)費(fèi)用較昂貴。

3.4 PCR檢測(cè)HPV RNA

FFPE腫瘤組織中RNA存在降解，提取的核酸量少、質(zhì)量低，并且常是片段的或經(jīng)過化學(xué)修飾的RNA，給RNA PCR檢測(cè)方法帶來了挑戰(zhàn)。另外，口咽癌的組織學(xué)標(biāo)本大多數(shù)為小活檢組織，F(xiàn)FPE切片中腫瘤組織量少，這更增加了RNA PCR檢測(cè)在臨床樣本中實(shí)施的難度。因此，關(guān)于HPV RNA PCR檢測(cè)方法的報(bào)道較少，其與HPV DNA PCR一樣有著高敏感性、低特異性、并且無法分辨腫瘤細(xì)胞中的HPV是否是存在于非腫瘤上皮或間質(zhì)中的非特異性感染[30]。

Aptima HPV檢測(cè)是臨床上廣泛應(yīng)用于宮頸癌篩查的方法，可同時(shí)檢出14種高危型HPV的E6/E7 mRNA，是圣地亞哥加州地區(qū)Hologic公司推出的商品化的基因檢測(cè)技術(shù)[31]。該檢測(cè)價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)易，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的適用標(biāo)本是細(xì)胞學(xué)樣本，尚未批準(zhǔn)用于FFPE標(biāo)本，因此目前該方法在OPSCC患者中的應(yīng)用局限在了頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶細(xì)針穿刺樣本[32]。最近Kir等[33]在宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變和宮頸鱗癌中成功進(jìn)行了FFPE標(biāo)本Aptima HPV檢測(cè)的初步嘗試，為擴(kuò)大Aptima HPV檢測(cè)在OPSCC中的應(yīng)用賦予了希望。

4 小結(jié)和展望

雖然中國HPV相關(guān)的OPSCC患者比例低于歐美，但鑒于其獨(dú)特的臨床分期和對(duì)治療的反應(yīng)，精準(zhǔn)且高效鑒別HPV陽性的OPSCC成為分子病理診斷的核心內(nèi)容。并且，中國學(xué)者的研究證明第8版AJCC分期系統(tǒng)對(duì)于我國口咽癌患者也適用，中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)(Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO)也在2019年V1版頭頸部腫瘤診療指南中正式采用了美國第8版AJCC分期系統(tǒng)[34]。HPV陽性的OPSCC有其形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和p16彌漫強(qiáng)陽性表達(dá)的特點(diǎn)，但是目前指南中推薦的單獨(dú)p16 IHC判斷方法，可能會(huì)出現(xiàn)少數(shù)p16陽性，但并無HPV感染的病例。隨著HPV病毒特異性檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，尤其是具有轉(zhuǎn)錄活性的病毒E6/E7 mRNA檢測(cè)技術(shù)(如RNAscope技術(shù)和Aptima HPV技術(shù))的普及，HPV病毒特異性檢測(cè)有可能會(huì)從現(xiàn)在指南中推薦的“額外的檢測(cè)”轉(zhuǎn)變?yōu)閜16 IHC的聯(lián)合檢測(cè)，從而提高HPV相關(guān)OPSCC診斷的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)OPSCC的精準(zhǔn)診斷和精準(zhǔn)治療。