鄧夢夢，郭子儀，丁晨夢，許夕雅，孫亞威，韓紫薇，石蒙蒙，陳 陸

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)屬于皰疹病毒科(Herpesviridae)α皰疹病毒亞科(alphaHerpesririnae)[1-2]。豬是其自然宿主，感染后妊娠母豬可出現(xiàn)流產(chǎn)、種豬不育、新生仔豬腦脊髓炎和腹瀉等癥狀。PRV復(fù)制周期短、感染速度快，能引起細(xì)胞裂解性感染，且能在神經(jīng)細(xì)胞中建立潛伏感染，導(dǎo)致機(jī)體感染耐受后終身帶毒[3]。當(dāng)機(jī)體免疫水平降低或處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，潛伏感染的病毒被激活，從而引起復(fù)發(fā)性感染[4]。該病目前尚無有效治療藥物，疫苗免疫仍是預(yù)防和控制該病發(fā)生和流行的主要措施。隨著偽狂犬病基因缺失標(biāo)記疫苗的廣泛使用以及配合鑒定診斷技術(shù)和陽性帶毒豬淘汰凈化等綜合措施，該病在我國得到有效控制[5]。2011年末，偽狂犬病在免疫Bartha-K61株疫苗的豬場再次暴發(fā)和流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，使得偽狂犬病防控和疫苗研究再次成為熱點(diǎn)[6-8]。

gE、TK基因是PRV的主要毒力基因，且不參與病毒復(fù)制，缺失該基因后不僅可明顯降低病毒的侵襲力和毒力，還可保持良好的免疫原性，是目前基因缺失疫苗的主要缺失靶點(diǎn)[9-11]。US3也是PRV的毒力基因，且通過抑制Ⅰ型IFN反應(yīng)、干擾MHC-Ⅰ介導(dǎo)的抗原遞呈、阻止感染細(xì)胞被NK細(xì)胞裂解和抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)而逃避宿主的免疫監(jiān)視[12-14]。為了研究能被有效抗原遞呈以被免疫系統(tǒng)識別，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更高免疫反應(yīng)的疫苗，本試驗(yàn)在PRV △gE/TK株基礎(chǔ)上缺失US3基因，構(gòu)建PRV △gE/TK/US3基因缺失株，并測得其安全性和免疫效力，以評價(jià)其作為疫苗株的潛力。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、毒株、菌株和細(xì)胞pBluescript SK(-)真核表達(dá)載體、pEGFP重組質(zhì)粒、pcGlobin2-Cre質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存；PRV QYY2012變異株和PRV △gE/TK基因缺失株均為本實(shí)驗(yàn)室分離、構(gòu)建與保存；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、Vero細(xì)胞、293 T細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、SpeⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、T4DNA ligase為TaKaRa公司產(chǎn)品；Opti-MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、2×DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；Lipofectamine 2000 Reagen為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡健康雌性昆明小鼠購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中PRV HN1201(KP722022.1)序列設(shè)計(jì)系列引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.5 病毒增殖及基因組提取分別將PRV QYY2012株和△gE/TK株接種Vero細(xì)胞，待細(xì)胞病變至80%時(shí)收毒，利用酚氯仿法提取病毒DNA。

1.6 PRV US3基因左、右側(cè)同源臂、EGFP的擴(kuò)增及回收以PRV QYY2012株DNA為模板，利用引物US3L-F/R和US3R-F/R分別擴(kuò)增PRV US3基因左、右側(cè)同源臂。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。以pEGFP重組質(zhì)粒為模板，利用加Loxp位點(diǎn)的引物EGFP-F/R擴(kuò)增EGFP。PCR反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，32個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。分別將回收純化的PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-US3L、pMD-US3R和pMD-EGFP并進(jìn)行測序，將測序結(jié)果通過Blast比對，以確定序列正確性。

1.7 轉(zhuǎn)移載體pSK-US3-LR-EGFP構(gòu)建及鑒定pMD-US3L和pMD-US3R分別經(jīng)KpnⅠ、HindⅢ和EcoRⅠ、SpeⅠ雙酶切獲得線性片段US3L和US3R，將其定向克隆至相同雙酶切處理的pBluescript SK(-)，獲得質(zhì)粒pSK-US3-LR。將質(zhì)粒pMD-EGFP經(jīng)Hind Ⅲ、EcoRⅠ雙酶切獲得線性片段EGFP，將其連接至相同雙酶切的pSK-US3-LR。經(jīng)酶切及測序鑒定正確所構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體命名為pSK-US3-LR-EGFP。

1.8 重組質(zhì)粒pSK-US3-LR-EGFP綠色熒光標(biāo)簽表達(dá)盒啟動(dòng)子活性鑒定脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將2 μg重組質(zhì)粒pSK-US3-LR-EGFP轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h換細(xì)胞維持液，24 h后在熒光顯微鏡下觀察是否表達(dá)綠色熒光。

1.9 重組病毒PRV △gE/TK/US3/EGFP+株的獲得與鑒定脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pSK-US3-LR-EGFP和PRV △gE/TK株基因組共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后6 h換細(xì)胞維持液，待出現(xiàn)80%細(xì)胞病變時(shí)收毒。離心取上清接種Vero細(xì)胞，鋪設(shè)含低熔點(diǎn)瓊脂糖的細(xì)胞維持液，挑選綠色熒光蝕斑，經(jīng)蝕斑純化直至熒光顯微鏡下觀察到的蝕斑均為綠色熒光，純化病毒命名為PRV △gE/TK/US3/EGFP+株。將PRV △gE/TK/US3/EGFP+株接種Vero細(xì)胞，提取DNA，利用引物US3-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定US3基因缺失結(jié)果。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min 30 s，32個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.10 重組病毒PRV △gE/TK/US3株的獲得與鑒定將pcGlobin2-Cre質(zhì)粒和PRV △gE/TK/US3/EGFP+株基因組共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，利用Cre-Loxp重組酶系統(tǒng)去除EGFP基因。轉(zhuǎn)染后6 h換細(xì)胞維持液，待出現(xiàn)80%細(xì)胞病變時(shí)收毒，離心取上清接種Vero細(xì)胞，蝕斑純化不帶綠色熒光標(biāo)簽的重組病毒命名為PRV △gE/TK/US3株。將PRV △gE/TK/US3株接種Vero細(xì)胞，提取DNA，利用引物US3-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定US3基因缺失情況。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.11 重組病毒PRV △gE/TK/US3株遺傳穩(wěn)定性PRV △gE/TK/US3株在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳10代，提取各代病毒基因組，利用引物gD-F/R和△US3-F/R經(jīng)PCR鑒定驗(yàn)證PRV △gE/TK/US3株遺傳穩(wěn)定性。

1.12 重組病毒PRV △gE/TK/US3株一步生長曲線測定將PRV QYY2012、△gE/TK和△gE/TK/US3株病毒液分別接種到長滿單層Vero細(xì)胞的35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每隔6 h收集病毒液，反復(fù)凍融3次，1 000 r/mim離心8 min，取上清液根據(jù)Reed-Muench法測定、計(jì)算病毒滴度，繪制一步生長曲線。

1.13 小鼠安全性試驗(yàn)將6周齡健康雌性昆明小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，3個(gè)感染組分別后肢肌肉接種1×106TCID50的PRV QYY2012、△gE/TK和△gE/TK/US3株，空白對照組后肢肌肉接種DMEM溶液，每天觀察并記錄小鼠的臨床反應(yīng)及存活率。

1.14 重組病毒PRV △gE/TK/US3株免疫小鼠中和抗體消長測定將6周齡健康雌性昆明小鼠隨機(jī)分為3組，每組8只，2個(gè)免疫組分別經(jīng)后肢肌肉接種1×106TCID50的PRV △gE/TK和△gE/TK/US3株，空白對照組接種DMEM溶液，首免后2周同樣劑量和接種途徑加強(qiáng)免疫。免疫后每周采集小鼠血清，利用PRV QYY2012株經(jīng)中和試驗(yàn)測定其抗PRV中和抗體水平。

1.15 重組病毒PRV △gE/TK/US3株免疫小鼠攻毒試驗(yàn)將6周齡健康雌性昆明小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，3個(gè)免疫組分別經(jīng)后肢肌肉接種1×106TCID50的PRV △gE/TK、△gE/TK/US3和Bartha-K61株，空白對照組接種DMEM溶液，首免后2周同樣劑量和接種途徑加強(qiáng)免疫。二免后4周后肢肌肉接種4×104TCID50的PRV QYY2012株攻毒，每天觀察并記錄小鼠的臨床反應(yīng)及存活率。

2 結(jié)果

2.1 PRV US3基因左、右側(cè)同源臂和EGFP基因擴(kuò)增PRV US3基因左、右側(cè)同源臂和EGFP基因PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果顯示，分別擴(kuò)增出658，778，1 620 bp 目的條帶，與預(yù)期一致(圖1)。分別經(jīng)回收純化克隆至pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒并測序，Blast比對結(jié)果均正確。

M.DL2000 DNA Marker;1.US3左側(cè)同源臂片段;2.US3右側(cè)同源臂片段;3.EGFP片段

2.2 重組質(zhì)粒pSK-US3-LR-EGFP酶切鑒定構(gòu)建的重組質(zhì)粒pSK-US3-LR-EGFP大小為5 974 bp，雙酶切鑒定結(jié)果顯示與預(yù)期一致(圖2)，證明重組質(zhì)粒pSK-US3-LR-EGFP構(gòu)建成功。

M.DL5000 DNA Marker;1.HindⅢ/EcoRⅠ(1 620，4 354 bp);2.EcoRⅠ/KpnⅠ(2 358，3 616 bp)

2.3 重組質(zhì)粒pSK-US3-LR-EGFP表達(dá)盒啟動(dòng)子活性鑒定pSK-US3-LR-EGFP轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞24 h后在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光(圖3)，表明重組質(zhì)粒EGFP表達(dá)盒啟動(dòng)子具有活性，可啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄表達(dá)綠色熒光蛋白，pSK-US3-LR-EGFP可用于PRV △gE/TK株US3基因缺失同源重組打靶。

A.熒光視野;B.明場視野

2.4 重組病毒PRV △gE/TK/US3/EGFP+株的純化pSK-US3-LR-EGFP和PRV △gE/TK株基因組共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞后進(jìn)行蝕斑篩選，48 h后在熒光顯微鏡下可觀察到少量綠色熒光病毒蝕斑，經(jīng)8輪挑斑純化獲得所有病變均帶熒光的重組病毒PRV △gE/TK/US3/EGFP+株(圖4)。

2.5 重組病毒PRV △gE/TK/US3/EGFP+株P(guān)CR鑒定將純化的熒光蝕斑病毒接種Vero細(xì)胞進(jìn)行增殖，利用引物US3-F/R經(jīng)PCR鑒定，擴(kuò)增PRV QYY2012株條帶應(yīng)為1 617 bp，PRV △gE/TK/US3/EGFP+株因US3基因缺失925 bp，插入熒光標(biāo)簽EGFP為1 640 bp，擴(kuò)增片段應(yīng)為2 332 bp。電泳結(jié)果顯示與預(yù)期相符(圖5)。

M.DL5000 DNA Marker;1.PRV QYY2012株擴(kuò)增片段;2.PRV △gE/TK/US3/EGFP+株擴(kuò)增片段;3.陰性對照

2.6 重組病毒PRV △gE/TK/US3/EGFP+株熒光標(biāo)簽的剔除pcGlobin2-Cre質(zhì)粒和PRV △gE/TK/US3/EGFP+株基因組共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞后取上清接種Vero細(xì)胞，48 h后在熒光顯微鏡下觀察到有不帶綠色熒光的蝕斑，經(jīng)4輪蝕斑純化獲得所有病變均不帶熒光的重組病毒PRV △gE/TK/US3株(圖6)。

A.熒光視野;B.明場視野

2.7 重組病毒PRV △gE/TK/US3株P(guān)CR鑒定將獲得的PRV △gE/TK/US3株接種Vero細(xì)胞增殖，利用引物US3-F/R經(jīng)PCR鑒定，PRV QYY2012株擴(kuò)增條帶應(yīng)為1 617 bp，PRV △gE/TK/US3株因US3基因缺失925 bp，所以擴(kuò)增條帶應(yīng)為692 bp。電泳結(jié)果顯示與預(yù)期相符(圖7)。

M.DL2000 DNA Marker;1.PRV QYY2012株擴(kuò)增片段;2.PRV △gE/TK/US3株擴(kuò)增片段;3.陰性對照

2.8 重組病毒PRV △gE/TK/US3株遺傳穩(wěn)定性評價(jià)PRV △gE/TK/US3株在Vero細(xì)胞上增殖10代，利用引物gD-F/R和△US3-F/R進(jìn)行PCR鑒定。電泳結(jié)果顯示，使用gD-F/R擴(kuò)增出572 bp目的條帶(圖8A)，與預(yù)期一致，且測序結(jié)果顯示不同代次gD基因未發(fā)生變異。使用△US3-F/R擴(kuò)增PRV △gE/TK/US3株不同代次毒株，均無擴(kuò)增條帶(圖8B)，證明PRV △gE/TK/US3株沒有發(fā)生US3基因回復(fù)突變，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

A.gD基因擴(kuò)增片段;B.US3基因擴(kuò)增片段。M.DL2000 DNA Marker;1～10.1～10代PRV △gE/TK/US3株;11.PRV QYY2012株;12.陰性對照

2.9 重組病毒PRV △gE/TK/US3株一步生長曲線測定△gE/TK株病毒滴度分別在接毒后30和36 h 達(dá)到最高，PRV △gE/TK/US3株在接毒后42 h 達(dá)到最高(圖9)。與PRV QYY2012和△gE/TK株相比，PRV △gE/TK/US3株病毒滴度較低，說明US3基因缺失毒株增殖能力下降，US3基因與病毒復(fù)制能力有一定關(guān)系，但PRV △gE/TK/US3株仍具有良好的體外增殖能力。

圖9 重組病毒PRV △gE/TK/US3株在Vero細(xì)胞上的一步生長曲線

2.10 小鼠安全性試驗(yàn)PRV QYY2012株試驗(yàn)組在攻毒后第3天開始出現(xiàn)間歇性興奮、食欲減退、轉(zhuǎn)圈、瘙癢等典型臨床癥狀，攻毒后1周內(nèi)全部死亡。PRV △gE/TK和△gE/TK/US3株試驗(yàn)組和空白對照組小鼠均健康存活，且精神、食欲均正常。結(jié)果表明，US3基因作為PRV的毒力基因，缺失后可顯著降低對小鼠的致病性，由此可證明PRV △gE/TK/US3株的安全性。

2.11 免疫小鼠血清抗PRV中和抗體水平消長情況PRV △gE/TK和△gE/TK/US3株免疫組在一免后1周均產(chǎn)生中和抗體，二免后4周均達(dá)到最高水平(圖10)。PRV △gE/TK/US3株免疫組能誘導(dǎo)更高水平抗體，且能維持更長時(shí)間，具有良好的免疫原性。

圖10 重組病毒PRV △gE/TK/US3株免疫小鼠血清中抗PRV中和抗體水平消長變化情況

2.12 重組病毒PRV △gE/TK/US3株免疫小鼠攻毒試驗(yàn)Bartha-K61株免疫組小鼠對PRV QYY2012毒株攻擊的抵抗力較低，PRV △gE/TK株免疫組小鼠對其耐受力較強(qiáng)，而PRV △gE/TK/US3株免疫組小鼠可對PRV強(qiáng)毒攻擊提供完全保護(hù)力(圖11)。

圖11 重組病毒PRV △gE/TK/US3株免疫小鼠攻毒后7 d 小鼠存活情況

3 討論

目前防控豬偽狂犬病(PR)主要依靠疫苗接種，隨著Bartha-K61的廣泛使用，PR已得到有效控制[15]。但自2011年以來，我國接種PR疫苗的豬場暴發(fā)嚴(yán)重的PR，意味著現(xiàn)有疫苗已不能對當(dāng)前流行的PRV變異株提供完全的保護(hù)力，因此研制可防控、根除PRV變異株的新型疫苗成為重中之重。

PRV的毒力受不同基因編碼蛋白的調(diào)控，不同程度地缺失毒力基因可對病毒侵襲能力、傳播性能造成一定影響，這為研制新型PRV疫苗創(chuàng)造條件[16-18]。缺失gE、TK基因可顯著降低病毒毒力，但不影響病毒增殖，且保留良好的免疫原性，是目前基因缺失疫苗的主要靶基因[19]。LI等[20]比較PRV △gE/gI和△TK/gE/gI的免疫效力發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步缺失TK可為小鼠和豬只提供更強(qiáng)的保護(hù)力。US3基因也是PRV毒力基因，且通過下調(diào)MHC-Ⅰ類分子表達(dá)、干擾Ⅰ型IFN反應(yīng)和抑制細(xì)胞凋亡參與免疫逃逸[21-22]。為驗(yàn)證US3基因缺失后作為疫苗的免疫效力，本試驗(yàn)構(gòu)建了3基因缺失株P(guān)RV △gE/TK/US3，該毒株US3基因缺失925 bp，可在Vero細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定傳代，雖病毒滴度較原毒株低，但仍具有良好的增殖能力。使用該基因缺失株接種小鼠是安全可靠的，能產(chǎn)生較高水平的抗PRV中和抗體，且能維持較長時(shí)間，具有良好的免疫原性。吳化葉等[23]也證實(shí)了HSV-1 US3基因修飾突變減毒株M4表現(xiàn)出良好的減毒表型，免疫小鼠可產(chǎn)生高水平中和抗體并誘導(dǎo)特異性T免疫反應(yīng)，提高機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。本試驗(yàn)結(jié)果可初步證實(shí)接種PRV △gE/TK/US3株后作為抗原能被機(jī)體有效遞呈以被免疫系統(tǒng)識別，誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，這是PRV △gE/TK/US3基因缺失株有望作為PR基因缺失疫苗候選種毒株的有力證明。此外PRV △gE/TK/US3株免疫后小鼠可對PRV QYY2012強(qiáng)毒攻擊提供完全保護(hù)力，進(jìn)一步表明該缺失株具有良好的免疫保護(hù)力。后期還將對PRV △gE/TK/US3基因缺失株免疫效力進(jìn)行全面評價(jià)，以期為防控當(dāng)前PRV變異毒株引起的PR疫情提供新型高效疫苗。