李 曄,張玉珠,霍俊元,唐明瑞,蔡樺林,孫真真,劉祥雨,謝光洪*,劉 云*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030； 2.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

隨著社會的進(jìn)步，以及我國生活水平的提高，伴侶動物犬的飼養(yǎng)數(shù)量也大幅度提升，近幾年國內(nèi)小動物醫(yī)學(xué)方面也得到了迅速發(fā)展[1]。骨腫瘤屬于臨床上較為常見的犬骨病，約占組織腫瘤的57%，且惡性骨腫瘤的比例較大，臨床上以跛行、病變處腫脹、骨折為主[2-3]。截肢術(shù)是常采用的治療手段，但是在大多數(shù)病例中不太理想，少數(shù)病例在術(shù)后僅存活6～8個月。犬骨癌的發(fā)生可能與年齡、品種、外界感染有關(guān)，但是犬骨癌發(fā)病原因尚不清楚，因此臨床上還無法有效預(yù)防[2,4]。微生物感染是癌癥的發(fā)病因素之一，全世界超過16%的癌癥發(fā)病率歸因于微生物感染[5]，且最近有研究證明，不同類型癌癥的腫瘤內(nèi)均存在細(xì)菌，且其多樣性和組成可以影響宿主的免疫反應(yīng)和疾病的自然病程[6-7]。這些研究提示了調(diào)節(jié)腫瘤內(nèi)細(xì)菌可能成為一種使腫瘤對治療敏感的新策略。但犬作為人癌癥研究的常用動物模型，犬骨癌的癌組織內(nèi)是否含有細(xì)菌，這一問題到目前為止是未知的。

16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)因其高變區(qū)具有屬或種的特異性，可以作為揭示生物物種的特征核酸序列， 被認(rèn)為是細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和分類的最適合指標(biāo)。迄今，16S rRNA已被廣泛用于腸道、口腔、胃黏膜、乳腺、肺、胰腺、骨癌病變部位等的菌群組成結(jié)構(gòu)研究[8-12]。例如NEJMAN等[8]利用16S rRNA擴(kuò)增子測序分析了1 010例癌癥患者(包括乳腺癌、肺癌、黑色素癌、胰腺癌、卵巢癌、骨癌以及多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)的癌組織樣本，結(jié)果表明不同的癌癥類型中菌群豐度不盡相同。

因此，本研究基于16S rRNA基因測序技術(shù)，通過提取骨癌患犬的癌組織和癌旁組織的基因組總DNA，進(jìn)行高通量測序并結(jié)合數(shù)據(jù)分析骨癌患犬的腫瘤內(nèi)是否存在細(xì)菌以及菌群的結(jié)構(gòu)組成、豐度和多樣性，為犬骨癌的早期診斷和新治療手段的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑組織DNA提取試劑盒和膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成；PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶購自長春市生物技術(shù)有限公司。

1.2 樣品采集6份腫瘤組織(BC)和6份癌旁組織(PBC)均來源于福州省福州市千寵百愛動物醫(yī)院的確診骨癌犬：術(shù)后即刻在無菌超凈臺用手術(shù)鋸切割放入1.5 mL無菌EP管，并快速置于-80℃低溫冰箱中冷凍保存。

1.3 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增通過提取骨癌患犬的癌組織和癌旁組織總DNA來對其菌群進(jìn)行分析。首先對兩種組織分別進(jìn)行研磨，然后利用組織DNA提取試劑盒對組織的基因組總DNA 進(jìn)行提取，并檢測DNA的純度和濃度。取適量的組織DNA于高壓滅菌過的1.5 mL EP管中，使用ddH2O將DNA稀釋至1 mg/L。以稀釋后的基因組 DNA 為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶 Barcode 的特異引物(F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)、PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性1 min；98℃變性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。最后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并利用膠回收進(jìn)行純化。

1.4 序列測定高通量序列測定采用的測序平臺是NovaSeq PE250，測序區(qū)域?yàn)?6S rRNA 的V3-V4區(qū)，序列長度在250 bp左右，測序工作由諾禾致源測序公司完成。

1.5 生物信息分析利用Uparse軟件對所有樣本的全部數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，以97%相似性將序列聚類成為操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)。Alpha多樣性指數(shù)使用Shannon、Simpson、Chao 1、ACE、Coverage分析樣本內(nèi)骨癌患犬的癌內(nèi)菌群和癌旁菌群的豐富度和多樣性。Beta多樣性分析體現(xiàn)2組之間的差異程度。應(yīng)用LEfSe分析尋找組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義的生物標(biāo)志物，展現(xiàn)不同組中豐富顯著的菌種。選取豐富度排名前35的功能及它們在每個樣品中的豐富信息，并從功能差異層面進(jìn)行聚類，并進(jìn)行Tax4Fun功能預(yù)測分析。

1.6 統(tǒng)計分析應(yīng)用Wilcox秩和檢驗(yàn)對犬骨癌癌內(nèi)菌群與癌旁菌群的α多樣性指數(shù)進(jìn)行差異比較，組間差異菌群分析采用t檢驗(yàn)對組間的菌群豐富數(shù)據(jù)進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)以篩選差異有統(tǒng)計學(xué)意義的菌群。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OTUs分析為了研究骨癌患犬的癌內(nèi)菌群，對6例患犬的細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增子進(jìn)行高通量測序用于比較癌組織與癌旁組織之間的菌群特征。由表1可知，12個組織樣品(6個癌組織與6個癌旁組織)共獲得766 209條原始序列，原始序列經(jīng)過過濾低質(zhì)量和短長度后得到717 887條優(yōu)化序列，最后經(jīng)過過濾嵌合體后用于后續(xù)分析的有645 813條序列，平均長度為256 bp，其中癌組織(BC，n=6)共有300 222條有效序列；癌旁組織(PBC，n=6)共有345 591條有效序列。OUT聚類分析后，我們發(fā)現(xiàn)12例樣品2組共有7 642個OUT，其中骨癌組織有1 648個特有OUT，癌旁組織有1 895個特有OUT，剩下的4 102個OUT是2組共有的，說明了大部分菌群為兩者共有，小部分特殊菌群為癌組織特有(圖1)。

表1 數(shù)據(jù)、數(shù)理統(tǒng)計及質(zhì)控

圖1 組間韋恩圖

2.2 癌組織與癌旁組織Alpha多樣性比較圖2是以97%的一致性進(jìn)行稀釋曲線的繪制，曲線趨于平緩，說明本試驗(yàn)測序數(shù)據(jù)合理。由表2可知，對患犬癌組織(BC組)和癌旁組織(PBC組)的Alpha多樣性分析表明， Shannon、Simpson、Chao1、Ace指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)，Coverage指數(shù)(即樣本菌群覆蓋率)均高達(dá)98%。

圖2 稀釋曲線

表2 癌組織(BC)和癌旁組織(PBC)Alpha多樣性分析

2.3 癌組織與癌旁組織Beta多樣性比較使用主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis，PCoA)將多維數(shù)據(jù)降維，對樣本之間的物種多樣性關(guān)系進(jìn)行描述。如果樣本的物種豐度和構(gòu)成越相似，則其在PCoA圖中的距離越近。由圖3可知，癌組織菌群明顯聚集，且與癌旁組織菌群有一定的差異。

圖3 癌組織與癌旁組織菌群的PCoA分析

對于癌組織和癌旁組織細(xì)菌豐富排名前10的菌群進(jìn)行門水平分析，結(jié)果由圖4可知，2組分別有10個菌門，其中癌組織的優(yōu)勢菌門有變形菌門(Proteobacteria，39.09%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，14.21%)、厚壁菌門(Firmicutes，13.25%)、廣古菌門(Euryarchaeota，6.39%)和螺旋菌門(Spirochaetota，2.12%)；癌旁組織的優(yōu)勢菌門有變形菌門(Proteobacteria，52.35%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，9.99%)、厚壁菌門(Firmicutes，18.40%)和梭桿菌門(Fusobacteriota，1.85%)。由表4可知，癌組織的擬桿菌門(Bacteroidetes)、廣古菌門(Euryarchaeota)以及螺旋菌門(Spirochaetota)顯著高于癌旁組織(P<0.05)，其脫硫菌門(Desulfobacterota)極顯著高于癌旁組織(P<0.01)。

A.不同樣本；B.不同組別

對于癌組織和癌旁組織細(xì)菌豐富排名前10的菌群進(jìn)行屬水平分析，結(jié)果由圖5可知，癌組織菌群優(yōu)勢菌相對豐度從高到低分別是：假單胞桿菌屬(Pseudomonas，2.56%)、乳桿菌屬(Lactobacillus，2.49%)、鏈球菌屬(Streptococcus，1.83%)、埃希-志賀菌屬(Escherichia-Shigella，0.61%)；癌旁組織優(yōu)勢菌相對豐度從高到底分別是：假單胞桿菌屬(Pseudomonas，9.27%)、鏈球菌屬(Streptococcus，3.82%)、乳桿菌屬(Lactobacillus，2.27%)、梭桿菌屬(Fusobacterium，1.49%)。由表5可知，癌組織的甲烷桿菌屬、互營桿菌屬以及Sarcina屬顯著高于癌旁組織(P<0.05)，有趣的是癌旁組織中不含有Sarcina屬。

A.不同樣品；B.不同組別

表4 癌組織與癌旁組織菌群門水平豐度

表5 癌組織與癌旁組織菌群屬水平豐度

2.4 LDA差異貢獻(xiàn)分析LEfSe (LDA Effect Size)用于分析發(fā)現(xiàn)和解釋高維度生物標(biāo)識(基因、通路和分類單元)，比較2組的差異物種進(jìn)而尋找差異顯著的Biomarker[13]。利用LEfSe分析發(fā)現(xiàn)差異物種并通過LDA(線性判別分析)評估差異物種的影響影響程度，即得到LDA score。通過對BC-PBC的LEfSe分析，我們發(fā)現(xiàn)LDA score>4的biomarker共有27個，包括硝化螺旋菌屬(Nitrosococcaceae)、反芻甲烷桿菌(Methanobacterium)、擬桿菌門(Bacteroidota)、Exilispira、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、假單胞菌目(Pseudomonadales)等(圖6A)。其中，代表癌組織的紅色節(jié)點(diǎn)在以下4個進(jìn)化樹上是富集的(圖6B)，起到主要差異作用：(1)擬桿菌門(Bacteroidota)—擬桿菌綱(Bacteroidia)—擬桿菌目(Bacteroidales)—擬桿菌科(Williamwhitmaniaceae)；(2)廣古菌門(Euryarchaeota)—甲烷桿菌綱(Methanobacteria)—甲烷桿菌目(Methanobacteriales) —甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae)；(3)螺旋菌門(Spirochaetota)—螺旋菌目(Brachyspirales)—螺旋菌科(Brachyspirae)—未分類的短螺旋體屬(Brachyspira)。代表癌旁組織的綠色節(jié)點(diǎn)在下一個進(jìn)化樹上是富集的(圖6B)：γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)—伯克氏菌目(Burkholderiales)/假單胞菌目(Pseudomonadales)—假單胞細(xì)菌科(Pseudomonadaceae)。無差異物種標(biāo)為黃色節(jié)點(diǎn)。

圖6 LDA值分布柱狀圖(A)和進(jìn)化分布圖(B)

2.5 功能預(yù)測根據(jù)數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果，選取每個分組最大豐度排名前10的功能信息，對患犬的癌組織和癌旁組織菌群進(jìn)行Tax4Fun功能分析，結(jié)果見圖7。由圖7A可知，2組菌群的功能相似，主要是代謝(metabolism)、基因信息處理(genetic information processing)和環(huán)境信息處理(environmental information processing)等，其中代謝通路和環(huán)境信息處理在功能豐度上具有極顯著性差異(P<0.01)。由圖7B可知，代謝功能主要包括碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)、能量代謝(energy metabolism)、核苷酸代謝(nucleotide metabolism)、輔助因子和維生素的代謝(metabolism of cofactors and vitamins)、聚糖生物合成與代謝(glycan biosynthesis and metabolism)?；蛐畔⑻幚砉δ苤胸S度較高的有膜轉(zhuǎn)運(yùn)(membrane transport)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)；環(huán)境信息處理功能中豐度較高的有翻譯(translation)和復(fù)制與修復(fù)(replication and repair)。根據(jù)組間t-test檢驗(yàn)，癌組織明顯升高的通路有翻譯(translation)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)、能量代謝(energy metabolism)、核苷酸代謝(nucleotide metabolism)、輔助因子和維生素的代謝(metabolism of cofactors and vitamins)等通路(P<0.05)；癌旁組織明顯升高的通路有膜轉(zhuǎn)運(yùn)(membrane transport)、復(fù)制與修復(fù)(replication and repair)、聚糖生物合成與代謝(glycan biosynthesis and metabolism)和脂質(zhì)代謝(lipid metabolism)等通路(P<0.05)(圖7C)。

圖7 Tax4Fun功能注釋相對豐度柱形圖(A)和t-test組間差異分析(B和C)

3 討論

有研究證實(shí)了癌癥患者的癌組織中存在菌群，并進(jìn)行了大致描述，發(fā)現(xiàn)每個癌癥患者的癌組織都有其獨(dú)特的菌群結(jié)構(gòu)，并與健康人群存在顯著性差異[8]。犬是常用于人癌癥研究的動物模型[14]，其骨癌組織中是否含有菌群，這一問題在國際上尚未明晰。因此本研究通過高通量測序手段分析患骨癌犬的癌組織與癌旁組織菌群的特異性以及多樣性，這對研究微生物與犬疾病的關(guān)系有著重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

16S rRNA高通量基因測序方法常用于難以培養(yǎng)的微生物的直接鑒定分析，該方法已成為研究環(huán)境樣本中微生物群落組成結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵技術(shù)[15-16]。本研究利用該方法對患犬的癌組織和癌旁組織的菌群進(jìn)行全面的檢測。盡管OUT準(zhǔn)確度為3%就可以確定細(xì)菌的種分類水平， 但也存在物種數(shù)量被低估的可能性[17-18]，因此對16S rRNA基因V3-V4區(qū)的菌群組成進(jìn)行了鑒定，并基于3%OUT間隙而非種水平分析菌群是從門到屬分類水平的組成。另外，骨癌癌組織菌群可能受到環(huán)境或者其他因素的影響，故剔除一些含量較低的OUT，選取相對豐度較高的門和屬進(jìn)行組間比較分析。本試驗(yàn)結(jié)果表明，患犬的癌組織中存在菌群，其種類與癌旁組織相比無明顯變化，2組樣本在門水平的菌群主要是變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)；在屬水平上主要是綠膿桿菌屬(Pseudomonas)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和鏈球菌屬(Streptococcus)，這些結(jié)果表明癌組織處的微環(huán)境對細(xì)菌的生長和分布影響較小。我們發(fā)現(xiàn)癌組織與癌旁組織的Alpha多樣性并無明顯差別(P>0.05)，其菌群的高度相似表明了癌性病變處的微環(huán)境對菌群特征影響較小。而Beta多樣性則有明顯差異，在門水平上，癌組織的擬桿菌門(Bacteroidetes)、廣古菌門(Euryarchaeota)、脫硫菌門(Desulfobacterota)以及螺旋菌門(Spirochaetota)相對豐度顯著高于癌旁組織(P<0.05)；在屬水平上，癌組織的甲烷桿菌屬、互營桿菌屬以及八疊球菌屬相對豐度顯著增加。這些研究結(jié)果表明，這些菌門與菌屬可能與犬骨癌的發(fā)生有關(guān)。為了進(jìn)一步篩選出2組存在顯著性差異的特異性細(xì)菌，我們進(jìn)行了LDA差異貢獻(xiàn)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2組共有27個物種存在顯著性差異，其中影響力最大的5個物種有硝化螺旋菌屬(Nitrosococcaceae)、反芻甲烷桿菌(Methanobacterium)、擬桿菌門(Bacteroidota)、Exilispira和假單胞菌科(Pseudomonadaceae)。

目前的數(shù)據(jù)雖然表明這些細(xì)菌與犬骨癌之間存在潛在聯(lián)系，但也不能夠排除上述菌屬在癌癥發(fā)生、發(fā)展中僅僅作為旁觀者存在的可能。它們在犬骨癌發(fā)生中的作用仍需進(jìn)一步研究。在胃腸道癌癥中發(fā)現(xiàn)，菌群組成發(fā)生改變，癌癥中增加的物種可以用作癌癥發(fā)現(xiàn)、風(fēng)險評估和預(yù)后的生物標(biāo)記物。本研究表明，在犬骨癌中，癌性病變部位的菌群特征存在改變，同時也發(fā)現(xiàn)了具有促癌特性的細(xì)菌，它們在犬骨癌中的作用有待進(jìn)一步研究。