楊 恒,李利財
(西南大學 動物醫(yī)學學院,重慶 榮昌 402460)
黃體(corpus luteum,CL)是雌性哺乳動物發(fā)情排卵后,由殘留的卵泡顆粒細胞和內膜細胞迅速增生變大,吸收大量黃色類脂質形成的一個暫時性內分泌器官。其主要由大、小CL細胞組成,能夠合成和分泌類固醇激素孕酮(progesterone,P4),對于維持妊娠具有不可或缺的作用[1-2]。正常繁殖周期內,如果卵子受精,這些CL細胞將分泌P4參與調節(jié)受精卵著床以及妊娠的早期維持。相反,在沒有受精的情況下,CL將會消融、體積縮小、功能降低,并在其位置留下一個小的疤痕狀結構,稱為白體。這一過程導致體內P4濃度下降,卵泡抑制被解除,從而促進卵泡生長、發(fā)情周期啟動[3]??梢?,CL形態(tài)和功能的改變在哺乳動物正常的生殖周期中發(fā)揮著重要的調控作用。
目前,普遍認為前列腺素家族(PGs)是調控CL形態(tài)和功能的主要“開關”,決定著周期性CL的壽命及其發(fā)展方向[2-4]。作為一種內源性的局部激素,PGs廣泛分布于哺乳動物體內,并涉及大量的生殖過程,例如排卵、著床、分娩、CL消融等[5-8]。早在1966年,BABOCK[9]報道并提出了子宮端釋放的PGs家族成員PGF2α是導致母體卵巢端CL發(fā)生周期性變化的重要物質,繼而開啟了PGF2α在哺乳動物繁殖領域的深入研究及廣泛應用。例如,JUENGEL等[10]研究發(fā)現(xiàn)低劑量PGF2α可引起CL功能減弱、體內P4含量呈現(xiàn)短暫降低,但并未導致CL體質量降低(即結構性溶解尚未發(fā)生);然而,高劑量PGF2α處理(10倍劑量)時,發(fā)現(xiàn)其體內P4含量顯著下降,并伴隨CL發(fā)生結構性溶解。類似地,CEZINANDE等[11]報道也發(fā)現(xiàn),較低劑量PGF2α處理時,母體體內P4水平24 h后會發(fā)生明顯降低,但在48 h后又再次升高;但較高劑量PGF2α處理時,其CL則會發(fā)生完全的功能性退化和結構性溶解,可見雌性動物CL溶解退化的程度可能與PGF2α劑量有關。然而,另一研究發(fā)現(xiàn),與單劑量相比,雙倍劑量PGF2α誘導母體發(fā)生完全CL溶解的比例更高,但3倍劑量時并未出現(xiàn)更有效的處理效果[12],提示在PGF2α誘導CL溶解退化過程中似乎存在一個臨界值,即在該臨界值范圍內PGF2α劑量的增加會使其CL溶解退化效果呈現(xiàn)相應的劑量依賴性關系。不過,有關PGF2α對雌性動物個體CL組織的功能變化及形態(tài)改變的劑量依賴性影響仍有待進一步研究。為此,本試驗設置5個不同劑量梯度,通過H.E染色觀察CL形態(tài)差異,ELISA檢測體內P4含量變化,同時利用RT-PCR檢測CL功能基因及凋亡相關基因表達情況,旨在探析雌性動物CL溶解與PGF2α劑量依存關系,為后續(xù)雌性動物繁殖技能障礙(如持久CL)及優(yōu)化PGs主導的高效繁殖技術方案研究奠定堅實的理論基礎。
1.1 實驗動物及飼養(yǎng)管理試驗動物購自重慶恩斯維爾生物技術有限公司,取60只60日齡、體質量相近(32±2)g,無繁殖障礙性疾病的健康雌性昆明小鼠(SPF級),飼養(yǎng)于西南大學動物醫(yī)學院動物房。同一飼養(yǎng)環(huán)境,室內溫度控制為25℃,自然光照,自由采食、飲水,定期更換墊料,做好消毒,保證飼養(yǎng)環(huán)境舒適。適應性飼養(yǎng)1周后用于試驗。
1.2 主要試劑PGF2α購自上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司;H.E染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;PrimeScriptTMRT Master Mix和TB Green Premix Ex TagⅡ購自日本TaKaRa公司;小鼠P4ELISA試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司。
1.3 小鼠發(fā)情周期監(jiān)測試驗小鼠適應性飼養(yǎng)1周后,逐一編號并標記。采用外陰觀察法、陰道脫落細胞涂片(H.E染色)監(jiān)測發(fā)情周期。觀察小鼠陰門開張狀態(tài)、黏膜顏色、陰道分泌物及其性質和外陰腫脹情況,拍照記錄。(1)小鼠陰道脫落細胞及觀察:將雌鼠保定,暴露陰道口,用無菌生理鹽水浸泡過的棉簽伸入小鼠陰道約0.5 cm,輕輕轉動棉簽,采集細胞,先橫向再縱向輕輕且均勻涂抹在干凈的載玻片上,自然晾干后進行H.E染色。(2)H.E染色操作步驟:95% 乙醇固定3 min;自來水沖洗30 s;蘇木素染色1 min 20 s;自來水沖洗30 s;伊紅染色1 min 30 s;自來水沖洗30 s;自然晾干,顯微鏡下觀察。參考文獻[13],各發(fā)情時期小鼠陰門狀態(tài)和陰道脫落細胞特點總結見表1。
表1 小鼠發(fā)情周期外部觀察和陰道細胞H.E染色鑒定方法
1.4 試驗小鼠腹腔注射處理通過外陰觀察法和陰道脫落細胞涂片,選擇發(fā)情周期正常的60只小鼠,隨機分為6組(n=10),進行陰道脫落細胞涂片直到發(fā)情間期(CL活躍期)時,按照不同劑量梯度(1,10,50,100,200 μg),腹腔注射PGF2α。
1.5 CL形態(tài)學觀察各組小鼠經腹腔注射藥物36 h 后(避免此時CL組織發(fā)生生理性周期性退化)頸椎脫臼方式處死,皮膚消毒后剪開皮膚,剝離皮下組織和肌肉。打開腹腔,快速摘取卵巢,在體視顯微鏡下將卵巢周圍的脂肪組織剝離干凈,分離CL,轉入無菌無酶凍存管。采集的子宮、卵巢組織于-80℃保存、備用。采集的CL用4%多聚甲醛直接固定,待包埋切片后,利用蘇木素-伊紅(H.E)染色,直接觀察CL組織形態(tài)。
1.6 血液采集、處理與激素測定小鼠斷頸處死前先采用眼眶取血法采血,轉入1.5 mL離心管中,室溫靜置1 h,4℃,3 000 r/min離心5 min,吸取上層淡黃色血清,轉入新的1.5 mL離心管,置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。利用酶?lián)免疫測定(ELISA)試劑盒檢測血清中的P4濃度,分析不同處理組中上述激素在體內的濃度變化。
1.7 qRT-PCR測定參照總RNA提取試劑盒說明書提取子宮、CL組織中總RNA,使用Nanodrop2000檢測RNA的純度及濃度。按照HiFiscript cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書反轉錄成cDNA,使用Nanodrop 2000檢測cDNA的純度及濃度,保存于-20℃。qRT-PCR檢測3個引物(表1),由Sangon Biotech公司合成。按照TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書操作實施qRT-PCR檢測:TB Green Premix Ex Tag Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL,PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.8 μL,PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.8 μL,ROX Reference Dye(50×)0.4 μL,DNA模板2 μL,滅菌水6 μL。PCR擴增程序為95℃預變性30 s;55個循環(huán):95℃ 5 s,56℃ 30~34 s。
表1 實時熒光定量PCR反應引物序列
1.8 統(tǒng)計分析試驗所得數(shù)據用GraphPad Prism 8.0軟件進行t檢驗分析,分析結果用柱狀圖表示,其中*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。
2.1 小鼠發(fā)情周期不同階段的陰門狀態(tài)及陰道細胞涂片使用陰門外部觀察法和卵巢切片H.E染色的方法監(jiān)測小鼠發(fā)情周期,每次涂片前記錄觀察其陰門開張、陰門黏膜顏色及外陰腫脹情況,連續(xù)跟蹤監(jiān)測3個發(fā)情周期。外觀結果顯示:發(fā)情前期(圖1A1)陰道口微張,外陰略有腫脹,黏膜呈淡粉紅色、較濕潤,有少量清亮陰道分泌物;發(fā)情期(圖1B1)陰門顯著擴張,黏膜潮紅,外陰皺襞腫脹明顯、濕潤,分泌物黏稠;發(fā)情后期(圖1C1)陰道口回縮、陰唇腫脹基本消退,黏膜呈灰白色,無分泌物;發(fā)情間期(圖1D1)陰門緊閉、如“Y”樣,黏膜蒼白、干燥、無分泌物,腫脹完全消退。H.E染色結果顯示:發(fā)情前期(圖1A2)以有核上皮細胞為主,部分白細胞,白細胞胞核溶解;發(fā)情期(圖1B2)幾乎為大而扁平的完全角化上皮細胞;發(fā)情后期(圖1C2)多為完全角化上皮細胞和白細胞,有核上皮細胞少量分布;發(fā)情間期(CL活躍期,圖1D2)細胞數(shù)量少,以白細胞為主,可見極少有核上皮細胞。通過上述監(jiān)測結果,發(fā)現(xiàn)昆明小鼠發(fā)情周期約為5~7 d,其中發(fā)情間期(即CL活躍期)約為3~4 d,這為準確判斷昆明小鼠CL活躍期及在此期開展PGF2α有關研究奠定了堅實基礎。
A.發(fā)情前期;B.發(fā)情期;C.發(fā)情后期;D.發(fā)情間期
2.2 不同PGF2α劑量處理后CL形態(tài)學變化采集不同劑量PGF2α處理小鼠的卵巢分別進行H.E染色,結果顯示:對照組中,小鼠的卵巢縱切面幾乎全部被CL組織覆蓋,各CL之間相互鄰接,且外周CL組織突出于卵巢表面(圖2A);1 μg PGF2α處理組中1/3卵巢縱切面被CL組織覆蓋,染色較淺,部分CL組織突出于卵巢表面,并伴有部分結構性溶解(圖2B);10 μg PGF2α處理組中卵巢縱切面僅有少部分CL組織覆蓋,CL發(fā)生明顯的結構性溶解(圖2C);50 μg PGF2α處理組中卵巢縱切面已無CL組織覆蓋,CL已發(fā)生完全結構性溶解,并伴有少量成熟卵泡發(fā)生(圖2D);100 μg PGF2α處理組中卵巢縱切面尚有大小不等的CL殘跡,CL組織僅發(fā)生不完全退化(圖2E);200 μg PGF2α處理組中4/5卵巢縱切面被CL組織覆蓋,且CL組織結構未發(fā)生明顯溶解,CL結構清晰可見(圖2F)。
A~F.分別為對照組(Control),1,10,50,100,200 μg PGF2α處理小鼠的卵巢組織H.E染色
2.3 不同PGF2α劑量處理后小鼠血清孕酮濃度變化血清P4水平的變化是活體CL功能性退化的重要標志。利用ELISA法檢測P4濃度,結果如圖3所示:與對照組相比,1,100 μg PGF2α處理組中小鼠血清中P4濃度呈顯著降低(P<0.05);10,50 μg PGF2α處理組中P4濃度呈極顯著下降(P<0.01);而高劑量200 μg PGF2α處理組中P4濃度變化不明顯。此外,結果顯示50 μg PGF2α處理時,小鼠血清中P4濃度出現(xiàn)明顯谷值(P<0.01)。
圖3 不同劑量PGF2α對CL溶解過程中P4濃度的影響
2.4 不同PGF2α劑量處理后孕酮合成關鍵基因表達變化StAR和3β-HSD是孕酮合成關鍵酶,可作為CL孕酮合成功能的可靠衡量指標。結果如圖4所示:與對照組相比,10 μg PGF2α處理組中StAR mRNA 表達量呈顯著下調(P<0.05),而50,100 μg 處理組中StAR mRNA 表達量呈極顯著下調(P<0.01),其余處理組中StAR mRNA表達量稍有下調但均不顯著(圖4A);同時,100 μg處理組中3β-HSD mRNA 表達量呈顯著下調(P<0.05),而50 μg處理組中3β-HSD mRNA 表達量呈極顯著下調(P<0.01),其余處理組中3β-HSD mRNA 表達量變化均不顯著(圖4B)。
圖4 不同組別中P4合成關鍵酶mRNA相對表達水平變化
2.5 不同PGF2α劑量處理后凋亡關鍵基因表達變化BAX/BCL-2/Caspase-3信號通路是CL發(fā)生結構性溶解的重要指征。結果如圖5所示:與對照組相比,10,100 μg PGF2α處理組中BAX mRNA相對表達量呈顯著上調(P<0.05),1,50,200 μg PGF2α處理組中BAX mRNA相對表達量呈極顯著上調(P<0.01)(圖5A);同時,10,200 μg PGF2α處理組中BCL-2 mRNA相對表達量顯著下調(P<0.05),50,100 μg PGF2α處理組中BCL-2 mRNA相對表達量呈極顯著下調(P<0.01)(圖5B);然而,相較于上述二者單獨來說,BAX/BCL-2比率是決定凋亡調控的關鍵因素,結果發(fā)現(xiàn)50 μg PGF2α處理組中BAX/BCL-2比值呈極顯著上調(P<0.01),其余4個處理組中BAX/BCL-2比值均呈顯著上調(P<0.05)(圖5 C)。此外,與對照組相比,10,100 μg PGF2α處理組中Caspase-3 mRNA相對表達量呈顯著上調(P<0.05),50 μg PGF2α處理組中Caspase-3 mRNA相對表達量呈極顯著上調(P<0.01),其余處理組Caspase-3 mRNA相對表達量變化均不顯著(圖5 D)。
圖5 不同組別中BAX/BCL-2/Caspase-3 mRNA相對表達水平變化
CL是雌性動物排卵后,經成熟卵泡轉變成的臨時性內分泌腺體,是建立和維持妊娠所必需的器官[4,14]。CL有規(guī)律的形成和溶解,是雌性動物生殖活動正常進行的關鍵。臨床上,CL溶解過早或功能不全會使P4分泌不足,導致母體妊娠時發(fā)生早產、流產或死胎[15];然而,當母體進入空懷期,CL仍持續(xù)存在時則會形成持久CL或CL囊腫,導致母體空懷期延長、繁殖效率降低[16]。因此,CL溶解在雌性動物正常生殖功能調控和胚胎妊娠維持與建立過程中發(fā)揮至關重要的作用。
前列腺素是膜磷脂的衍生物,其合成的底物來源于膜磷脂轉化得到的花生四烯酸,在花生四烯酸轉化為PGH2之后,根據存在的特定PG合酶,可以產生不同類型的PGs。目前,普遍認為PGE2是維持CL的重要保護介質,而PGF2α則是CL溶解的主效促溶素[17-18]。其中,作為在繁殖領域最受關注的PGs家族成員,PGF2α對于啟動CL溶解具有重要意義[18-19]。不過,大量研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)情周期中處于CL早期階段的CL對PGF2α并不會產生應答反應[20-21]?;诖耍驹囼灋榱舜_保PGF2α處理效果的準確性,在試驗開展前期,課題組針對本次試驗動物群體(昆明小鼠)進行了發(fā)情周期的監(jiān)測工作。通過陰門外部觀察和陰道細胞脫落H.E涂片,結果發(fā)現(xiàn)本試驗選擇的昆明小鼠發(fā)情周期為5~7 d;這與CALIGIONI[13]報道的小鼠發(fā)情周期特點相吻合,表明該組昆明小鼠群體發(fā)情周期正常、發(fā)情表現(xiàn)顯著,符合本試驗順利開展的先決條件。同時,依據發(fā)情周期的四期分法,我們發(fā)現(xiàn)該批次昆明小鼠間情期為3~4 d(CL活躍期),這為本試驗選擇在CL應答階段實施PGF2α處理提供了必要的試驗依據。
目前,大量研究證實母體的CL溶解過程與PGF2α之間存在一定的劑量依賴性關系。例如,JUENGEL等[10]和WATANABE等[22]研究發(fā)現(xiàn)低劑量PGF2α導致P4分泌減少,但不引起CL發(fā)生結構性溶解;相反,高劑量PGF2α不僅能夠引起P4分泌減少,而且還能夠促使CL出現(xiàn)結構性溶解。類似地,CUERVO-ARANGO等[23]研究報道,也進一步證實與單劑量PGF2α處理相比,雙劑量PGF2α處理的母體CL表現(xiàn)出了更完全的“消溶”現(xiàn)象;但是,與前者不同的是CUERVO-ARANGO等[24]在進行3倍劑量PGF2α處理時發(fā)現(xiàn),此時母體的CL溶解效果并未隨著PGF2α劑量的遞增而出現(xiàn)明顯的優(yōu)勢“促溶”效應,提示PGF2α在母體中對CL的“促溶”作用并非一直呈正相關性,而是存在劑量/效應的臨界值。本試驗通過設置1,10,50,100,200 μg PGF2α5個不同劑量梯度處理間情期昆明小鼠,H.E染色觀察小鼠CL形態(tài)學變化發(fā)現(xiàn),PGF2α在50 μg劑量處理時呈現(xiàn)出最佳的CL“促溶”效應;而當其劑量遞增或遞減時均會表現(xiàn)出弱于前者的“促溶”作用,這一結果與GRANADOS-VILLARREAL等[25]運用不同梯度處理母羊CL時觀察得到的CL溶解結果一致。因此,在本試驗中,研究表明PGF2α對母體內的CL“促溶”效應與其劑量之間存在特定的臨界值,即僅在該臨界值范圍內,PGF2α對其母體的CL溶解效果才會呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。
CL溶解主要包括功能性退化和結構性溶解兩個階段,前者主要表現(xiàn)為P4水平的下降,而后者則主要表現(xiàn)為CL組織的細胞凋亡,最終促使CL發(fā)生結構性溶解[26-27]。首先,在CL功能性退化中,P4濃度的變化,是CL溶解過程中必不可少的關鍵環(huán)節(jié)。大量研究顯示,CL退化過程中PGF2α水平的升高,通常會引起雌性動物體內P4分泌水平的下降[24,26-28]。不過,JUNIOR等[29]在研究瘤牛的CL溶解時發(fā)現(xiàn),高劑量PGF2α處理母體時,并不總是誘導P4含量發(fā)生顯著地變化,提示 PGF2α在CL的功能性退化過程中可能存在一定的劑量依賴性范圍。在本試驗中,通過ELISA法檢測上述昆明小鼠外周血液的P4含量發(fā)現(xiàn),PGF2α在50 μg劑量時昆明小鼠體內的P4含量呈現(xiàn)最低水平;與此類似,qRT-PCR結果顯示,P4關鍵合成酶基因StAR和3β-HSD mRNA在PGF2α50 μg劑量時在昆明小鼠的CL中也呈現(xiàn)最低表達;這一結果與上述ELISA檢測P4水平結果一致,說明在母體中CL的功能性退化效果確實與PGF2α劑量之間存在特定的臨界值,即僅在該臨界值范圍內,CL的功能性退化程度才會呈現(xiàn)最佳劑量依賴性效果。不過,相較于功能性退化,CL結構性溶解顯示出更為完全的CL組織的消失,主要表現(xiàn)為CL的細胞凋亡、引起CL組織結構的消融[30-31]。眾所周知,BCL-2家族是介導細胞凋亡的重要調控中心[32-33];其中,抗凋亡BCL-2基因和促凋亡BAX基因是調節(jié)細胞存活和凋亡的兩種關鍵因子[34],尤其是二者的比率變化更被認為是啟動細胞凋亡發(fā)生的關鍵閘門[35]。有研究顯示,與中期CL和妊娠早期CL相比,抗凋亡BCL-2基因在退行期CL中呈現(xiàn)較低表達,而促凋亡BAX基因則呈現(xiàn)較高表達[36-37],同時伴隨著BAX/BCL-2比率的顯著增加[38-39],這一結果提示BAX和BCL-2基因表達在CL退化溶解過程中發(fā)揮著重要作用。在本試驗結果顯示,隨著PGF2α劑量的變化,BAX和BCL-2基因的表達也分別呈現(xiàn)不同程度的遞增或遞減;但卻在50 μg時出現(xiàn)了明顯的峰值與谷值,尤其是在此劑量時二者之間的比率呈現(xiàn)了唯一極顯著上調(P<0.05),說明PGF2α在該臨界值時表現(xiàn)出了最佳的促CL結構性溶解效果[12]。此外,作為細胞凋亡的最后執(zhí)行者,Caspase-3在各種因素啟動的凋亡程序中均起著最后樞紐的作用[39-41]。目前,已有大量研究證實,在不同的動物中,PGF2α均能夠誘導CL中Caspase-3基因表達上調,從而開啟CL細胞的凋亡過程[40-42]。類似地,在本試驗中,研究結果也顯示不同劑量的PGF2α處理組別中,Caspase-3基因的表達水平均呈現(xiàn)了不同程度的上調,且其表達變化趨勢與上述BAX/BCL-2比率變化趨勢結果一致,即在PGF2α50 μg時呈現(xiàn)最高水平,進一步說明PGF2α在該臨界值時呈現(xiàn)出了最佳的促CL結構性溶解效應。因此,我們不難發(fā)現(xiàn)無論是在CL的功能性退化中還是在結構性溶解中,PGF2α對CL的溶解效果確實存在特定的劑量臨界值范圍,即僅在該范圍內二者之間才會呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性關系。
總之,本試驗通過監(jiān)測昆明小鼠的發(fā)情周期,在明確了小鼠的CL活躍期的前提下,開展PGF2α劑量依賴性試驗,發(fā)現(xiàn)外源性PGF2α對母體的CL溶解效果(功能性退化和結構性溶解)存在一定的劑量依賴性關系。但是,這種劑量依賴性關系存在一定的臨界值,即僅在該臨界值范圍內,PGF2α才會與CL溶解呈現(xiàn)最佳的劑量依賴性效果,這為探析雌性動物的繁殖障礙性疾病機理(如持久CL或CL囊腫)、優(yōu)化PGF2α主導的高效繁殖技術方案提供了新的科學依據。