李兆龍，豐志華，張冰晨，方 舟，梁旺旺，陳文志

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013；2.福建師范大學(xué) 南方生物醫(yī)學(xué)研究中心，福建 福州 350013)

豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)是豬傳染性胃腸炎的病原，不同種類(lèi)和不同日齡豬都呈現(xiàn)易感性。以往該病主要在冬季較為常見(jiàn)[1]。但近幾年，隨著養(yǎng)殖密度和規(guī)模增加，呈現(xiàn)一年四季皆有發(fā)病。它主要臨床癥狀為嘔吐、脫水和嚴(yán)重腹瀉等。而中大豬和成年母豬感染后病死率低，但哺乳仔豬感染后發(fā)病率和病死率可達(dá)100%，是我國(guó)當(dāng)前生豬養(yǎng)殖中的一種固疾，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大的損失。為了進(jìn)一步加強(qiáng)該病的防控，有必要深入研究TGEV的感染機(jī)制，為藥物和疫苗開(kāi)發(fā)，或抗病品種研發(fā)奠定基礎(chǔ)[2]。之前研究報(bào)道，氨基肽酶(pAPN)是TGEV侵染的主要受體，豬體內(nèi)的pAPN敲除后，明顯抑制TGEV的侵染，減少TGEV的發(fā)病率[3-5]。但是，TGEV的侵染方式多樣，pAPN敲除不足以完全抑制TGEV的感染[6]。此外，唾液酸神經(jīng)氨酸酶(NEU3)作為病毒侵染的另一個(gè)重要中間體，發(fā)揮重要的作用[10-11]。病毒的侵染是一個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)，詳細(xì)的作用機(jī)理尚待進(jìn)一步揭示。pAPN和NEU3共同敲除是否能更好地抑制該病毒的入侵，尚待進(jìn)一步的研究。

本試驗(yàn)旨在運(yùn)用CRISPR基因敲除技術(shù)，對(duì)ST細(xì)胞中的pAPN和NEU3雙基因共同敲除，以評(píng)估它對(duì)TGEV的入侵影響，從而推動(dòng)相關(guān)疫苗和抗TGEV品種豬的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)細(xì)胞、細(xì)菌和質(zhì)粒ST細(xì)胞購(gòu)上海英杰生物科技有限公司；pX459購(gòu)自美國(guó)Addagen公司。

1.2 試劑本試驗(yàn)所用試劑及來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 試劑及來(lái)源

1.3 引物及sgRNA為了敲除ST細(xì)胞中的pAPN和NEU3基因，參照sgRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站:https://zlab.bio/guide-design-resources進(jìn)行雙基因的sgRNA設(shè)計(jì),并送測(cè)序公司合成。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)圖1。本研究設(shè)計(jì)了針對(duì)pAPN 和NEU3兩個(gè)關(guān)鍵基因CRISPR基因編輯系統(tǒng)，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，然后挑取單克隆細(xì)胞，測(cè)序驗(yàn)證。再將TGEV感染pAPN 和NEU3兩個(gè)關(guān)鍵基因敲除的ST細(xì)胞，觀察對(duì)細(xì)胞病變的改善、TGEV滴度的影響、干擾素的mRNA水平變化等指標(biāo)，以評(píng)估它對(duì)TGEV侵染的影響。

1.5 重組編輯兩目標(biāo)基因載體的構(gòu)建本研究中使用的sgRNA是在sgRNA Designer:CRISPRko (broadinstitute.org)網(wǎng)站上設(shè)計(jì)，針對(duì)pAPN 和NEU3兩個(gè)關(guān)鍵基因設(shè)計(jì)多個(gè)sgRNA(表2)，由福州鉑尚生物科技公司合成，合成后的sgRNA退火，與酶切的Px459編輯質(zhì)粒按相關(guān)體系組成進(jìn)行連接，見(jiàn)表3。連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌DH5a，然后挑取單克隆菌，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并提DNA，將擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物送福州鉑尚生物科技公司測(cè)序驗(yàn)證。sgRNA退火體系：10×PCR 緩沖液2.5 μL，F(xiàn)-sgRNA 1 μL，R-sgRNA 1 μL，雙蒸水20.5 μL， 共計(jì)25 μL。

表2 sgRNA名稱(chēng)及序列

表3 驗(yàn)證引物

將sgRNA的各組分依次加入后混勻，再低速離心20 s。將各反應(yīng)物放置反應(yīng)管進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：初始溫度 95℃，進(jìn)行10 min；然后進(jìn)行梯度溫度處理：按95℃～85℃，2.5℃/s；85℃～25℃，0.25℃/s；25℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后取3 μL反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)驗(yàn)證。雙酶切體系:質(zhì)粒(1 μg)，10×Fast 緩沖液2 μL，快消化酶-F 1 μL，快消化酶-F-R 1 μL，雙蒸水補(bǔ)足25 μL，總計(jì)25 μL。

將質(zhì)粒所需各組分，按上表安排，依次加入后低速離心混勻20 s，后37℃維持15 min，取3 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)驗(yàn)證。連接反應(yīng)體系:10×T4DNA緩沖液2.5 μL， sgRNA2質(zhì)粒70 ng， T4DNA 連接酶1 μL，雙蒸水補(bǔ)足25 μL，總計(jì)25 μL。

按連接試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行常規(guī)的連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到50 μL感受態(tài)細(xì)胞，于 37℃培養(yǎng)1 h，再3 000 r/min離心，再用20 μL重懸液，后均勻涂至含AMP的LB平板，置37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。18 h后，挑取單克隆并加入2 mL LB，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)14 h。然后吸取單克隆菌液300 μL 送至福州鉑尚測(cè)序公司測(cè)序驗(yàn)證，將測(cè)序結(jié)果使用bioedit軟件進(jìn)行比對(duì)分析驗(yàn)證。

1.6 構(gòu)建pAPN 和NEU3兩個(gè)關(guān)鍵基因敲除ST細(xì)胞

1.6.1構(gòu)建 將構(gòu)建成功的重組編輯質(zhì)粒Px459-pAPN和Px459-NEU3，按1∶2的比例加入脂質(zhì)體LIPO2000，混勻并加入20 μL體積的無(wú)血清培養(yǎng)基。待6孔板ST細(xì)胞長(zhǎng)至匯合度70%時(shí)，用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗2次，然后加入轉(zhuǎn)染混合液，37℃培養(yǎng)18 h。去除轉(zhuǎn)染混合液，加入正常的血清培養(yǎng)液，并按100 mg/L加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選；4～7 d后，去除含嘌呤霉素的培養(yǎng)液，加入新鮮DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)大概12 h后，放置顯微鏡觀察，可見(jiàn)微小單克隆細(xì)胞群落，然后在鏡下挑取單個(gè)克隆，放置新的培養(yǎng)皿，加入新的培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。擴(kuò)大培養(yǎng)后收取克隆細(xì)胞，提取總DNA進(jìn)行pAPN-/-和NEU3-/-雙基因敲除PCR驗(yàn)證。然后利用Western blot在蛋白水平上驗(yàn)證pAPN-/-和NEU3-/-雙基因敲除細(xì)胞株。

1.6.2PCR及Western blot驗(yàn)證 為了進(jìn)一步驗(yàn)證單克隆細(xì)胞株是否成功敲除pAPN和NEU3雙基因，我們?cè)O(shè)計(jì)了2對(duì)引物，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，引物序列如表3。細(xì)胞基因組DNA的提取見(jiàn)常規(guī)DNA提取試驗(yàn)盒操作(略)。PCR驗(yàn)證反應(yīng)體系：5×PCR反應(yīng)混合液(Mix)25 μL，模板5 μL，雙蒸水20 μL。反應(yīng)條件：42℃ 2 min，4℃保存。免疫印跡試驗(yàn):配置10%的分離膠，并加入到制膠板底層，為了去除分離膠內(nèi)的氣泡并保持分離膠的平行，在加完分離膠前加入水壓平放置15 min。用濾紙將分離膠上層的水吸干凈，再緩緩加入5%的濃縮膠，并插入加樣梳，放置40 min；接著輕緩拔除凝膠上的梳子，再重新把膠板放入電泳槽，添加一定比例的電泳緩沖液，當(dāng)緩沖液沒(méi)過(guò)長(zhǎng)玻璃板后，停止添加。待液面靜止5 min，用加樣器往凝膠上樣孔加入蛋白樣品。然后打開(kāi)電泳儀電源，設(shè)置恒壓80 V 持續(xù)20 min，后調(diào)整電壓至120 V持續(xù)約100 min；關(guān)閉電源，廢棄上層的濃縮膠，再用刀片將含有目的蛋白和內(nèi)參蛋白的凝膠切下放置4℃冰箱保存及待用。接著再根據(jù)本次凝膠大小來(lái)裁剪濾紙和PVDF膜，將膠、PVDF膜和濾紙浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液10～20 min后，先鋪好3層濾紙，用玻璃管除去氣泡，將膠水涂在去除氣泡的濾紙上，然后將PVDF膜覆蓋在膠水上，輕輕去除氣泡，將靠近膠水的一側(cè)指向黑板，靠近薄膜的一側(cè)與白板對(duì)齊。組裝改進(jìn)的薄膜裝置，再安裝一個(gè)改進(jìn)的膜，300 mA恒定電流至50 min；電轉(zhuǎn)后，取膜，沖洗靠近膠水的一側(cè)，用TBST(5×TBS稀釋0.05%吐溫-20)沖洗3次。封閉反應(yīng)：室溫下(25℃)，用10%脫脂奶粉或5%BSA封閉PVDF膜1 h。抗原抗體反應(yīng)：蛋白一抗按抗體規(guī)格比例加入，4℃搖床過(guò)夜孵育。 第2天，取出PVDF膜，用TBST沖洗3次，每次10 min，然后加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h，再用TBST沖洗PVDF膜，每次10 min；每片掃描膜用雙色紅外激光成像儀觀察(Odysey)，CorelDRAW12軟件分析繪圖。

1.7 TGEV感染pAPN 和NEU3雙基因敲除ST細(xì)胞分別取1.1×106個(gè)/mL ST細(xì)胞和pAPN和NEU3雙基因敲除的ST細(xì)胞，分別放置4個(gè)6孔板，過(guò)夜培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁完成后，加入1.1×105TCID50/mL的TGEV，并分別于3，6,12,24,36，48 h在顯微鏡下觀察并拍照記錄細(xì)胞的病變情況。同時(shí)收集一孔細(xì)胞，提取細(xì)胞中的病毒RNA和細(xì)胞中干擾素的mRNA，然后實(shí)時(shí)定量驗(yàn)證TGEV的拷貝數(shù)變化、干擾素的mRNA水平及TGEV的纖連蛋白mRNA水平。RNA提取過(guò)程如下：按10 cm2/mL 比例加入Trizol，對(duì)培養(yǎng)貼壁的兩種ST細(xì)胞進(jìn)行消化、裂解，轉(zhuǎn)移至離心管于室溫放置5 min，使其充分裂解；Trizol和氯仿按1∶0.2比例添加，溫和地混勻，再室溫(25℃)放置15 min；然后在4℃離心機(jī)中按轉(zhuǎn)速 12 000 r/min離心15 min；取出離心管，小心地吸取上層液體，將其轉(zhuǎn)移至另一根干凈的離心管中；再按1∶0.5的比例(Trizol∶異丙醇)加入異丙醇,上下輕輕搖混勻，室溫25℃放置5～10 min； 再經(jīng)4℃ 12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，小心棄上清,以1∶1 加入75%乙醇，溫和地溫勻；4℃ 8 000 r/min離心5 min，棄上清,室溫干燥5～10 min.

1.8 Real-time PCR相對(duì)定量法檢測(cè)基因的表達(dá)情況要求各引物的擴(kuò)增效率在90%～110%之間，各個(gè)引物的擴(kuò)增效率相差不超過(guò)5%。用不同引物對(duì)模板進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物純化后導(dǎo)入T載體。然后以108拷貝為起始濃度，依次10倍稀釋5個(gè)梯度，摸索出最佳PCR擴(kuò)增條件，再對(duì)樣本進(jìn)行相對(duì)定量。Real-time PCR反應(yīng)系列：SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus) ROX Plus 10 μL,上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，下游引物Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μL，mRNA溶液(30 mg/L) 3 μL，雙蒸水ddH2O 7.2 μL，總計(jì)20 μL。反應(yīng)條件： 95℃ 30 s；95℃ 5 s,55℃ 30 s，72℃ 30 s，40 cycles。熔解曲線階段：95℃ 15 s，72～88℃，每個(gè)周期0.1℃遞增。所用實(shí)時(shí)熒光PCR引物見(jiàn)表4。

表4 實(shí)時(shí)定量PCR引物

2 結(jié)果

2.1 pAPN 和NEU3雙基因敲除ST細(xì)胞挑取經(jīng)嘌呤霉素篩選的pAPN 和NEU3雙基因敲除ST單克隆細(xì)胞，提取細(xì)胞的基因組，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果產(chǎn)生預(yù)期的2個(gè)條帶，分別為2 881，1 349 bp，與預(yù)期的引物結(jié)果一致(圖2)。然后將該P(yáng)CR產(chǎn)物測(cè)序，結(jié)果證實(shí)分別在pAPN 和NEU3的245和227 bp 位置出現(xiàn)堿基缺失。用pAPN 和NEU3的雙抗，進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，野生型細(xì)胞完全能孵出預(yù)期的條帶，但敲除株的ST細(xì)胞在預(yù)定位置并沒(méi)有明顯的條帶。結(jié)果證實(shí)pAPN 和NEU3雙基因在ST細(xì)胞中成功敲除，該基因的蛋白表達(dá)或受到抑制，或結(jié)構(gòu)遭破壞。

由圖2可知，在單克隆細(xì)胞中，吸取200 μL提取基因組DNA，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果在2 881和1 349 bp位置出現(xiàn)了條帶，證明篩選得到了雙基因敲除的細(xì)胞株。

M.DL5000 DNA Marker；1,2.陰性克?。?,4.陽(yáng)性克隆

由圖3可知，將 2 881，1 349 bp位置出現(xiàn)的條帶測(cè)序，結(jié)果證實(shí)245，227 bp位置出現(xiàn)堿基缺失。

圖3 pAPN 和 NEU3雙基因敲除測(cè)序結(jié)果

由圖4可知， 取245，227 bp位置出現(xiàn)堿基缺失的ST細(xì)胞，進(jìn)行蛋白免疫印跡試驗(yàn)，敲除株的ST細(xì)胞pAPN蛋白表達(dá)明顯減弱，而NEU3完全看不到。

圖4 pAPN和NEU3的敲除及免疫印跡印證

2.2 TGEV感染pAPN 和NEU3雙基因敲除ST細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的影響將1.1×105TCID50/mL的TGEV感染pAPN和NEU3雙基因敲除的ST細(xì)胞和野生型ST細(xì)胞，6 h后，野生型ST細(xì)胞出現(xiàn)部分細(xì)胞病變，感染TGEV 12 h，野生型細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞聚集和死亡的細(xì)胞病變，24，36 h后，野生型細(xì)胞的聚集、拉網(wǎng)和死亡的細(xì)胞病變現(xiàn)象比雙基因敲除的ST細(xì)胞更為明顯(圖5)

圖5 TGEV感染pAPN 和NEU3雙基因敲除ST細(xì)胞和野生型ST細(xì)胞

2.3 TGEV感染pAPN 和NEU3雙基因敲除ST細(xì)胞明顯下調(diào)了干擾素和纖連蛋白的產(chǎn)生Beta干擾素是機(jī)體產(chǎn)生的一類(lèi)糖蛋白，它具有高度的種屬特異性。當(dāng)機(jī)體感染病毒時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的干擾素來(lái)抵制病毒的增殖。因此，在本試驗(yàn)中，通過(guò)干擾素的mRNA水平，間接地反映初期病毒的強(qiáng)弱，當(dāng)前期感染病毒較強(qiáng)，激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)就大，產(chǎn)生的Beta干擾素水平就較高。pAPN和NEU3雙基因敲除ST細(xì)胞，產(chǎn)生的干擾素水平遠(yuǎn)低于野生型細(xì)胞，這個(gè)結(jié)果間接說(shuō)明敲除細(xì)胞內(nèi)的病毒量可能低于野生型細(xì)胞(圖6)。

圖6 干擾素mRNA

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，TGEV感染pAPN和NEU3雙基因敲除ST細(xì)胞，產(chǎn)生的Beta干擾素mRNA遠(yuǎn)低于野生型細(xì)胞，差異極顯著(*P<0.05， ***P<0.001)。

TGEV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，病毒直徑為90～200 nm，它的主要結(jié)構(gòu)蛋白是纖突(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣殼(N)蛋白。因此，我們將細(xì)胞中TGEV的纖突(S)蛋白的mRNA作為T(mén)GEV侵染細(xì)胞的標(biāo)志。結(jié)果表明，野生型細(xì)胞感染TGEV后，細(xì)胞中病毒的S蛋白的mRNA在108，而pAPN和NEU3雙基因敲除ST細(xì)胞S蛋白的mRNA還不足102，遠(yuǎn)低于野生型細(xì)胞，差異極顯著。結(jié)果表明pAPN和NEU3雙基因敲除ST細(xì)胞可能抑制了病毒的入侵(圖7)。

圖7 TGEV的S蛋白的mRNA

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，TGEV感染pAPN和NEU3雙基因敲除ST細(xì)胞，產(chǎn)生的S蛋白mRNA遠(yuǎn)低于野生型細(xì)胞，差異極顯著(*P<0.05， ***P<0.001 )。

2.4 不同滴度的TGEV感染pAPN 和NEU3雙基因敲除ST細(xì)胞為進(jìn)一步驗(yàn)證pAPN 和NEU3雙基因敲除ST細(xì)胞可以抑制TGEV的入侵，用不同滴度的TGEV侵染pAPN 和NEU3雙基因敲除ST細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)和對(duì)照組細(xì)胞相比，在2.2×104，4.4×104，4.4×105，8.8×105TCID50/mL的細(xì)胞病變明顯較輕，并且隨著滴度增加，敲除細(xì)胞并沒(méi)有明顯的變化。而對(duì)照組細(xì)胞，隨著滴度上升，細(xì)胞病變更為明顯(圖8)。

圖8 不同滴度的TGEV感染pANA和NEU3敲除ST細(xì)胞和野生型細(xì)胞

3 討論

有研究證實(shí)，pAPN是TGEV侵染機(jī)體的主要受體，將豬體內(nèi)的pAPN敲除，會(huì)明顯抑制TGEV的侵染，減少TGEV的發(fā)病率[7-10]。但是，TGEV的侵染方式多樣，pAPN敲除不足以完全抑制TGEV的感染。NEU3作為病毒侵染的另一個(gè)重要中間體，發(fā)揮了重要的作用[10-11]。本研究結(jié)果證實(shí)，將pAPN和 NEU3雙敲的ST細(xì)胞，不管是病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白，還是病毒感染引起的Beta干擾素的水平，都明顯比對(duì)照野生型低，細(xì)胞的病變也不明顯。此外，我們用不同滴度的TGEV侵染雙基因敲除細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它的細(xì)胞病變并不隨著感染滴度的增加而變化。此結(jié)果從另一個(gè)層面說(shuō)明，pAPN和NEU3雙敲，對(duì)TGEV的侵染有更為明顯的抑制，但對(duì)病毒滴度的變化，還有待進(jìn)一步研究。

本研究中，將纖突蛋白作為病毒在體內(nèi)滴度變化的主要指征，主要基于TGEV主要結(jié)構(gòu)蛋白是纖突(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣殼(N)蛋白[12]。其中，以S蛋白尤為重要，也常作為病毒變異或毒力變化的指征[13]。

這個(gè)在人的冠狀病毒中，尤為多見(jiàn)。近來(lái)發(fā)生的新冠病毒，大多以S蛋白作為研究的核心，不管是從檢測(cè)還是疫苗的研究等。因此，在本研究將S蛋白的mRNA作為T(mén)GEV侵染細(xì)胞的標(biāo)志。從細(xì)胞病變以及Beta干擾素的結(jié)果也證實(shí)，S蛋白作為病毒在體內(nèi)滴度變化的主要指征，是能正確反映病毒侵染細(xì)胞的情況。

此外，我們將Beta干擾素作為病毒侵染細(xì)胞初期情況的其中一個(gè)指征，也是基于大部分病毒侵染機(jī)體或細(xì)胞，都會(huì)激起機(jī)體強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生大量的Beta干擾素[14]。病毒滴度越高或毒力越強(qiáng)，產(chǎn)生的Beta干擾素量就越大。因此，它在一定程度，反映了病毒侵染細(xì)胞的強(qiáng)弱和病毒滴度的高低。但它并不能替代病毒的滴度測(cè)定，它只能間接反映病毒的入侵情況。

本研究結(jié)果顯示，pAPN和 NEU3雙敲的ST細(xì)胞可明顯減少TGEV入侵，病毒的拷貝數(shù)明顯低于對(duì)照組，并且病毒滴度的增加對(duì)細(xì)胞的病變改變不明顯；因此pAPN和 NEU3雙敲，可為將來(lái)抗TGEV豬的選育和抗TGEV的藥物篩選提供理論基礎(chǔ)。