趙 安，郭長(zhǎng)權(quán)，周 爍，吳楊楊，張才喬，米玉玲

(浙江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族是卵巢內(nèi)最重要的卵泡發(fā)生調(diào)節(jié)因子之一，包括BMPs、激活素、抑制素、生長(zhǎng)分化因子和抗繆勒氏管激素，其主要功能是調(diào)節(jié)組織的生長(zhǎng)和發(fā)育，包括細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[9-11]。其中，BMP15的研究最為廣泛。BMP15在卵母細(xì)胞中特異性表達(dá)，對(duì)原始卵泡的激活和發(fā)育起到關(guān)鍵作用。BMP15基因突變的小鼠在卵泡發(fā)育的初級(jí)階段受阻最終無(wú)法生育[12]。缺乏BMP15的雌性大鼠的排卵率和受精率顯著下降[13]。盡管這些研究表明BMP15可能參與卵泡生長(zhǎng)和發(fā)育的調(diào)節(jié)，但其在雛雞卵巢中對(duì)原始卵泡發(fā)育的影響尚不清楚。

BMP15通過(guò)TGF-β家族受體BMPR2和BMPR1B(ALK6)調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖，對(duì)雞卵泡顆粒細(xì)胞具有促分化作用[14]。BMP15在顆粒細(xì)胞表面與BMP受體1B(BMPRIB/ALK-6)或BMP受體(BMPRII)復(fù)合物結(jié)合[15]后，激活細(xì)胞內(nèi)Smad1/5/8信號(hào)通路。Smad4是常見的協(xié)同Smad作用蛋白(co-Smad)，參與激活BMP和TGF-β/激活素的信號(hào)通路[16]。BMP15以劑量依賴的方式通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路Smad1/5/8來(lái)促進(jìn)人原始卵泡的激活[17]。此外，已有研究表明，Smad5突變使小鼠原始生殖細(xì)胞的數(shù)量減少[18]。因此，BMP15可通過(guò)Smad1、Smad5和Smad4信號(hào)通路激活原始卵泡。

本試驗(yàn)采用雛雞卵巢組織的體外培養(yǎng)模型和體內(nèi)注射試驗(yàn)，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察以及細(xì)胞的增殖和凋亡檢測(cè)，探索BMP15在雞早期卵巢中對(duì)原始卵泡激活和發(fā)育過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用，為提升家禽繁殖性能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器BMP15購(gòu)自武漢云克隆公司；青霉素-鏈霉素溶液、DMEM和胎牛血清(FCS)購(gòu)自Hyclone公司；胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鹽和溴脫氧嘧啶核苷(BrdU)購(gòu)自Sigma公司；ML347購(gòu)自MedChem Express公司；兔抗BMPR1B、兔抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、兔抗BCL2、兔抗人單克隆抗體(BAX)、兔抗Smad1、兔抗Smad4、兔抗Smad5、兔抗連接蛋白43(CX43)、鼠抗β-actin、HRP-標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP-標(biāo)記山羊抗鼠IgG、TRITC或FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG、TRITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG購(gòu)自華安生物公司；兔抗細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、抗細(xì)胞周期蛋白D1(CCND1)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、30%丙烯酰胺、TEMED購(gòu)自博士德公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、RIPA、PMSF購(gòu)自碧云天公司；鼠抗BrdU購(gòu)自DSHB公司；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)試劑盒、HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、ChamQ SYBR qPCR Master Mix購(gòu)自南京維諾贊公司；TRIzol購(gòu)自Invitroge公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自南京建成公司；PageRulerTMPrestained Protein Ladder購(gòu)自Thermo公司。

1.2 動(dòng)物和組織制備海蘭蛋雞受精種蛋(購(gòu)自杭州市正大肉雞場(chǎng))置于溫度38.5℃、濕度60%的孵化箱中孵育至出雛。雛雞在適宜的條件下飼養(yǎng)，所有操作均按照浙江大學(xué)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指導(dǎo)原則》(ZJU20170660)進(jìn)行。將BMP15溶于無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中，于出雛后第4天按0.2，1.0，5.0 μg/kg 的劑量連續(xù)注射(i.p.)3 d，對(duì)照組注射PBS。3 d后將雛雞處死，取出卵巢用于形態(tài)學(xué)觀察，或凍存于液氮中用于Western blot試驗(yàn)。

1.3 卵巢組織培養(yǎng)將4日齡雛雞卵巢切成2～3片進(jìn)行組織培養(yǎng)。將0.45 μm濾膜放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning Inc.,NY,USA)，每孔放入2片卵巢組織，加入750 μL的培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)液中添加了100 IU/mL青霉素-鏈霉素、5%FCS、10 mg/L 胰島素、5 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白和30 nmol/L亞硒酸鹽。BMP15的處理劑量分別為20,100,500 μg/L。每24 h更換培養(yǎng)液1次。

1.4 對(duì)BMPR1B的抑制作用體外試驗(yàn)中，4日齡雛雞卵巢組織用10 μmol/L ML347和100 μg/L BMP15單獨(dú)或聯(lián)合培養(yǎng),培養(yǎng)3 d后收集卵巢組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析和生化檢測(cè)。

大學(xué)生學(xué)習(xí)目標(biāo)不明確，缺乏學(xué)習(xí)動(dòng)力，學(xué)習(xí)興趣不高，自控能力差 大學(xué)相對(duì)寬松自由開放的環(huán)境，使得大學(xué)生有較多的自主時(shí)間，與高中高強(qiáng)度的、目標(biāo)明確的學(xué)習(xí)形成鮮明的對(duì)比，極易產(chǎn)生放松心態(tài)。一些大學(xué)生沒(méi)能形成合理的人生規(guī)劃，沒(méi)有確定的學(xué)習(xí)目標(biāo)，學(xué)習(xí)動(dòng)力不足，學(xué)習(xí)興趣不高，面對(duì)相對(duì)閑暇的時(shí)光，加之自控能力差，難免會(huì)迷失方向。而手機(jī)功能日趨豐富，誘惑力大，導(dǎo)致他們用手機(jī)打發(fā)時(shí)間，并自然而然地在課堂上使用手機(jī)。

1.5 免疫組織化學(xué)卵巢切片脫蠟浸水后，用3% H2O2溶液在室溫下完全覆蓋切片20 min，將切片浸沒(méi)在0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中20 min(98～100℃)修復(fù)抗原，PBS漂洗后用山羊血清封閉，室溫孵育25 min。此后滴加一抗，包括兔抗BAX(1∶200)、兔抗CDK2(1∶200)、兔抗PCNA(1∶200)和兔抗CCND1(1∶200)，切片在4℃下孵育過(guò)夜。第2天用PBS洗3次后滴加HRP-標(biāo)記山羊抗兔IgG，37℃濕盒中孵育1 h。用DAB顯色2～10 min，鏡檢觀察，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封固以及鏡檢。每組至少采集3個(gè)卵巢，每個(gè)卵巢最大橫截面連續(xù)5張切片進(jìn)行免疫組化,在顯微鏡(Nikon，Eclipse 80i)下觀察拍照。

1.6 免疫熒光染色卵巢切片滴加兔抗BMPR1B或兔抗PCNA(1∶200)后在4℃孵育過(guò)夜。第2天切片復(fù)溫1 h后用PBS洗3次，用FITC或TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為二抗，37℃孵育1 h，再用DAPI進(jìn)行復(fù)染。連續(xù)取各卵巢組織最大橫截面5片,采用熒光顯微鏡觀察拍照。

1.7 BrdU檢測(cè)卵巢組織培養(yǎng)48 h后，在含有10 μg/mL BrdU標(biāo)記液的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。切片在鼠抗BrdU作為一抗在4℃孵育過(guò)夜后，PBS洗3次。用TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為二抗孵育1 h，DAPI對(duì)切片復(fù)染。每組至少采集3個(gè)卵巢，連續(xù)取各卵巢組織最大橫截面5片，采用熒光顯微鏡觀察。

1.8 TUNEL分析步驟按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書操作。每組至少采集3個(gè)卵巢，連續(xù)取各卵巢組織最大橫截面5片，采用熒光顯微鏡觀察。

1.9 透射電鏡和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察卵巢切片在2.5%戊二醛4℃下固定24 h以上，用PBS清洗后置于1%的鋨酸溶液固定1.5 h，然后用乙醇和丙酮逐級(jí)脫水后包埋劑包埋，70℃高溫過(guò)夜。使用超微切片機(jī)將包埋好的卵巢組織制作厚度為70～90 nm的切片。切片染色后，于Tecnai G2 Spirit型透射電鏡(TEM)下觀察和拍照。

1.10 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR用TRIzol從雛雞卵巢中提取總RNA。按照HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書操作，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。由生工生物工程公司設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。將cDNA稀釋10倍，Real-time PCR反應(yīng)體系為20 μL。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參，使用比較周期閾值法(2-△△Ct)測(cè)定mRNA的相對(duì)表達(dá)。每組采集3個(gè)卵巢。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息

1.11 Western blot分析卵巢組織用含有1 mmol/L PMSF的RIPA研磨后，按照BCA蛋白檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定總蛋白含量。采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離30 μL的變性蛋白體系，夾心法(0.22 μm;Micro hole)使蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1 h后，與相應(yīng)的一抗結(jié)合，包括兔抗BMPR1B(1∶200)、兔抗PCNA(1∶500)、兔抗CDK2(1∶500)、兔抗細(xì)胞淋巴瘤(1∶500)、兔抗BAX(1∶500)、兔抗Smad1(1∶200)、兔抗Smad4(1∶200)、兔抗Smad5(1∶200)和兔抗CX43(1∶200)。加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠或山羊抗兔IgG在搖床上孵育1 h，用ECL顯影液顯色后采用Quantity One軟件進(jìn)行條帶的灰度分析，以β-actin為內(nèi)參對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析數(shù)據(jù)均采用形式表示，所得數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan多重比較進(jìn)行分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 BMP15和BMPR1B在雛雞卵巢中表達(dá)的變化從出雛第5～9 天(圍繞7 d這一雛雞原始卵泡大量激活的時(shí)間點(diǎn)作為所取材的時(shí)間點(diǎn))的卵巢組織中提取蛋白和RNA。qRT-PCR結(jié)果顯示，第7天的卵巢組織中BMP15以及BMPR1B mRNA的表達(dá)量與第5，6天卵巢組織相比顯著提高(P<0.05)(圖1A,B)。Western blot結(jié)果顯示，雛雞卵巢中BMPR1B蛋白的表達(dá)量在第7天顯著升高(P<0.05)(圖1C,D)。第7天卵巢組織的免疫熒光結(jié)果顯示，BMP15的受體BMPR1B主要表達(dá)在卵母細(xì)胞上(圖1E)。

2.2 BMP15對(duì)體外培養(yǎng)的卵巢細(xì)胞的促增殖作用體外培養(yǎng)第4天雛雞卵巢3 d，BrdU染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMP15 100 μg/L 處理組中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的百分比最高(P<0.01)(圖2A,B)。同時(shí)檢測(cè)100 μg/L 的BMP15對(duì)卵巢中細(xì)胞增殖和凋亡的影響。免疫組化結(jié)果顯示，3種增殖相關(guān)蛋白基本都位于卵巢的皮質(zhì)，PCNA、CDK2和CCND1蛋白在顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞上都有表達(dá)，添加BMP15使3種蛋白染色陽(yáng)性的著色都變得更深(圖2C)。細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白BAX基本都位于卵巢的皮質(zhì)，但是添加BMP15使其著色相對(duì)變淺(圖2F)。Western

A.第5～9天雛雞卵巢BMP15 mRNA的表達(dá)；B.第5～9天雛雞卵巢BMPR1B mRNA的表達(dá)；C,D.在第4～9天雛雞卵巢中BMPR1B蛋白的表達(dá)及灰度分析；E.BMPR1B的免疫熒光。三角形指向卵母細(xì)胞，箭簇指向顆粒細(xì)胞;不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

blot分析結(jié)果表明，體外培養(yǎng)時(shí)添加BMP15可以顯著增加雛雞卵巢中顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的PCNA、CDK2和CCND1蛋白含量(P<0.05)(圖2D,E)，并且顯著減少BAX蛋白的表達(dá)，顯著增加BCL2蛋白的表達(dá)(P<0.05)(圖2G,H)。根據(jù)以上結(jié)果，在體外試驗(yàn)中，選擇100 μg/L的BMP15用于后續(xù)試驗(yàn)。

A.B.BrdU熒光染色及陽(yáng)性細(xì)胞比例,箭鏃表示卵巢皮質(zhì)中具有BrdU(白色)標(biāo)記的顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞；C～H.BMP15對(duì)細(xì)胞增殖和抗凋亡的影響；C.PCNA、CDK2和CCND1免疫組化，箭鏃表示染色的顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞；D，E.100 μg/L BMP15處理后PCNA、CDK2和CCND1的Western blot和灰色分析；F.箭鏃為BAX染色的卵母細(xì)胞；G，H.BAX和BCL2蛋白的Western blot和灰色分析

2.3 BMP15對(duì)雛雞卵巢細(xì)胞的促增殖作用在體試驗(yàn)表明，雛雞注射1 μg/kg的BMP15后，PCNA免疫組化染色陽(yáng)性的著色加深(圖3A)。Western blot分析表明，與對(duì)照組相比，注射1，5 μg/kg的BMP15均可顯著增加PCNA的表達(dá)量(P<0.05)(圖3B，C)。結(jié)合免疫組化和Western blot的結(jié)果，1 μg/kg BMP15處理組顯著提高了顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中PCNA的含量。此外，與對(duì)照組相比，1 μg/kg BMP15處理組PCNA、CDK2和CCND1蛋白的表達(dá)量分別增加了62%，70%和63%(P<0.05)(圖3D，E)。

A.PCNA免疫組化，箭簇表示染色的顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞；B，C.添加BMP15對(duì)PCNA蛋白的Western blot和灰色分析；D，E.1 μg/kg BMP15處理后PCNA、CDK2和CCND1的Western blot和灰色分析

2.4 BMP15對(duì)體外培養(yǎng)雛雞卵巢縫隙連接的影響通過(guò)透射電鏡觀察卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞間的縫隙連接。本試驗(yàn)在BMP15處理后的卵泡超微結(jié)構(gòu)中觀察到了卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞間的縫隙連接(圖4A)，而在對(duì)照組中沒(méi)有觀察到縫隙連接。此外，Western blot的結(jié)果顯示，BMP15處理組與對(duì)照組相比卵巢組織中縫隙連接相關(guān)蛋白CX43的表達(dá)量增加了86.8%(P<0.05)(圖4B，C)。

A.對(duì)照組以及BMP15處理組卵巢組織的超微結(jié)構(gòu),箭鏃表示縫隙連接,O.卵母細(xì)胞，GC.顆粒細(xì)胞；B，C.添加BMP15后，縫隙連接相關(guān)蛋白CX43表達(dá)變化的Western blot結(jié)果和灰色分析

2.5 BMP15在體外促進(jìn)原始卵泡的激活由于BMPR1B的表達(dá)在原始卵泡激活過(guò)程中顯著增加，本試驗(yàn)研究了BMP15對(duì)原始卵泡激活的直接作用。ML347是BMP15受體BMPR1B的抑制劑。在體外試驗(yàn)中，BMP15和ML347單獨(dú)或聯(lián)合處理4日齡雛雞卵巢組織3 d。PCNA免疫熒光和TUNEL的結(jié)果表明，BMP15處理組與對(duì)照組相比，卵巢皮質(zhì)中PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量下降。ML347和BMP15聯(lián)合處理組與BMP15單獨(dú)處理組相比，卵巢皮質(zhì)中PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加(圖5A)。qRT-PCR的結(jié)果顯示，BMP15處理組與對(duì)照組相比，PCNA和CDK2 mRNA的表達(dá)分別增加了2.4倍和2.7倍，凋亡相關(guān)基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)和BAX mRNA的表達(dá)分別降低了47.9%和74.2%(P<0.05)。而ML347和BMP15聯(lián)合處理組與BMP15單獨(dú)處理組相比，PCNA和CDK2 mRNA的表達(dá)量分別降低了97.5% 和94.3%，顯著增加Caspase3和BAX的mRNA表達(dá)量(P<0.05)(圖5B～E)。Western blot結(jié)果表明，ML347和BMP15聯(lián)合處理組與BMP15單獨(dú)處理組相比顯著降低PCNA、CDK2和CCND1蛋白的表達(dá)量，顯著增加BAX蛋白的表達(dá)量(P<0.05)(圖5F，G)。

A.BMP15和ML347單獨(dú)或聯(lián)合處理體外培養(yǎng)的第4天雛雞卵巢3 d，箭簇表示PCNA(紅色)和TUNEL(綠色)的顆粒細(xì)胞；B～E.PCNA、CDK2、Caspase3和BAX mRNA的表達(dá)；F和G.PCNA、CDK2、CCND1和BAX蛋白的Western blot和灰色分析

2.6 BMP15通過(guò)Smad1、Smad5和Smad4信號(hào)通路激活原始卵泡通過(guò)Smad1、Smad5和Smad4信號(hào)通路檢測(cè)BMP15對(duì)原始卵泡的激活。結(jié)果顯示，Smad1、Smad5和Smad4 mRNA在第7天的雛雞卵巢中表達(dá)與第5和6天相比顯著增加(P<0.05)，此時(shí)間點(diǎn)與原始卵泡激活時(shí)間一致(圖6A～C)。體外試驗(yàn)BMP15處理3 d后qRT-PCR結(jié)果顯示，BMP15處理組與對(duì)照組相比,雛雞卵巢中Smad1和Smad5基因表達(dá)量提高1.2倍和1.4倍，Smad4的基因表達(dá)量提高了3.2倍(P<0.05)(圖6D～F)；Western blot結(jié)果表明，BMP15處理組與對(duì)照組相比，顯著增加Smad1、Smad5和Smad4的蛋白表達(dá)量(P<0.05)(圖6G，H)。之后，將BMP15和ML347單獨(dú)或聯(lián)合培養(yǎng)4日齡雛雞卵巢組織3 d，驗(yàn)證BMP15在體外通過(guò)受體BMPR1B激活下游通路Smad1、Smad5和Smad4。Western blot結(jié)果表明，ML347和BMP15聯(lián)合處理組與BMP15單獨(dú)處理組相比降低了Smad1、Smad5和Smad4蛋白的表達(dá)量68.8%，62.9%和83.6%(P<0.05)(圖6I，J)。

A.C.雛雞卵巢中Smad1、Smad5和Smad4 mRNA表達(dá)量隨日齡的變化；D～H.采用Western blot和qRT-PCR檢測(cè)體外BMP15處理后Smad1、Smad5和Smad4 mRNA和蛋白的變化；I，J.BMP15和ML347單獨(dú)或聯(lián)合處理后Smad1、Smad5和Smad4的Western blot和灰色分析

3 討論

家禽卵巢中原始卵泡的激活是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，受多種細(xì)胞因子、信號(hào)通路和激素的精確調(diào)控。BMP15在某些物種中參與細(xì)胞增殖和分化，這一過(guò)程對(duì)原始卵泡的激活至關(guān)重要[19]。然而，BMP15促進(jìn)雛雞原始卵泡激活的機(jī)制尚不清楚。本試驗(yàn)初步確定了體內(nèi)外試驗(yàn)中BMP15處理雛雞卵巢組織的有效濃度。

BMP15通過(guò)兩種不同的受體BMPR1B和BMPRII轉(zhuǎn)導(dǎo)其信號(hào)通路。在家禽卵巢中BMPR1B和BMPRII基因表達(dá)量隨著卵泡的增大而增加，表明BMP15可能在家禽卵泡發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12,14]。雛雞孵化后的第7天，原始卵泡被激活[4]，結(jié)果顯示，BMP15和BMPR1B的基因表達(dá)量以及BMPR1B的蛋白表達(dá)量在此時(shí)間點(diǎn)達(dá)到最高點(diǎn)；說(shuō)明BMP15在雛雞卵巢原始卵泡的激活過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

BMP15促進(jìn)卵巢中卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞之間縫隙連接的形成[20]。本試驗(yàn)中BMP15處理雛雞卵巢后縫隙連接相關(guān)蛋白CX43的表達(dá)量明顯上調(diào)。卵母細(xì)胞的發(fā)育是通過(guò)卵巢中各結(jié)構(gòu)之間相互作用進(jìn)行的?？p隙連接在卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間物質(zhì)信息交換的過(guò)程中起著重要的作用[21]。CX43是縫隙連接中的一種連接蛋白，在卵泡發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[22]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，BMP15通過(guò)增加CX43蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間的物質(zhì)信號(hào)交換，從而促進(jìn)原始卵泡的激活。

此外，有研究表明，BMP15可促進(jìn)卵巢中細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡[23]。原始卵泡的激活與卵巢細(xì)胞的增殖和凋亡密不可分。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，添加BMP15處理增加了卵泡發(fā)育過(guò)程中與細(xì)胞增殖相關(guān)的PCNA蛋白、細(xì)胞周期蛋白CDK2和CCND1的表達(dá)。同時(shí)，添加BMP15處理增加了BCL2的蛋白表達(dá)，降低了BAX的蛋白表達(dá)。此外，與對(duì)照組相比，添加BMP15處理后TUNEL陽(yáng)性標(biāo)記結(jié)果高于對(duì)照組。說(shuō)明添加BMP15處理促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，體外和體內(nèi)試驗(yàn)支持了這些觀點(diǎn)。特異性的受體抑制劑ML347能夠阻止BMP15的效應(yīng)，所以在ML347和BMP15聯(lián)合處理組中檢測(cè)到細(xì)胞增殖蛋白PCNA、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白CCND1和CDK2的表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡蛋白BAX表達(dá)量增加。因此，BMP15能夠通過(guò)調(diào)控雛雞卵巢中細(xì)胞增殖蛋白和細(xì)胞程序性死亡蛋白來(lái)激活原始卵泡。

BMP15通過(guò)刺激下游信號(hào)通路Smad/1/5/8通路來(lái)激活人卵巢中的原始卵泡[17,24]。并且，Smad1和Smad5在小鼠原始生殖細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中起著重要作用[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，雛雞體內(nèi)Smad1、Smad5和Smad4 mRNA表達(dá)的變化在出雛后第7天顯著升高，這與雛雞原始卵泡激活的時(shí)間一致。通過(guò)檢測(cè)阻斷劑ML347阻斷受體BMPR1B后BMP15是否對(duì)雛雞原始卵泡仍具激活作用，確定BMP15是否通過(guò)激活Smad信號(hào)通路來(lái)激活原始卵泡。結(jié)果表明，BMP15通過(guò)激活下游通路Smad1、Smad5和Smad4促進(jìn)原始卵泡的激活，而ML347會(huì)顯著減弱BMP15的這種刺激作用。說(shuō)明在原始卵泡活化過(guò)程中，BMP15通過(guò)受體BMPR1B刺激下游信號(hào)通路Smad1、Smad5和Smad4，促進(jìn)原始卵泡激活。

在雛雞原始卵泡的激活過(guò)程中，BMP15通過(guò)BMPR1B受體激活Smad1、Smad5和Smad4信號(hào)通路從而促進(jìn)卵巢中細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡。此外，BMP15通過(guò)增強(qiáng)卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞之間的縫隙連接促進(jìn)了原始卵泡的激活。這些作用對(duì)于雛雞原始卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育起著至關(guān)重要的作用(圖7)。

圖7 BMP15激活原始卵泡過(guò)程的示意圖