王丙萍，段金凱，高艷偉，馬虎林，蘇日娜，張浩，高維實

010017呼和浩特，內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 腫瘤研究所(王丙萍)，腹部腫瘤外科(高艷偉、馬虎林、蘇日娜、張浩、高維實);010070呼和浩特，內(nèi)蒙古建筑職業(yè)技術(shù)學(xué)院 公共課教學(xué)部(段金凱)

前列腺癌是目前全世界男性中最常見到的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在全球男性中位于第二位，癌癥死因第五位，并且死亡人數(shù)在持續(xù)增加[1-2]。在我國，前列腺癌患者的生存情況和預(yù)后與發(fā)達(dá)國家相比還存在一定的差距[3-5]。

過繼性免疫治療是腫瘤免疫療法的一種，其原理是將人體內(nèi)的抗腫瘤免疫細(xì)胞采集后，經(jīng)過體外培養(yǎng)擴(kuò)增后回輸患者，以增強人體免疫系統(tǒng)，從而達(dá)到抗腫瘤的目的。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer cells，CIK)是經(jīng)過細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)而成的一群異質(zhì)混合型細(xì)胞，以T細(xì)胞為主，其主要效應(yīng)細(xì)胞是天然殺傷T細(xì)胞(natural killer T cells， NKT)，兼具有T淋巴細(xì)胞強大的抗腫瘤活性和NK細(xì)胞的非限制性殺瘤優(yōu)點。NK細(xì)胞(natural killer cells，NK)是大顆粒淋巴細(xì)胞，約占人體外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)的10%左右，大部分存在于人的肝臟、脾臟、外周血以及骨髓中，少部分存在于淋巴結(jié)中[6]。NK細(xì)胞參與天然免疫和適應(yīng)性免疫，是先天免疫系統(tǒng)中最具殺傷性的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，能夠介導(dǎo)強大的抗病毒和抗腫瘤作用[7]。作為人體免疫系統(tǒng)中的第一道防線，NK細(xì)胞能夠直接殺傷病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞,而不需要依賴抗體，也不受主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)限制，屬于非特異性的殺傷作用。

免疫檢查點指的是在免疫細(xì)胞上表達(dá)的一系列分子，它能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的激活，是人體維持免疫穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)控機制。目前研究最清楚的免疫檢查點有細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原 4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4)、程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1，PD-1)及其配體(programmed cell death ligand 1，PD-L1)。PD-1發(fā)揮作用是在免疫應(yīng)答的后期，通過影響干擾素γ(interferon-gamma,IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)以及白細(xì)胞介素2(interleukin-2,IL-2)等細(xì)胞因子的分泌進(jìn)而影響T細(xì)胞的增殖。腫瘤的免疫逃逸機制是一個復(fù)雜的過程，在這個過程中免疫檢查點起到的作用不可忽視，在免疫逃逸過程中腫瘤細(xì)胞的表面通常會過度表達(dá)免疫檢查點分子，使得細(xì)胞毒T細(xì)胞的活性受到抑制，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增值。

本研究擬通過研究CIK細(xì)胞、NK細(xì)胞及PD-1單抗+NK細(xì)胞對3種前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、DU145 、PC3的殺傷效率，鑒定其用于后期治療前列腺癌的可行性,為應(yīng)用細(xì)胞過繼回輸治療前列腺癌的研究及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3、LNCaP、DU145購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所；GT-551培養(yǎng)基為日本TaKaRa公司；VIVOTM15培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、胰酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)為美國Gibco公司；IFN-γ、IL-1α、IL-2、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21、OKT3為美國R&D公司；抗人CD16單克隆抗體為中國北京同立海源生物科技有限公司；PD-1單克隆抗體(nivolumab)為中國大連美侖；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液為中國TBDTM公司；熒光標(biāo)記單克隆抗體：CD3-FITC、CD56-PE、鼠抗人IgG-FITC為美國BD公司；CCK8試劑盒為中國博士德生物公司。

1.2 實驗儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱及生物安全柜(Thermo，美國)；倒置熒光顯微鏡(Leica，德國)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD，美國)高速離心機(Eppendorf，德國)；超凈工作臺(蘇州泰安空氣技術(shù)有限責(zé)任公司，中國)；ELx808吸收光酶標(biāo)儀(Biotec，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 前列腺癌細(xì)胞株的培養(yǎng) 前列腺癌細(xì)胞株的培養(yǎng)液分別為PC3—DMEM-F12，LNCaP—RPMI-1640，DU145—DMEM高糖，F(xiàn)BS濃度均為10%。0.25%胰蛋白酶消化的時間分別是LNCaP、DU145為1 min，PC3為3 min。

1.3.2 外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMCs)分離 Ficoll密度梯度離心法分離PBMCs，收集血漿置于56℃水浴鍋內(nèi)保持30 min，冷卻后離心，轉(zhuǎn)移上清保存于4℃?zhèn)溆?；將白膜層移出，加入PBS吹打清洗，離心棄上清，VIVOTM15培養(yǎng)基重懸PBMCs細(xì)胞，顯微計數(shù)，取樣進(jìn)行流式檢測。

1.3.3 CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增 培養(yǎng)基為GT-551，調(diào)整PBMCs細(xì)胞濃度為2×106個/mL第0 d加入IFN-γ 1 000 U/mL，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第1 d加入100 U/mL的IL-1α，50 μg/mL的CD3單抗(OKT3)，300 U/mL的IL-2。此后每隔2 d加入培養(yǎng)基及300 U/mL的IL-2，調(diào)整細(xì)胞濃度。FITC-CD3和PE-CD56抗體染色，流式細(xì)胞儀鑒定CIK細(xì)胞。

1.3.4 NK細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增 調(diào)整PBMCs細(xì)胞密度為1.5×107個/mL,加入自體血清10%，IL-2 1 000 IU/mL、IL-7 10 ng/mL、IL-15 50 ng/mL、IL-18 10 ng/mL、IL-21 50 ng/mL、OKT3 10 ng/mL和Anti-CD16 10 ng/mL，90% VIVOTM15培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞接種密度≤1.5×107個/mL,密度過大影響NK生長，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2天補液調(diào)節(jié)細(xì)胞的密度為1.0×107個/mL；培養(yǎng)基=90% VIVOTM15培養(yǎng)基+自體血漿10%+IL-2 1 000 IU/mL。14 d后，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，合格后收獲細(xì)胞。

1.3.5 流式細(xì)胞檢測 免疫熒光標(biāo)記法進(jìn)行流式細(xì)胞分析，取免疫細(xì)胞1 mL，PBS洗滌，離心棄液，加入50 μL PBS輕輕懸浮細(xì)胞20 μL CD3-FITC和20 μL CD56-PE，4℃避光保存30 min。PBS洗滌后流式細(xì)胞儀分析檢測，用異硫氰酸標(biāo)記IgG作為陰性對照,根據(jù)流式細(xì)胞分析圖中CD3+CD56+的百分比確定CIK細(xì)胞所占比例以及CD3-CD56+的百分比確定NK細(xì)胞所占比例。

1.3.6 CCK-8法檢測殺傷效率 分別以CIK細(xì)胞、NK細(xì)胞、PD-1單抗+NK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，靶細(xì)胞分別為前列腺癌細(xì)胞株LNCaP、DU145、PC3。將3種靶細(xì)胞以5×103個/孔 的數(shù)量分別接種于96孔板中，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后棄液。PD-1單抗+NK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞的處理方式是每106個NK細(xì)胞加入PD-1單抗6 μg在培養(yǎng)箱中培育2 h。然后按效靶比0.1∶1、0.5∶1、1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1的比例分別加入效應(yīng)細(xì)胞，同時設(shè)置單獨靶細(xì)胞孔和每種比例的單獨效應(yīng)細(xì)胞孔，每個比例3個復(fù)孔。共同培養(yǎng)24 h后，加入CCK8 試劑放于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，孵育3.5 h后用酶標(biāo)儀測定450 nm波長的OD值，以此方法檢測NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，公式如下：殺傷率(%)=[1-(實驗組OD值-單獨效應(yīng)細(xì)胞OD值)/單獨靶細(xì)胞組OD值]×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析，在P<0.05時被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CIK細(xì)胞及NK細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果

健康人外周血分離PBMCs后，分別經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴(kuò)增CIK細(xì)胞及NK細(xì)胞。CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果是第0 d為散落的顆粒狀細(xì)胞，3～4 d后聚集成團(tuán)，出現(xiàn)CIK細(xì)胞集落(圖1A)。培養(yǎng)14 d，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定(圖1B、C)，CD3+細(xì)胞為85.28%±17.67%，CD3+CD56+細(xì)胞為22.02%±2.68%，CD8+CD56+細(xì)胞為23.09%±6.85%，確定為CIK細(xì)胞。NK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果是第0 d為散落的顆粒狀細(xì)胞，3～4 d后聚集成團(tuán)，出現(xiàn)細(xì)胞集落，培養(yǎng)10～4 d后，細(xì)胞重新分散為單個細(xì)胞(圖1D)。經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定CD3-CD56+細(xì)胞(圖1E、F)，外周血中占比較少的NK細(xì)胞，擴(kuò)增到占比83.20%±8.54%以上，細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增倍數(shù)為(251.66±19.05)倍，NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)為(1 940.17±402.22)倍。

圖1 CIK細(xì)胞及NK細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果

2.2 CIK細(xì)胞毒活性的檢測

以CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，靶細(xì)胞分別為前列腺癌細(xì)胞株LNCaP、DU145、PC3，在不同效靶比的情況下(0.1∶1、0.5∶1、1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1)，加入CCK8 試劑，孵育3.5 h后，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長OD值的方法檢測NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性(圖2)。通過公式分別計算不同效靶比下CIK對靶細(xì)胞PC3、LNCaP、DU145的殺傷率。結(jié)果表明(表1)，隨著效靶比的增高，CIK細(xì)胞對靶細(xì)胞PC3、LNCaP、DU145的殺傷率也逐步增高。CIK細(xì)胞對靶細(xì)胞LNCaP在效靶比為20∶1時殺傷率最高(76.34%±4.93%)，與效靶比為1∶1、5∶1、10∶1、15∶1的實驗組相比殺傷效率逐步增高，各實驗組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但與效靶比0.1∶1和0.5∶1實驗組相比差異顯著(P<0.05)；CIK細(xì)胞對靶細(xì)胞DU145的殺傷率在1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1時逐步增高，在20∶1時殺傷率最高(34.59%±3.51%)，各效靶比的殺傷效率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但與其它組相比差異顯著(P<0.05)；CIK細(xì)胞對靶細(xì)胞PC3的殺傷率在5∶1、10∶1、15∶1、20∶1時逐步增高，在20∶1時殺傷率最高(58.72%±8.08%)，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但與其它組相比差異顯著(P<0.05)；CIK細(xì)胞對3種靶細(xì)胞的殺傷率差異極顯著(P<0.01)。CIK細(xì)胞在不同效靶比時對3種靶細(xì)胞的殺傷率結(jié)果表明,CIK效應(yīng)細(xì)胞在效靶比為10∶1、15∶1、20∶1時，殺傷率逐步增高，各效靶比的殺傷效率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但與其它組相比差異顯著(P<0.05)。

圖2 CIK細(xì)胞對靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3的殺傷效率(%)

表1 CIK細(xì)胞對靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3的殺傷效率(%)

2.3 NK細(xì)胞毒活性的檢測

通過公式分別計算不同效靶比下NK細(xì)胞對靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3的殺傷率。結(jié)果表明(表2、圖3)，NK細(xì)胞對靶細(xì)胞LNCaP在效靶比為1∶1時殺傷率最高92.03%±9.95%，與效靶比為0.5∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1的實驗組相比，各實驗組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但與效靶比0.1∶1實驗組相比差異極顯著(P<0.01)；NK細(xì)胞對靶細(xì)胞DU145在效靶比為10∶1時殺傷率最高72.40%±8.30%，與效靶比為5∶1的實驗組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但與其它實驗組相比差異顯著(P<0.05)；NK細(xì)胞對靶細(xì)胞PC3的殺傷率在除了效靶比為0.1∶1、0.5∶1的實驗組外，其余各實驗組的殺傷率均為負(fù)數(shù)，并且各實驗組間差異極顯著(P<0.01)，說明NK細(xì)胞對前列腺癌PC3細(xì)胞株沒有殺傷效果；并且隨著效靶比逐步增高，其負(fù)數(shù)值越大，說明NK細(xì)胞對其有促進(jìn)生長作用。

表2 NK細(xì)胞對靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3的殺傷效率(%)

圖3 NK細(xì)胞對靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3的殺傷效率(%)

2.4 PD-1單抗+NK細(xì)胞毒活性檢測

通過公式分別計算不同效靶比下NK細(xì)胞對靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3的殺傷率。結(jié)果表明(表3、圖4)，PD-1單抗+NK細(xì)胞對靶細(xì)胞LNCaP在效靶比為15:1時殺傷率最高(96.65%±17.89%)，與其它效靶比的實驗組相比，各實驗組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；PD-1單抗+NK細(xì)胞對靶細(xì)胞DU145在效靶比為10∶1時殺傷率最高(69.64%±13.18%)，與效靶比為5∶1、15∶1、20∶1的實驗組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但與其它實驗組相比差異顯著(P<0.05)；PD-1單抗+NK細(xì)胞對靶細(xì)胞PC3的殺傷率在除了效靶比為0.1∶1、0.5∶1的實驗組外，其余各實驗組的殺傷率均為負(fù)數(shù)，并且各實驗組間差異顯著(P<0.05)，說明PD-1單抗+NK細(xì)胞對前列腺癌PC3細(xì)胞株沒有殺傷效果；并且隨著效靶比逐步增高，其負(fù)數(shù)值越大，說明NK細(xì)胞對其有促進(jìn)生長作用。

表3 PD-1單抗+NK細(xì)胞對靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3的殺傷效率(%)

圖4 PD-1單抗+NK細(xì)胞對靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3的殺傷效率(%)

2.5 三種效應(yīng)組對3種靶細(xì)胞最高殺傷效率比較

通過對三種效應(yīng)組殺傷3種靶細(xì)胞最高效率的比較分析(表4、圖5)，結(jié)果表明三種效應(yīng)組對靶細(xì)胞LNCaP的最高殺傷效率之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，對靶細(xì)胞DU145的最高殺傷效率CIK效應(yīng)組與NK、PD-1+NK效應(yīng)組間差異極顯著(P<0.01)，對靶細(xì)胞PC3的最高殺傷效率CIK效應(yīng)組與NK、PD-1+NK效應(yīng)組間差異極顯著(P<0.01)。三種效應(yīng)組對3種靶細(xì)胞最高殺傷效率各組間相比都差異極顯著(P<0.01)。

表4 三種效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞LNCaP、DU145、 PC3的最高殺傷率比較(%)

圖5 三種效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞LNCaP、DU145、 PC3的最高殺傷率比較(%)

3 討 論

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及人口壽命增長，我國前列腺癌的發(fā)病率近年來已出現(xiàn)逐步升高趨勢[8-12]。目前對于前列腺癌的治療手段主要包括手術(shù)治療、內(nèi)分泌治療、放療以及化療。而對于晚期和轉(zhuǎn)移性的前列腺癌患者，雄激素剝奪治療是其主要治療手段，但這種方法破壞了男性正常的內(nèi)分泌環(huán)境，會引起一定的并發(fā)癥，且部分患者并發(fā)癥嚴(yán)重，如果出現(xiàn)疾病進(jìn)展，患者將失去所有現(xiàn)有治療手段對生存期的收益。因此，對于這部分前列腺癌患者，急需開發(fā)出新的治療手段，以提高其生活質(zhì)量、延長生存期。

CIK細(xì)胞是近年細(xì)胞過繼性免疫治療的主要應(yīng)用類型，主要是由于其技術(shù)操作簡便、容易獲得，同時成本相對較低，能夠降低廣大癌癥患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，使其易于接受；由于CIK細(xì)胞是異質(zhì)混合型細(xì)胞，其CD3+CD56+效應(yīng)細(xì)胞純度有限[13-14]，對于治療時易產(chǎn)生的嚴(yán)重副反應(yīng)有減輕作用，同時還可以彌補晚期腫瘤患者免疫低下導(dǎo)致的自身免疫細(xì)胞弱化的缺點，降低移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)發(fā)生的風(fēng)險[15-16]。本研究結(jié)果顯示，CIK細(xì)胞對不同前列腺癌細(xì)胞系的殺傷效率差異極顯著(P<0.01)，說明CIK細(xì)胞過繼性回輸治療前列腺癌的效果可能與患者所患前列腺癌類型相關(guān)。

NK細(xì)胞是除T細(xì)胞之外的機體抗腫瘤的另一重要利器，其本身具有廣譜抗腫瘤的作用，同時還具有強大的間接增強T細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用，是T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤功能的基礎(chǔ)[17]。有研究表明，NK細(xì)胞受損和細(xì)胞數(shù)量的減少，與各類腫瘤的進(jìn)展都具有相關(guān)性，NK細(xì)胞過繼性回輸在晚期非小細(xì)胞肺癌的治療中取得了令人滿意的效果[18]。與T細(xì)胞相比，NK細(xì)胞的過繼性回輸具有耐受性良好，神經(jīng)毒性、細(xì)胞因子釋放綜合征和GVHD等嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生率大大降低；同種異體NK細(xì)胞的回輸還能避免或降低殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體介導(dǎo)的抑制性信號，從而發(fā)揮更好的抗腫瘤作用[19-21]。本研究結(jié)果顯示效應(yīng)細(xì)胞NK對3種靶細(xì)胞LNCaP、DU145 、PC3的殺傷率差異極顯著(P<0.01)；NK細(xì)胞對LNCaP的殺傷效率大于對DU145的殺傷效率；對于PC3沒有殺傷作用，反而促進(jìn)其生長。筆者通過對以往研究資料的梳理，發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)特性方面[22]，PC3與DU145均為低分化、雄激素非依賴的前列腺癌細(xì)胞，均具有轉(zhuǎn)移潛能且缺乏內(nèi)源性的雄激素受體的表達(dá)，均同時表達(dá)細(xì)胞生長因子CK5和CK8/18；而PC3與LNCaP均表現(xiàn)為上皮細(xì)胞特性、高表達(dá)E-cadherin、不表達(dá)Vimentin。因此，除PC3細(xì)胞系不表達(dá)野生型P53蛋白，而DU145和LNCaP細(xì)胞均可表達(dá)野生型P53蛋白外，并沒有發(fā)現(xiàn)PC3細(xì)胞系與另外兩株前列腺癌細(xì)胞系的不同之處。然而，P53是人體的抑癌基因之一，其突變會導(dǎo)致原有抑癌功能的喪失，同時獲得新的致癌功能；有研究證明表達(dá)野生型P53的腫瘤細(xì)胞對放、化療的敏感性強于不表達(dá)野生型P53的腫瘤細(xì)胞[23-24]。這說明本研究中“NK細(xì)胞促進(jìn)PC3細(xì)胞系生長”的結(jié)果，可能是由PC3細(xì)胞系不表達(dá)野生型P53蛋白引起的；也可能是由PC3細(xì)胞系的特殊性導(dǎo)致的，而這種“特殊性”在目前的研究資料中并沒有呈現(xiàn)出來，因此需要后續(xù)進(jìn)行深入研究探索其作用機制。本研究的結(jié)果為腫瘤免疫逃逸的研究提出了可能作為目標(biāo)的研究細(xì)胞以及研究方向。

免疫檢查點抑制劑的應(yīng)用為腫瘤患者的治療帶來了新的希望，其作用機制是阻斷免疫檢查點與其受體的結(jié)合，從而解除了腫瘤細(xì)胞對T細(xì)胞增殖的抑制作用，使得T細(xì)胞的抗腫瘤免疫得以激活。目前，關(guān)于PD-1/PD-L抑制劑的應(yīng)用在腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、膀胱癌、肺癌、霍奇金淋巴瘤和結(jié)直腸癌的治療中取得了十分重大的突破，被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)可以應(yīng)用于臨床治療[25-30]。

研究表明NK細(xì)胞也表達(dá)PD-1分子，在卵巢癌患者中有一個高表達(dá)PD-1的NK細(xì)胞亞群，其抗腫瘤能力及增殖能力明顯受到了抑制，當(dāng)使用PD-1抑制劑時，可以部分恢復(fù)該NK細(xì)胞亞群的功能[31]。在肝癌、食道癌、胃癌及結(jié)直腸癌患者的腫瘤浸潤NK細(xì)胞及外周血NK細(xì)胞上PD-1表達(dá)增高，并提示與患者的不良預(yù)后相關(guān)；通過阻斷PD-1/PD-L1信號的方法可以使NK細(xì)胞的脫顆粒水平和細(xì)胞因子水平顯著增加，同時能夠抑制NK細(xì)胞的凋亡[32]。在霍奇金淋巴瘤中，PD-1在CD3-CD56hiNK細(xì)胞上的表達(dá)明顯升高，通過研究發(fā)現(xiàn)其與PD-L1+腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的相互作用，介導(dǎo)了腫瘤的免疫逃逸[33]。在多種小鼠腫瘤模型中都發(fā)現(xiàn)了阻斷PD-1和PD-L1信號可誘導(dǎo)強烈的NK細(xì)胞反應(yīng)，并且證明這種反應(yīng)是PD-1抑制劑發(fā)揮治療效果所必須的[34]。有研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞可以分泌FLT3LG細(xì)胞因子，其作用是富集刺激性樹突狀細(xì)胞(stimulatory dendritic cells,SDCs)于腫瘤內(nèi)，而SDCs可以激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞并促進(jìn)其抗腫瘤免疫反應(yīng)，因此NK細(xì)胞可以促進(jìn)患者對PD-1抑制劑治療的反應(yīng)性。還有研究表明，通過IFN-γ等細(xì)胞因子預(yù)先激活腫瘤微環(huán)境中的STAT1/NK細(xì)胞軸，可以增加腫瘤對免疫檢查點抑制劑療法的敏感性[35]。免疫檢查點抑制劑與NK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用，在治療白血病和非小細(xì)胞肺癌患者時是安全、有效且具有生存益處的[36-37]。以上所有研究都說明，NK細(xì)胞在PD-1信號通路阻斷療法中發(fā)揮著十分重要的作用。然而本研究結(jié)果顯示，PD-1單抗與NK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用對3種前列腺癌細(xì)胞系的殺傷效率與單獨NK細(xì)胞相比，各組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示PD-1單抗與NK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用并不能提高NK細(xì)胞體外殺傷前列腺癌細(xì)胞系的效率。本研究結(jié)果表明PD-1單抗可能不適用于前列腺癌的治療，并且NK細(xì)胞過繼性回輸聯(lián)合PD-1抑制劑的治療策略可能并不適用于前列腺癌治療；但是這個研究結(jié)論的確定還有待動物實驗的進(jìn)一步驗證。

本研究通過對三種效應(yīng)組殺傷3種靶細(xì)胞最高效率的比較分析，結(jié)果表明NK細(xì)胞與PD-1單抗+NK細(xì)胞效應(yīng)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義且趨勢相同，除對靶細(xì)胞LNCaP的最高殺傷效率之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，對靶細(xì)胞DU145和PC3的最高殺傷效率與CIK細(xì)胞效應(yīng)組之間差異極顯著。NK細(xì)胞對于靶細(xì)胞LNCaP和DU145細(xì)胞系的殺傷效率要高于CIK細(xì)胞對其殺傷效率；而相較于“NK細(xì)胞促進(jìn)PC3細(xì)胞系生長”的結(jié)果，CIK細(xì)胞對PC3細(xì)胞系的殺傷效率最高能達(dá)到58.72%±8.08%。這說明在未能明確“NK細(xì)胞促進(jìn)PC3細(xì)胞系生長”機制的前提下，CIK細(xì)胞可能更適合作為前列腺癌治療的免疫細(xì)胞；或者以NK細(xì)胞作為前列腺癌治療的免疫細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)不起作用或疾病進(jìn)展，則應(yīng)當(dāng)停止NK細(xì)胞治療或改為CIK細(xì)胞治療。PC3細(xì)胞、DU145細(xì)胞是激素抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer，CRPC)，而LNCaP細(xì)胞是激素敏感性前列腺癌(metastatic hormone-sensitive prostate cancerm，mHSPC)，為什么NK細(xì)胞、PD-1+NK對LNCaP的殺傷效果好，而對PC3細(xì)胞反而無殺傷力？甚至促進(jìn)其生長？可能的機制是這種治療對mHSPC效果好而對于CRPC效果差甚至起到反作用。因此，NK細(xì)胞、PD-1+NK細(xì)胞過繼免疫治療對于早期的激素敏感性前列腺癌可能有一定的治療作用,但具體效果仍需進(jìn)一步研究證實。

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