張衡，盧從華，趙茜，羅諾，李鑫，王任源，趙呈龍，王治國，祝夢曉，封明霞，何勇，李力

400042 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬陸軍特色醫(yī)學(xué)中心 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

肺癌的發(fā)病率和死亡率均位居我國惡性腫瘤首位，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌總數(shù)的85%[1-2]。大多數(shù)NSCLC患者在確診時已處于晚期階段，喪失手術(shù)機(jī)會[3]。近年來，分子靶向治療和免疫治療顯著改善了NSCLC患者的預(yù)后[4]。對于驅(qū)動基因陰性的晚期NSCLC患者，以程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein-1，PD-1)/程序性死亡配體1(programmed cell death ligand-1，PD-L1)抑制劑為代表的免疫治療顯著改善了患者生存，已成為一線標(biāo)準(zhǔn)治療方案[5]。然而，并非所有NSCLC患者都能對PD-1/PD-L1抑制劑治療產(chǎn)生良好應(yīng)答，甚至可能出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。所以，發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1抑制劑療效預(yù)測因子，闡明其治療抵抗機(jī)制，對于擴(kuò)大免疫治療獲益人群、增強(qiáng)免疫治療療效至關(guān)重要[6]。

目前，腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)已被廣泛用于預(yù)測PD-1/PD-L1抑制劑治療的療效。對于PD-L1表達(dá)強(qiáng)陽性(≥50%)的患者，可一線單藥免疫治療[7]。除此之外，腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutation burden,TMB)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability,MSI)對免疫治療療效也有一定的預(yù)測作用[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤免疫微環(huán)境(tumor immune microenvironment，TIME)在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的調(diào)控中起著重要作用。TIME包括各種微環(huán)境中的免疫細(xì)胞(髓樣細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞等)以及細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子等可溶性免疫因子[9]。細(xì)胞因子在募集免疫細(xì)胞到腫瘤微環(huán)境過程中起重要調(diào)節(jié)作用[10],其中白細(xì)胞介素-6(interleukin 6,IL-6)是TIME中重要的細(xì)胞因子，可激活腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤免疫細(xì)胞中的JAK/STAT3信號，促進(jìn)免疫抑制性微環(huán)境形成并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)[11-12]。近期研究報(bào)道，IL-6可能為PD-1抑制劑治療黑色素瘤的療效預(yù)測標(biāo)志物[13]，但其在NSCLC免疫治療中的作用和機(jī)制尚未完全闡明。

因此，本回顧性研究擬探索IL-6與NSCLC患者PD-1抑制劑療效的相關(guān)性，同時通過一系列相關(guān)體外研究，初步探討IL-6導(dǎo)致PD-1抑制劑抵抗的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究設(shè)計(jì)和對象

篩選2017年1月1日至2021年10月31日期間，在陸軍特色醫(yī)學(xué)中心(即大坪醫(yī)院)確診為NSCLC且接受PD-1抑制劑治療的患者，納入標(biāo)準(zhǔn)如下：1)病理證實(shí)為Ⅲ/Ⅳ期NSCLC患者，無法接受手術(shù)；2)接受PD-1抑制劑單藥或聯(lián)合治療，治療線數(shù)不限，治療周期≥2個；3)免疫治療前1周之內(nèi)檢測外周血IL-6；4)隨訪時間≥6個月。主要排除標(biāo)準(zhǔn)：1)基線合并細(xì)菌感染；2)6個月之內(nèi)失訪；3)資料不全，無法評估療效。IL-6的數(shù)據(jù)自病歷系統(tǒng)采集，IL-6檢測由本中心檢驗(yàn)科使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)完成。本研究經(jīng)陸軍特色醫(yī)學(xué)中心倫理委員會審查并批準(zhǔn)(編號：2022132)。數(shù)據(jù)隨訪截止日期為2022年4月12日。

1.2 療效評估

依據(jù)實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1版(RECIST 1.1)，每位患者的短期療效分為完全緩解(complete response，CR)、部分緩解(partial response，PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)或疾病進(jìn)展(progressive disease，PD)。無進(jìn)展生存期 (progression-free survival，PFS)被定義為從開始治療到臨床醫(yī)生評估影像學(xué)進(jìn)展、死亡或末次隨訪的時間。總生存期 (overall survival，OS)被定義為第一次接受治療的日期至因任何原因死亡的日期，或最后一次隨訪的日期。持續(xù)臨床獲益(durable clinical benefit，DCB)定義為CR、PR或SD≥6個月，無持續(xù)獲益(non-durable clinical benefit，NDB)定義為SD<6個月或PD[14]?？陀^緩解率(objective response rate，ORR)定義為完全緩解加上部分緩解之和(CR+PR)占總研究人群的比例。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和試劑

人肺癌細(xì)胞系H1299和A549細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)。人外周血T細(xì)胞自上海賽笠生物科技有限公司(中國上海)采購。腫瘤細(xì)胞均采用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640(Hyclone)培養(yǎng)基，在37℃及5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。重組人IL-6蛋白和白細(xì)胞介素2(interleukin 2,IL-2)蛋白均購自PeproTech(美國新澤西州)，抗STING、TBK1、p-TBK1、STAT3、p-STAT3、AKT、p-AKT和β-tubulin均從Cell Signaling Technology(美國馬薩諸塞州)采購。

1.4 T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷試驗(yàn)

活化T細(xì)胞步驟參考先前研究[15]，簡述如下:人外周血T細(xì)胞通過在含有IL-2(10 ng/mL)和ImmunoCult human CD3/CD28/CD2 T細(xì)胞激活劑(25 μL/mL)的ImmunoCult-XF T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基(均購自STEMCELL Technologies，加拿大溫哥華)中培養(yǎng)1周而活化。所有T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷試驗(yàn)都在含有抗CD3抗體(100 ng/mL；Thermo Fisher Scientific，美國馬薩諸塞州)和IL-2(10 ng/mL)的DMEM/F12培養(yǎng)基中進(jìn)行。

1.5 CCK-8檢測細(xì)胞存活率

細(xì)胞存活率通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8；MedChemExpress，美國新澤西州)檢測。將長勢良好且處于對數(shù)期的各肺癌細(xì)胞株接種于96孔板內(nèi)，接種量為每孔3 000個細(xì)胞，設(shè)置3個復(fù)孔，按每孔100 μL加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。第二天，以不進(jìn)行任何處理的細(xì)胞為對照組，以含T細(xì)胞及T細(xì)胞和IL-6處理的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，更新DMEM/F12培養(yǎng)基并再培養(yǎng)48 h。然后更新培養(yǎng)基，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，設(shè)置只有培養(yǎng)基和CCK-8溶液的孔作為調(diào)零孔。輕輕搖晃混勻后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm下吸光度值并進(jìn)行記錄。

1.6 Ki67染色

細(xì)胞增殖通過Ki67標(biāo)記(Boster，中國武漢) 檢測。取長勢良好的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)。在6孔板中放入無菌蓋玻片，于蓋玻片上滴加細(xì)胞懸液，每孔接種細(xì)胞數(shù)30萬，每孔加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基2 mL培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁，于次日按細(xì)胞存活率測定方案分對照組、T細(xì)胞處理組及T細(xì)胞和IL-6處理組，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。于顯微鏡下初步觀察，去除培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)洗3次后用4%多聚甲醛固定20 min。再次用PBS清洗3遍，每次2～3 min，然后加入0.25% TritonX-100透化處理20 min。PBS洗3次后用10%山羊血清封閉1 h，然后加一抗Ki67(1∶100稀釋)于4℃孵育過夜。經(jīng)PBS 3次清洗后加熒光二抗CY3(1∶100稀釋)及4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，1∶500)孵育1 h。最后經(jīng)PBS清洗后在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)

蛋白質(zhì)印跡步驟參考先前研究[16]。細(xì)胞接種于6孔板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理48 h，置于顯微鏡下觀察后去除培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，于冰上操作，加入RIPA 裂解液(添加了1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑)裂解30 min。經(jīng)震蕩超聲充分裂解后于4 ℃下12 000 g離心20 min，取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。按說明分別配制分離膠和濃縮膠，待膠體凝固，根據(jù)測定的蛋白濃度確定上樣量，配制上樣體系。將樣品于100 ℃熱變性5 min，110 V電泳90 min。然后以90 V電轉(zhuǎn)80 min將蛋白移至PVDF膜上。之后，在室溫下用TBST配置的5%脫脂牛奶封閉1 h。根據(jù)目標(biāo)蛋白相對分子質(zhì)量切膜并與相應(yīng)抗體(1∶1 000)在4 ℃下孵育過夜。然后用TBST洗膜3次，每次5 min，分別加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h。最后，經(jīng)TBST洗膜3次，每次5 min后，用ChemiDoc Touch凝膠成像系統(tǒng)對膜進(jìn)行顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料首先采用Shapiro-Wilk test進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)性分布數(shù)值描述采用中位數(shù)進(jìn)行描述，組間比較采用Mann-Whitney U test。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)和百分比進(jìn)行描述，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher′s精確檢驗(yàn)?；€IL-6水平根據(jù)臨床界值確定為高(≥7 pg/mL，n=20)或低(<7 pg/mL，n=10)兩組， Kaplan-Meier分析兩組PFS。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者特征

本研究共篩選出160例確診為晚期NSCLC且接受PD-1抑制劑治療的患者。根據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，130例被排除，剩余30例患者納入研究。其中25例診斷為腺癌，5例診斷為鱗癌。共有22例的患者有吸煙史。28例的患者接受一線免疫治療，25例的患者接受了免疫聯(lián)合治療。研究人群中位隨訪時間為12.0個月(IQR：9.0～17.3個月)，中位PFS為11.0個月(IQR：7.0～15.3個月)。在隨訪期間，30名患者中有83.3% (n=25)通過PD-1抑制劑治療達(dá)到DCB，16.7%(n=5)達(dá)到NDB。另外，6.7%(n=2)的患者達(dá)到CR，43.3%(n=13)的患者達(dá)到PR，23.3%(n=7)的患者達(dá)到SD，26.7%(n=8)的患者療效為PD(表1)。

表1 入組患者的臨床特征

2.2 基線外周血IL-6水平與NSCLC患者PD-1抑制劑治療療效負(fù)相關(guān)

為了探究基線外周血IL-6水平與NSCLC患者PD-1抑制劑治療療效的相關(guān)性，我們首先對比了DCB和NDB患者的基線外周血IL-6水平，結(jié)果顯示DCB組IL-6水平顯著低于NDB組(中位數(shù)4.60 pg/mLvs12.88 pg/mL，P=0.002)(圖1A)。根據(jù)基線IL-6水平臨床參考閾值分為高(≥7 pg/mL，n=20)或低(<7 pg/mL，n=10)兩組。如圖1B所示，低IL-6組的DCB率顯著高于高IL-6組(100%vs50%,P=0.002)。另外，與高IL-6組相比，低IL-6組ORR更高(65%vs20%，P=0.025)。其中，高IL-6組60%的患者療效為PD(圖1C)。接下來，我們進(jìn)一步分析了基線IL-6水平與PFS的相關(guān)性。結(jié)果顯示，基線外周血IL-6水平高的患者的中位PFS為 8.00 個月(IQR：3.8～9.5個月)，而基線外周血IL-6水平低的患者未達(dá)到(未達(dá)到vs8個月，P=0.007)(圖1D)。

圖1 IL-6與PD-1抑制劑療效的相關(guān)性

2.3 IL-6減弱T細(xì)胞介導(dǎo)的對肺癌細(xì)胞H1299和A549細(xì)胞的殺傷作用

接下來，我們通過T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷試驗(yàn)觀察IL-6對T細(xì)胞殺傷效應(yīng)的影響。Ki67實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與對照組相比，活化T細(xì)胞能顯著降低Ki67陽性細(xì)胞的百分比，而外加IL-6后Ki67陽性細(xì)胞百分比顯著增高，提示在IL-6存在的情況下，T細(xì)胞不能有效抑制H1299和A549肺癌細(xì)胞的增殖(圖2A)。與之類似的是，CCK-8實(shí)驗(yàn)提示，活化的T細(xì)胞可顯著降低H1299和A549肺癌細(xì)胞的存活率，而外加IL-6后，腫瘤細(xì)胞存活率顯著升高，提示IL-6顯著抑制活化T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷(圖2B)。這些結(jié)果表明IL-6 對T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷起抑制作用。

圖2 IL-6抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的對肺癌細(xì)胞的殺傷作用

2.4 IL-6活化STAT3-AKT并抑制STING-TBK1通路

為了初步闡明IL-6影響免疫治療療效的機(jī)制，我們采用Western blot檢測了關(guān)鍵信號通路的活性。既往研究及我們近期的研究均提示,STING的活化在抗腫瘤免疫治療中起關(guān)鍵作用[15，17]。Western blot結(jié)果顯示，相較于單獨(dú)T細(xì)胞處理，外加IL-6處理可顯著上調(diào)p-STAT3和p-AKT的表達(dá)，同時降低了STING和p-TBK1的水平(圖3)。以上結(jié)果提示，IL-6可能通過活化STAT3-AKT通路抑制STING表達(dá)并減弱TBK1的活化，進(jìn)而引起免疫治療抵抗。

圖3 Western blot檢測IL-6處理對H1299和A549細(xì)胞中STAT3/AKT和STING/TBK1通路的影響

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，接受PD-1抑制劑治療的晚期 NSCLC患者治療前IL-6水平與治療療效相關(guān)。IL-6可能通過活化STAT3-AKT通路抑制STING表達(dá)并減弱TBK1的活化，進(jìn)而抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，導(dǎo)致免疫治療抵抗。

IL-6是一種促炎細(xì)胞因子，是癌癥和多種炎癥性疾病的核心參與者[18]，已被證實(shí)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[19-21]。研究發(fā)現(xiàn)，在接受PD-1抑制劑治療的黑色素瘤患者中，較高的IL-6水平與較短的OS有關(guān)[13]。另有研究表明在NSCLC接受PD-1抑劑制治療過程中，IL-6水平下降與PFS較長有關(guān)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，接受PD-1抑制劑治療的NSCLC患者治療前低IL-6水平與臨床獲益相關(guān)，與既往研究同樣表明IL-6的水平可能作為NSCLC患者免疫治療的療效預(yù)測因子。目前，預(yù)測肺癌免疫治療療效的生物標(biāo)志物主要是PD-L1表達(dá)和TMB[23]。但是PD-L1表達(dá)和TMB需要對腫瘤組織進(jìn)行檢測，存在異質(zhì)性且標(biāo)本不易獲得[24]，而外周血IL-6檢測方便易行，在預(yù)測免疫治療療效方面有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究TMB、PD-L1表達(dá)的檢測病例少，未能進(jìn)一步深入進(jìn)行IL-6與TMB一致性檢驗(yàn)，需要擴(kuò)大樣本量來驗(yàn)證PD-1抑制劑治療療效與PD-L1的關(guān)系，以及進(jìn)一步探索IL-6預(yù)測PD-1抑制劑治療療效與PD-L1預(yù)測療效的效能是否具有一致性。

IL-6導(dǎo)致免疫治療抵抗的可能機(jī)制主要有， IL-6增加樹狀突細(xì)胞的凋亡，從而減少CD8+和CD4+T細(xì)胞激活和分化[25]；另IL-6活化JAK/STAT3通路促進(jìn)腫瘤增殖和細(xì)胞代謝[26]。既往研究發(fā)現(xiàn)STAT3的活化可抑制STING，而STING的活化對抗腫瘤免疫治療起關(guān)鍵作用[27-28]。近期我們同樣發(fā)現(xiàn)STING的活化是免疫治療當(dāng)中很重要的一個關(guān)鍵分子[15]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)IL-6可能通過活化STAT3-AKT通路抑制STING的表達(dá)，進(jìn)而減弱p-TBK1的活化，提示這可能是IL-6引起NSCLC患者PD-1抑制劑治療抵抗的潛在機(jī)制。近年來，抗IL-6受體抗體托珠單抗(tocilizumab)[29]和抗IL-6抗體司妥昔單抗(silkuximab)已經(jīng)在某些腫瘤的治療方面顯示出潛在的臨床獲益[30]，但其能否克服IL-6所致的PD-1抑制劑治療抵抗、增強(qiáng)免疫治療療效，有待進(jìn)一步研究。

本研究有幾個局限性。首先，本研究為回顧性研究，且納入病例數(shù)偏少，可能存在選擇偏倚，限制了結(jié)果的普遍性；其次，由于病例數(shù)限制，本研究僅收集了基線IL-6數(shù)據(jù)，無動態(tài)IL-6水平變化；第三，本研究采集的為外周血IL-6，這與組織IL-6水平可能存在差異，需要進(jìn)一步的研究來評估兩者關(guān)聯(lián)。

綜上所述，IL-6可能通過抑制STING-TBK1通路，減弱T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，進(jìn)而導(dǎo)致NSCLC患者PD-1抑制劑治療抵抗。本研究的發(fā)現(xiàn)為擴(kuò)大免疫治療獲益人群、增強(qiáng)免疫治療療效提供了參考。

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